鷹嘴豆降膽固醇肽的制備及活性

姚余祥 張久亮 何 慧 郝旭贊 侯 燾 王 馳

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

鷹嘴豆降膽固醇肽的制備及活性

姚余祥 張久亮 何 慧 郝旭贊 侯 燾 王 馳

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

為了獲得降膽固醇肽，本試驗(yàn)以鷹嘴豆為原料，將提取的分離蛋白通過堿性蛋白酶水解，選擇加酶量、料液比、酶解時(shí)間3個(gè)因素，以水解度和膽固醇抑制率為考察指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上，以膽固醇抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解鷹嘴豆蛋白，制備降膽固醇活性肽的條件；并將制備的鷹嘴豆肽對(duì)Wister大鼠進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明：鷹嘴豆蛋白最佳酶解工藝為：pH 8.0，加酶量2%，料液比2%，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間80 min，在此條件下鷹嘴豆多肽體外膽固醇抑制率可達(dá)到71.55%；動(dòng)物試驗(yàn)顯示灌胃100 mg／kg bw劑量的鷹嘴豆肽可使大鼠體內(nèi)膽固醇含量降低22.39%。

鷹嘴豆肽 響應(yīng)面優(yōu)化 降膽固醇 水解度 活性

鷹嘴豆（Chickpea Cicer arietinum L）是一年生或多年生草本植物，因其籽粒像鷹嘴而得名，鷹嘴豆主要分布在干旱貧瘠的地方，在我國主要分布在新疆、青海、甘肅等地。豆類中鷹嘴豆產(chǎn)量居世界第三，為世界第二大消費(fèi)豆類［1］。鷹嘴豆作為植物蛋白質(zhì)的重要來源，富含人體所需的18種氨基酸以及8種必需氨基酸，為全價(jià)蛋白。鷹嘴豆?fàn)I養(yǎng)豐富，具有很好的食用及藥用價(jià)值，具有抗骨質(zhì)疏松［2］、抗氧化［3］、降低血糖、血脂和調(diào)節(jié)膽固醇水平［4-5］等藥理活性，其調(diào)節(jié)膽固醇的活性因子被認(rèn)為是鷹嘴豆皂苷，是新型的營養(yǎng)健康食品［6］。

鷹嘴豆肽是鷹嘴豆分離蛋白在一定條件下水解得到的，目前對(duì)鷹嘴豆肽的活性研究主要集中在其抗氧化［7］、抑制腫瘤作用、免疫調(diào)節(jié)［8］、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制［9］等方面。

膽固醇攝入量過多，會(huì)引起高膽固醇血癥，使心腦血管疾病的發(fā)病率明顯提升，進(jìn)而形成冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等所謂的“富貴病”，而心腦血管疾病是人類健康的第一殺手［10］。臨床治療表明，通過藥物干預(yù)來降低血清膽固醇水平，可以有效預(yù)防和治療心腦血管疾病，但有副作用［11］；而以食源性蛋白質(zhì)酶法改性制得的生物活性肽安全無毒，易吸收。

眾所周知大豆肽具有調(diào)節(jié)血脂和降低血液膽固醇的作用［12］。本試驗(yàn)旨在考察鷹嘴豆肽是否具有降低膽固醇的活性，以鷹嘴豆為原料，將提取的鷹嘴豆分離蛋白經(jīng)過酶解，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過體外模擬膽汁膠束溶液，以水解度和膽固醇抑制率為考察指標(biāo)，并采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法，確定了制備具有降低膽固醇活性的鷹嘴豆肽的最佳酶解工藝，并結(jié)合動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)其體內(nèi)降膽固醇活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鷹嘴豆：新疆阿克蘇。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：體重160～180 g Wister大鼠，購于湖北省疾控中心（許可證號(hào)：SCXK（鄂）2008-0005）。

Alcalase堿性蛋白酶：諾維信生物技術(shù)有限公司；牛黃膽酸鈉：上海源葉生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

LE-80K超速離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特有限公司；PB-10 Sartorius標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)：德國賽多利斯股份公司；LGJ-12冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；生化分析儀：美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脫脂鷹嘴豆粉的制備［13］

鷹嘴豆經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，石油醚脫脂。豆粉∶石油醚為 1∶10（w／V），室溫連續(xù)攪拌 60 min，鷹嘴豆自然沉降與石油醚分離，傾出石油醚進(jìn)行回收，重復(fù)上述提取工藝2次。最后鷹嘴豆粉置通風(fēng)櫥中室溫下過夜，將處理好的脫脂粉袋裝置-4℃冰箱保存。

1.3.2 鷹嘴豆分離蛋白的制備

采用堿溶酸沉淀法提取分離蛋白［13］。脫脂鷹嘴豆粉與水 1∶10（w／V）混合，用 0.5 mol／L NaOH調(diào) pH 8.0攪拌 1 h，4 000 r／min離心 20 min，沉淀按固液比1∶5（w／V）提取 2次，將3次上清液合并，上清液用0.5 mol／L的HCl調(diào)至等電點(diǎn)pH 5.5沉淀蛋白，去離子水洗滌3次，將沉淀干燥即為鷹嘴豆分離蛋白，粉碎后過80目篩，測(cè)蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 鷹嘴豆酶解工藝

稱取適量鷹嘴豆蛋白溶于蒸餾水中，置于酶解反應(yīng)器中，混合均勻。80℃預(yù)熱20 min，然后將混合液迅速調(diào)節(jié)到堿性蛋白酶的最適溫度和最適pH范圍內(nèi)，緩慢攪拌的同時(shí)加入適量堿性蛋白酶，通過滴加0.5 mol／L的NaOH溶液來維持反應(yīng)體系的pH不變，并按一定的反應(yīng)時(shí)間間隔記錄NaOH消耗量。根據(jù)pH-stat法計(jì)算水解度（DH）值。反應(yīng)完畢后，將制得水解液放置于沸水中滅酶10 min，再放入冰浴中立即冷卻，離心（4 500 r／min，10 min），將上清液凍干并儲(chǔ)藏備用。

鷹嘴豆分離蛋白水解度（DH）測(cè)定與控制采用pH-stat法［14-16］。

式中：B為堿液體積／mL；Nb為堿液的濃度／mol／L；α為 α-氨基的解離度（10／11）；Mp為底物中蛋白質(zhì)總量／g／kg；H tot為底物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)（mmol／g／鷹嘴豆蛋白：H tot＝7.22）。

1.3.4 鷹嘴豆肽體外降膽固醇活性

膽固醇膠束溶解度抑制率的測(cè)定［17］。模擬膽汁膠束溶液包含：10 mmol／L?；悄懰徕c，2 mmol／L膽固醇，5 mmol／L油酸，132 mmol／L NaCl，15 mmol／L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4），5 mg／mL鷹嘴豆肽粉末，超聲波乳化，然后在37℃培養(yǎng)24 h，超速離心（23 700 r／min，60 min）后取上清液測(cè)定膽固醇含量，上清液中膽固醇濃度即為膽固醇膠束溶解度（mmol／L）。以不加肽的膠束濃度為空白，計(jì)算抑制率。

抑制率＝（空白溶液的膽固醇溶解度-樣品溶液的膽固醇溶解度）／空白溶液的膽固醇溶解度×100%

1.3.5 鷹嘴豆酶解單因素試驗(yàn)

分別以溫度、pH、加酶量、料液比、水解時(shí)間為單因素，以水解度和膽固醇的抑制率作為試驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行研究。

1.3.6 鷹嘴豆酶解工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取加酶量、液料比、提取時(shí)間為試驗(yàn)因素，以膽固醇抑制率為響應(yīng)指標(biāo)，設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)，利用Design-Expert7.1.4軟件進(jìn)行回歸分析。

1.3.7 動(dòng)物試驗(yàn)

Wister健康雄性大鼠20只，用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)適應(yīng)一周，試驗(yàn)環(huán)境下，隨機(jī)分為2組，每組10只，第1組為高脂模型組，第2組為受試組。1周后尾靜脈取血，測(cè)定血清總膽固醇含量；然后兩組均喂高脂飼料［18］4周，期間模型組灌胃生理鹽水，受試組灌胃鷹嘴豆多肽，劑量為100 mg／kg bw，試驗(yàn)結(jié)束比較總膽固醇含量。試驗(yàn)期間各組大鼠自由飲水（自來水）和自由進(jìn)食高脂飼料。試驗(yàn)動(dòng)物房通風(fēng)條件良好，溫度（25±3）℃，相對(duì)濕度（RH）60%～70%。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解pH的選擇

固定酶解溫度50℃，時(shí)間60 min，酶底比3%，料液比2%，改變pH條件測(cè)定酶解肽對(duì)膽固醇含量的影響，并計(jì)算水解度和膽固醇抑制率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶解pH對(duì)水解度及鷹嘴豆肽膽固醇抑制率的影響

從圖1中可以看出隨著pH的升高，肽的膽固醇抑制率先增后減。當(dāng)pH 8.0時(shí)，酶解得到的鷹嘴豆肽對(duì)膽固醇的抑制率最高，此時(shí)正值A(chǔ)lcalase的最適pH，且此酸度下鷹嘴豆分離蛋白易溶解，酶解效率高；pH過高時(shí)，蛋白酶酶解效率降低。同時(shí)由圖1可以看出隨著酶解pH的升高，水解度亦呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)pH為8時(shí)水解度達(dá)到最大，故宜選擇pH 8.0為本試驗(yàn)的最適水解酸度。

2.1.2 酶解溫度的選擇

固定酶解pH 8.0，時(shí)間60 min，酶底比3%，料液比2%，改變溫度條件，測(cè)定酶解肽對(duì)膽固醇含量的影響，并計(jì)算水解度和膽固醇抑制率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶解溫度對(duì)水解度及鷹嘴豆肽膽固醇抑制率的影響

從圖2中可以看出隨著溫度的升高，膽固醇抑制率先升后降。隨著溫度的升高，越來越接近酶的最適溫度，當(dāng)達(dá)到50℃以后，繼續(xù)升高溫度膽固醇抑制率逐漸下降。同時(shí)由圖2可以看出隨著溫度的升高，水解度亦呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，這是因?yàn)锳lcalase的最適溫度下酶解效率高，繼續(xù)升高溫度酶解效率有所下降，故選擇溫度50℃為宜。

2.1.3 加酶量的選擇

固定溫度50℃，pH 8.0，料液比為1∶50，改變加酶量，酶解60 min，測(cè)定酶解肽對(duì)膽固醇含量的影響，并計(jì)算水解度和膽固醇抑制率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 加酶量對(duì)水解度及鷹嘴豆肽膽固醇抑制率的影響

從圖3可以看出，隨著加酶量的增加，膽固醇抑制率不斷的增加，當(dāng)加酶量達(dá)到2%時(shí)，膽固醇抑制率達(dá)到最大，加酶量繼續(xù)增加，抑制率反而有所下降。同時(shí)由圖3可以看出隨著加酶量的增加，水解度不斷增加，當(dāng)加酶量到達(dá)4%時(shí)，水解度達(dá)到了最大，此后有所下降；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，加酶量為2%時(shí)的水解度與加酶量為4%時(shí)水解度無顯著性差異，綜合考慮選擇適宜加酶量為2%。

2.1.4 料液比的選擇

固定溫度50℃，pH 8.0，加酶量為2%，改變料液比條件，酶解60 min，測(cè)定酶解肽對(duì)膽固醇含量的影響，并計(jì)算水解度和膽固醇抑制率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 料液比對(duì)水解度及鷹嘴豆肽膽固醇抑制率的影響

由圖4可以看出，隨著料液比的增加，膽固醇抑制率呈現(xiàn)先增后減又增的趨勢(shì)，同時(shí)由圖4可以看出隨著料液比的增加，水解度不斷的下降，當(dāng)加酶量到達(dá)4%時(shí)，水解度趨于一個(gè)穩(wěn)定值。綜合考慮選擇適宜料液比為2%。

2.1.5 酶解時(shí)間的選擇

固定溫度50℃，pH 8.0，加酶量為2%，料液比為2%條件下，改變酶解時(shí)間，測(cè)定酶解肽對(duì)膽固醇含量的影響，并計(jì)算水解度和膽固醇抑制率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)水解度及鷹嘴豆肽膽固醇抑制率的影響

由圖5可以看出，隨著水解時(shí)間的增加，鷹嘴豆肽的膽固醇抑制率呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)水解時(shí)間為80 min時(shí)，其膽固醇的抑制率達(dá)到最大；同時(shí)隨著水解時(shí)間的增加，水解度不斷的上升，當(dāng)水解時(shí)間到達(dá)120 min時(shí)，水解度達(dá)到最大。由此可見，鷹嘴豆肽的膽固醇抑制活性與水解度并非完全正相關(guān)。本試驗(yàn)中宜選擇水解時(shí)間為80min，此時(shí)的水解度為17.73%。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)

2.2.1 設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選定酶解溫度為50℃，pH 8.0條件下，以加酶量（X1）、料液比（X2）、酶解時(shí)間（X3）3個(gè)因素為變量因子，并以+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低3個(gè)水平，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面三因素三水平設(shè)計(jì)方法研究3個(gè)變量對(duì)鷹嘴豆多肽降膽固醇活性的影響，設(shè)定的試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2.2.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得膽固醇抑制率對(duì)加酶量（X1）、液料比（X2）和酶解時(shí)間（X3）的二次多項(xiàng)式回歸模型為：

表2 堿性蛋白酶提取鷹嘴豆多肽的降膽固醇活性Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

從表3可以看出，模型“P＞F”值小于0.01，表明該回歸模型極顯著（P＜0.01）；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝0.9103，表明該模型與實(shí)際擬合較好；此外從方差分析結(jié)果可知為極顯著因素，這表明加酶量，料液比以及酶解時(shí)間在制備降膽固醇肽中均起主要作用，并且對(duì)膽固醇抑制率的影響順序?yàn)椋好附鈺r(shí)間＞加酶量＞料液比。X1X2、X2X3、X1X3項(xiàng)均不顯著，表明3個(gè)因素之間交互作用較小。

表3 自變量與應(yīng)變量之間關(guān)系的回歸模型評(píng)估

2.2.3 堿性蛋白酶提取鷹嘴豆多肽的響應(yīng)面分析及優(yōu)化

多元回歸方程的響應(yīng)面及其等高線圖見圖6～圖8。通過該圖可對(duì)任何兩個(gè)交互影響堿性蛋白酶制備鷹嘴豆多肽的因素進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，并從中確定最佳因素水平范圍。

從圖6～圖8中可以看出方程存在極大值，即響應(yīng)面的最高點(diǎn)，利用 Design-Expert7.1.4軟件進(jìn)行最優(yōu)化分析，分析結(jié)果表明：酶解溫度50℃、pH 8.0、酶解時(shí)間80.14min、料液比1.92%、酶底比1.86%，在該最佳條件下的膽固醇抑制率預(yù)測(cè)值為71.97%。為了驗(yàn)證響應(yīng)面的可行性，采用酶解溫度、pH、加酶量、料液比、酶解時(shí)間分別為50℃、8.0、2%、2%、80min時(shí)，膽固醇抑制率為71.55%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為0.58%。

圖6 加酶量和料液比對(duì)膽固醇抑制率影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖8 料液比和酶解時(shí)間對(duì)膽固醇抑制率影響的響應(yīng)面

2.3 動(dòng)物試驗(yàn)

由表4可知，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)表明：受試組總膽固醇含量顯著低于高脂模型組，其膽固醇含量降低了22.39%，這說明鷹嘴豆肽不僅在體外試驗(yàn)中有降低膽固醇的作用，同時(shí)動(dòng)物試驗(yàn)也表明鷹嘴豆肽能有效抑制對(duì)膳食中膽固醇的吸收，降低血清膽固醇濃度。

表4 四周后各組大鼠血清膽固醇測(cè)定值

3 討論

本試驗(yàn)在最佳條件下制得的鷹嘴豆肽其膽固醇抑制率高達(dá)71.55%，此值顯著優(yōu)于大豆肽的降膽固醇活性（用Alcalase酶水解大豆分離蛋白，水解度為18%的酶解物其降膽固醇活性最高，其對(duì)膽固醇膠束溶解度的抑制率為48.39%［19］）。本研究還發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆肽的抑制膽固醇活性與水解度并非完全的成正相關(guān)關(guān)系，過度追求高水解度，會(huì)帶來活性的損失。

由于膳食中的膽固醇在人體腸道中，和其他脂類一起，借助于膽鹽的乳化作用，形成混合的膠束溶液，以膠粒形式存在的膽固醇才能被輸送入腸黏膜細(xì)胞，再經(jīng)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)。實(shí)驗(yàn)室條件下則是利用超聲波乳化、超速離心的手段制備出一種人造膽汁膠束溶液，在體外模擬人體的腸道環(huán)境［20］。有報(bào)道大豆肽對(duì)膽固醇的抑制作用可能是由于大豆肽更容易與膽鹽結(jié)合形成復(fù)合物，從而阻礙了微膠粒的形成，使膽固醇的吸收率降低［20］。鷹嘴豆肽與膽鹽的結(jié)合能力或許比大豆肽更強(qiáng)，因?yàn)榍罢叩捏w外試驗(yàn)數(shù)據(jù)為膽固醇抑制率71.55%，后者的體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)為膽固醇抑制率48.39%，但其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

大豆肽降膽固醇活性與肽段疏水性的大小有關(guān)系，隨著疏水性的增加大豆肽降膽固醇的活性也增加，有報(bào)道經(jīng)用75%的乙醇對(duì)大孔吸附樹脂吸附的大豆肽洗脫后收集的組分，其對(duì)膽固醇的抑制率會(huì)明顯增加［20］，這提示其降膽固醇作用強(qiáng)或許與此性質(zhì)有關(guān)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過堿性蛋白酶酶解鷹嘴豆分離蛋白獲得具有降膽固醇活性的多肽，采用響應(yīng)面法對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化，以體外膽固醇抑制率為測(cè)定指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果顯示最佳條件為：酶解溫度50℃、pH 8.0、加酶量為2%、料液比為2%、酶解時(shí)間為80 min，在此條件下鷹嘴豆多肽體外膽固醇抑制率可達(dá)到71.55%；動(dòng)物試驗(yàn)顯示灌胃100 mg／kg bw劑量的鷹嘴豆肽可使大鼠體內(nèi)膽固醇含量降低22.39%。

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Preparation and Bioactivity of Chickpea Hypocholesterolemic Peptides

Yao Yuxiang Zhang Jiuliang He Hui Hao Xuzan Hou Tao Wang Chi
（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University Key Laboratory of Environment Correlative Dietology，Ministry of Education，Wuhan 430070）

To preparation the cholesterol-lowering peptides，isolated chickpea protein has been hydrolyzed by Alcalase.The amount of enzyme，thematerial to solvent ratio and enzymolysis time were the three test factories.By single factor and Box-Behnken response surfacemethodology，hydrolysis condition model has been established with inhibition rate of cholesterol as the evaluating index.Wistar ratswere used in the test for the prepared Chickpea.The optimum conditionswere：pH 8.0，the amountof enzyme 2%，material to solvent ratio 2%，enzymolysis temperature 50℃，enzymolysis time 80 min.On these conditions，the inhibiting rate of cholesterol of chickpea peptides is 71.55%in vitro.The concentration of cholesterol could be decreased by 22.39%with chickpea peptides（100 mg／kg bw）in vivo.

chickpea peptides，response surface optimization，cholesterol-lowering，degree of hydrolysis，Bioactivity

TS816.42

A

1003-0174（2015）01-0033-06

2013-11-07

姚余祥，男，1988年出生，碩士，農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程

何慧，女，1960年出生，博士，教授，食品化學(xué)