不同年齡段川金絲猴腸道菌群結(jié)構(gòu)差異分析

簡(jiǎn) 平 王 強(qiáng) 王 劍 牛李麗 祝 輝 曾 燕 倪學(xué)勤，3 曾 東，3*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物微生態(tài)研究中心，雅安 625014;2.成都動(dòng)物園，成都 610080;3.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 652014)

腸道菌群是寄居在機(jī)體腸道的微生物群，數(shù)量龐大，種類繁多，與機(jī)體的各項(xiàng)生理功能密切相關(guān)，直接參與宿主的食物消化、營(yíng)養(yǎng)吸收、能量代謝、免疫應(yīng)答等諸多生理活動(dòng)［1－3］。自機(jī)體出生時(shí)腸道菌群便開始形成，隨宿主生長(zhǎng)發(fā)育，胃腸道生理變化，腸道菌群群落結(jié)構(gòu)不斷動(dòng)態(tài)發(fā)展，通過大量研究證實(shí)，宿主的年齡是決定腸道菌群組成的一個(gè)重要因素［4］。目前，研究川金絲猴腸道菌群結(jié)構(gòu)的報(bào)道較少，尤其是針對(duì)不同年齡段川金絲猴的研究更是未見報(bào)道。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的革新，研究人員對(duì)于腸道菌群的研究越來越深入，對(duì)腸道菌群的研究水平不斷提高［5］，推動(dòng)了動(dòng)物微生態(tài)學(xué)研究的發(fā)展。分子生物學(xué)技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的缺陷，為研究腸道菌群多樣性開辟了新的途徑［6－9］。分子生物學(xué)以腸道細(xì)菌DNA為研究對(duì)象，通過分析其種類和相對(duì)數(shù)量更能全面真實(shí)反映腸道菌群的多樣性。川金絲猴是我國(guó)特有的野生動(dòng)物，為國(guó)家Ⅰ級(jí)保護(hù)動(dòng)物，本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)－變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)和熒光定量PCR技術(shù)研究不同年齡段川金絲猴腸道菌群組成，分析其腸道菌群多樣性差異，探討伴隨年齡變化川金絲猴腸道菌群的動(dòng)態(tài)發(fā)展情況，為其生存帶來福利。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

川金絲猴來于四川省成都市成都動(dòng)物園，參考文獻(xiàn)［10］將9只川金絲猴劃分為幼年(＜2歲，n=3)、成年(4～7歲，n=3)、老年(＞8歲，n=3)3個(gè)年齡階段進(jìn)行研究，于2013年12月采集每個(gè)年齡段川金絲猴糞樣各3份。所有糞樣采集時(shí)爭(zhēng)取在排泄后20 min內(nèi)完成，冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室后，－20℃冷凍保存。

1.2 主要儀器

Dcode Universial Detection System PCR-DGGE電泳儀，Bio-Rad公司;GS800 Calibrated Densitometer凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司;HZS-H水浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;SIGMA1－14小型高速離心機(jī)，Applied Biosystems公司;CFX－96實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀，Bio-Rad公司;Thermo Scientific BioMate 3S分光光度儀，賽默飛世爾科技公司。

1.3 主要試劑

1.4 細(xì)菌總DNA的提取

1.5 PCR-DGGE指紋圖譜分析不同年齡段川金絲猴腸道菌群多樣性

1.5.1 總DNA 16S rDNA V3區(qū) PCR 擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)［11］，根據(jù)細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)片段(339～539)設(shè)計(jì)1對(duì)引物:上游引物(帶GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)):5’－CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCC TACGGGAGGCAGCAGT－3’;下游引物:5’－GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC －3’。PCR 反應(yīng)體系(25μL):上、下游引物(10 pmoL/μL)各1.0 μL，2 × Taq MasterMix 12 μL，DNA 模板 1.0～2.0 μL，ddH2O 補(bǔ)至 25 μL，并設(shè)置陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大小和濃度。

1.5.2 PCR-DGGE技術(shù)分析不同年齡段川金絲猴腸道菌群多樣性

參照文獻(xiàn)［12］進(jìn)行PCR-DGGE凝膠電泳，凝膠梯度為35%～65%，變性方向與電泳方向一致。100%變性溶液含7 moL/L尿素和40%去離子甲酰胺。使用1×TAE緩沖液，100 V 60℃電泳16～18 h。硝酸銀染色后，通過凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

1.6 熒光定量PCR技術(shù)分析不同年齡段川金絲猴腸道菌群結(jié)構(gòu)

1.6.1 特異性片段的PCR擴(kuò)增

［13－14］，對(duì)川金絲猴糞樣中真細(xì)菌(eubacteria)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus spp.)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium spp.)的16SrDNA基因特異性引物(表1)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25μL):2×Taq MasterMix 12.5 μL，上、下 游 引 物(10 pmoL/μL)各 1 μL，模 板 2 μL，ddH2O 8.5μL。PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性15 s，退火溫度(Tm)下退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán);最后，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.6.2 PCR 產(chǎn)物克隆

采用瓊脂糖膠回收試劑盒割膠純化回收PCR產(chǎn)物。按試劑盒方法用pMD18－T載體連接PCR純化產(chǎn)物，以大腸桿菌DH5α制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，在氨芐青霉素平板上進(jìn)行藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選陽性克隆。

1.6.3 相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建

按質(zhì)粒DNA提取試劑盒純化上述陽性克隆重組質(zhì)粒DNA，然后用核酸濃度儀測(cè)定重組質(zhì)粒DNA的光密度(OD)值。按如下公式換算成拷貝數(shù):

表1 目標(biāo)菌群引物序列Table 1 Primer sequences of target flora

將得到己知拷貝數(shù)的陽性模板用ddH2O 10倍系列梯度稀釋，直至每微升溶液的拷貝數(shù)小于1(100～10－10)。將每個(gè)濃度梯度的陽性模板在優(yōu)化后的定量PCR條件下進(jìn)行測(cè)定，獲得相應(yīng)的Ct值，以各濃度梯度起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)值為X軸，相應(yīng)的Ct值為Y軸作回歸曲線，得出定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.4 熒光定量PCR檢測(cè)樣品菌群含量

采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒對(duì)DNA樣品和上述重組質(zhì)粒DNA構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品進(jìn)行絕對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)。熒光定量PCR反應(yīng)體系(25μL):SYBR Premix Ex TaqTMⅡ12.5 μL，上、下引物各 1 μL，模板 2 μL，ddH2O 8.5μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性15 s，Tm 下退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，35 個(gè)循環(huán)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用凝膠定量軟件 Quantity One v4.62對(duì)PCR-DGGE指紋圖譜分析，采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，并計(jì)算生物多樣性指數(shù)。對(duì)PCRDGGE指紋圖譜的條帶進(jìn)行二進(jìn)制缺失換算，運(yùn)用SAS 9.1軟件進(jìn)行主成分分析，得出熒光定量數(shù)據(jù)換算值，運(yùn)用SPSS20.0進(jìn)行方差分析。生物多樣性指數(shù)計(jì)算公式為:

式中:H為Shannon指數(shù);Pi為樣品中單一條帶的強(qiáng)度在該樣品所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率;E為樣品均勻度;Hmax為最大的物種多樣性指數(shù);S為某個(gè)樣品中所有條帶數(shù)目總和，即豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-DGGE技術(shù)分析不同年齡段川金絲猴腸道菌群多樣性差異

采用UPGMA法對(duì)不同年齡段川金絲猴樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖1。PCR-DGGE指紋圖譜中電泳條帶亮度反映了菌群的優(yōu)勢(shì)狀況，條帶數(shù)量和位置的復(fù)雜性代表了每個(gè)樣品所包含菌群的多樣性。不同年齡段的川金絲猴明顯區(qū)分，老年與幼年分別聚為一簇。每個(gè)節(jié)點(diǎn)的數(shù)字為相似度，成年組內(nèi)相似度較高，最高為0.72，最低為0.41;幼年最高為 0.64，最低為 0.54;老年最高為0.49，最低為0.41。組間成年與幼年的相似度較高，為0.41，老年與兩者的相似度較低，為 0.33。成年與幼年樣品的明亮條帶較多，兩者之間條帶數(shù)量差異不明顯，但其所在位置有明顯的區(qū)別，成年樣品的條帶多趨于中段，幼年樣品則多趨于上段;老年樣品的明亮條帶則較少，說明成年與幼年川金絲猴優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)老年比較豐富。

2.2 不同年齡段川金絲猴腸道菌群生物多樣性比較

將PCR-DGGE指紋圖譜中條帶的數(shù)量與強(qiáng)弱轉(zhuǎn)化為Shannon指數(shù)、豐富度、均勻度，并采用單因素方差分析法比較不同年齡段川金絲猴腸道菌群生物多樣性指數(shù)，結(jié)果見表2。Shannon指數(shù)與豐富度顯示結(jié)果一致，各年齡段川金絲猴腸道菌群在Shannon指數(shù)與豐富度上無顯著性差異(P＞0.05);但均勻度結(jié)果顯示，老年川金絲猴顯著低于幼年與成年(P＜0.05)，而成年與幼年無顯著性差異(P＞0.05)。上述結(jié)果表明，老年川金絲猴腸道菌群在均勻度上明顯低于幼年與成年，各年齡 段川金絲猴在優(yōu)勢(shì)菌群上存在明顯差異。

圖1 不同年齡段川金絲猴腸道菌群聚類分析Fig.1 Clustering analysis of gut microbiome of Rhinopithecus roxellana in different ages

表2 不同年齡段川金絲猴腸道菌群生物多樣性比較Table 2 Comparison of biological diversity of gut microbiome of Rhinopithecus roxellana in different ages

2.3 主成分分析不同年齡段川金絲猴腸道菌群結(jié)構(gòu)

通過軟件Quantity One v4.62將 PCR-DGGE指紋圖譜的條帶進(jìn)行二進(jìn)制轉(zhuǎn)導(dǎo)，運(yùn)用主成分分析法對(duì)各年齡段川金絲猴樣品進(jìn)行分析。如圖2所示，各年齡段樣品明顯分散在不同區(qū)域，成年與幼年樣品分群聚集較為明顯，而老年樣品則較分散，說明老年樣品組內(nèi)之間的差異性較高，而幼年與成年樣品組內(nèi)相似度較高。主成分分析反映出幼年樣品聚合程度高于成年樣品，相對(duì)老年，幼年與成年的距離較為接近。

2.4 不同年齡段川金絲猴腸道菌群數(shù)量比較

對(duì)不同年齡段川金絲猴樣品中真細(xì)菌、Lactobacillus spp.、Enterobacteriaceae、Bifidobacterium spp.菌群進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果見表2。幼年樣品中真細(xì)菌的數(shù)量極顯著少于成年(P＜0.01)，顯著多于老年(P ＜0.05);成年樣品中真細(xì)菌的數(shù)量極顯著多于老年(P＜0.01)，但三者的數(shù)量均在同一數(shù)量級(jí)(1011)。幼年樣品中Enterobacteriaceae的數(shù)量顯著少于成年(P＜0.05)，同時(shí)顯著少于老年(P＜0.05)，成年與老年之間無顯著差異(P＞0.05)。成年樣品中 Lactobacillus spp.的數(shù)量極顯著多于幼年(P＜0.01)，同時(shí)極顯著多于老年(P＜0.01)，幼年與老年之間無顯著差異(P＞0.05)。老年樣品中 Bifidobacterium spp.的數(shù)量極顯著少于成年(P＜0.01)，同時(shí)極顯著少于幼年(P ＜0.01);幼年極顯著少于成年(P ＜0.01)。上述結(jié)果說明各年齡段川金絲猴腸道菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異。

圖2 主成分分析不同年齡段川金絲猴腸道菌群Fig.2 PCA of gut microbiome of Rhinopithecus roxellana in different ages

表2 不同年齡段川金絲猴菌群數(shù)量比較Table 2 Comparison of gut microbiome number of Rhinopithecus roxellana in different ages 拷貝數(shù)/g

3 討論

隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，動(dòng)物微生態(tài)領(lǐng)域的研究越來越廣泛，使得研究金絲猴腸道菌群成為可能［15］。本研究同時(shí)采用 PCR-DGGE和熒光定量PCR技術(shù)研究川金絲猴的腸道菌群，在定性的基礎(chǔ)上，定量檢測(cè)腸道中常見的菌群，即真細(xì)菌、Lactobacillus spp.、Enterobacteriaceae、Bifidobacterium spp.的數(shù)量，能更全面反映川金絲猴的腸道菌群信息。

研究表明，哺乳動(dòng)物出生時(shí)是無菌的，但隨著出生胃腸道開始有外來微生物棲息并定植，胃腸道微生物的組成在出生后1年內(nèi)就建立［16］。研究發(fā)現(xiàn)，嬰兒胃腸道中占主導(dǎo)地位的菌群是變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)［17－18］。與成年哺乳動(dòng)物的1 000多種微生物相比，嬰兒腸道中只有約10種微生物，在其機(jī)體發(fā)育成長(zhǎng)中，不同種類的外源微生物進(jìn)入腸道，在適宜情況下定植，腸道菌群多樣性逐漸增加。從幼年與成年川金絲猴的結(jié)果比較來看，腸道菌群Shannon指數(shù)兩者差異不顯著，但優(yōu)勢(shì)條帶的位置和亮度有明顯差別;幼年與老年川金絲猴腸道菌群生物多樣性無顯著差異，但幼年川金絲猴腸道菌群的優(yōu)勢(shì)條帶明顯多于老年川金絲猴。幼年川金絲猴腸道菌群中真細(xì)菌、Enterobacteriaceae、Bifidobacterium spp.和 Lactobacillus spp.的數(shù)量顯著或極顯著少于成年川金絲猴，賀銳等［19］研究中也發(fā)現(xiàn)腸道菌群中Bifidobacterium spp.的數(shù)量隨年齡增長(zhǎng)有增加的趨勢(shì)。推測(cè)幼年川金絲猴的腸道菌群還在發(fā)展中，優(yōu)勢(shì)菌群也在演變;到了成年時(shí)期，腸道菌群的平衡狀態(tài)較為穩(wěn)定，其數(shù)量與多樣性都變化不大。健康成年動(dòng)物腸道菌群根據(jù)其代謝功能特點(diǎn)可分為3類:第1類為乳酸菌，包括雙歧桿菌、乳桿菌和鏈球菌等;第2類為腐敗菌，如擬桿菌、梭菌、消化球菌、大腸桿菌和葡萄球菌等;第3類為瘤胃球菌和巨型球菌等［20］。Wu等［15］采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析技術(shù)并結(jié)合克隆技術(shù)分析了滇金絲猴腸道菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)滇金絲猴腸道中占主導(dǎo)地位 的 菌 群 是 Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、螺旋體門(Spirochaetes)和 Actinobacteria。隨著年齡的增長(zhǎng)，到了老年時(shí)期胃腸道生理機(jī)能下降［21－22］，胃腸黏膜滲透性增加［23］，腸道菌群結(jié)構(gòu)受到影響，相應(yīng)的多樣性與腸道菌群數(shù)量降低。老年川金絲猴腸道菌群生物多樣性雖然與幼年和成年川金絲猴無明顯差異，但其腸道菌群結(jié)構(gòu)明顯與2個(gè)年齡段存在差別，并且從指紋圖譜看其優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量明顯低于幼年和成年川金絲猴。老年川金絲猴腸道菌群中Bifidobacterium spp.的數(shù)量極顯著低于成年和幼年川金絲猴，Lactobacillus spp.的數(shù)量顯著低于成年川金絲猴，這與Mueller等［24］研究人腸道菌群的結(jié)果相似，并且其結(jié)果還顯示老年人的腸道菌群中Enterobacteriaceae的數(shù)量較高，本研究中老年川金絲猴腸道菌群中Enterobacteriaceae的數(shù)量只顯著高于幼年川金絲猴，與成年川金絲猴無顯著差異。與大多數(shù)研究得出的老年時(shí)期腸道菌群中 Bifidobacterium spp.的數(shù)量減少［25－29］的結(jié)論一致，在本研究中老年川金絲猴腸道菌群中Bifidobacterium spp.的數(shù)量極顯著低于幼年和成年川金絲猴。Stsepetova等［30］揭示出腸道中 Lactobacillus spp.數(shù)量與年齡相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)老年人腸道中Lactobacillus spp.的數(shù)量高于中年人。而在本研究中，老年川金絲猴腸道菌群中Lactobacillus spp.的數(shù)量極顯著低于成年川金絲猴。川金絲猴腸道菌群的多樣性與優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量伴隨年齡增長(zhǎng)不斷變化，其腸道菌群多樣性呈增加到減少的一個(gè)趨勢(shì)，而優(yōu)勢(shì)菌群的數(shù)量變化不一致，有的呈增加的趨勢(shì)，有的呈減少的趨勢(shì)。

4 結(jié)論

伴隨著年齡的增長(zhǎng)，川金絲猴腸道菌群的多樣性發(fā)生變化，尤其是優(yōu)勢(shì)菌群不斷發(fā)展演變，到老年時(shí)期優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量明顯減少;同時(shí)，川金絲猴腸道中各菌群的數(shù)量也在不斷地發(fā)生變化，但變化趨勢(shì)不一致。

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