氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定水產(chǎn)飼料中的脂肪酸

張鳳枰 羅彬月 杜雪莉 曹 靜 劉耀敏

（通威股份有限公司水產(chǎn)畜禽營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，成都 610041）

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院2，上海 201306）

氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定水產(chǎn)飼料中的脂肪酸

張鳳枰1，2羅彬月1杜雪莉1曹 靜2劉耀敏1

（通威股份有限公司水產(chǎn)畜禽營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，成都 610041）

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院2，上海 201306）

建立以十三烷酸為內(nèi)標(biāo)物，氣相色譜定量測定水產(chǎn)飼料中脂肪酸含量的方法。飼料樣品中的油脂經(jīng)酸熱法提取、氫氧化鉀-甲醇皂化、三氟化硼-甲醇甲酯化后衍生為相應(yīng)的脂肪酸甲酯，以SPTM-2560毛細(xì)管柱分離，氫火焰離子化檢測器測定，保留時(shí)間定性、峰面積內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明，在所選擇的色譜條件下，37種脂肪酸甲酯在65 min內(nèi)獲得較好的分離；9種主要脂肪酸加標(biāo)回收率（n＝6）為88.4%～107.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.28%～4.79%，最低定量限（S／N＝10）為2.0 mg／kg。該方法操作簡便、快速、重復(fù)性好，適合批量水產(chǎn)飼料樣品脂肪酸的定量測定。

氣相色譜 內(nèi)標(biāo)法 脂肪酸 水產(chǎn)飼料

魚類能量主要來源于脂肪酸的分解代謝，亞麻酸、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等長鏈多不飽和脂肪酸為魚類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能所需要，是前列腺素（PG）、白細(xì)胞三烯（LT）和脂氧素等的前體，在調(diào)控細(xì)胞代謝和魚類生理功能方面具有重要生理功能［1］。季文娟［2］研究結(jié)果表明 EPA、DHA對中國對蝦的繁殖力具有特殊的作用，親蝦飼料中必須含有適量EPA、DHA，才能保證親蝦正常的產(chǎn)卵和卵質(zhì)。吉紅等［3］研究表明飼料HUFA具有抑制草魚脂質(zhì)合成及向肝組織的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、降低肝胰臟脂質(zhì)及腹腔脂肪的沉積、提高草魚抗氧化能力的作用。水產(chǎn)飼料生產(chǎn)企業(yè)一般在飼料生產(chǎn)過程中添加大豆油、魚油、藻粉等脂肪源，以滿足魚蝦對脂肪酸特別是長鏈多不飽和脂肪酸的生理需求。因此，脂肪酸含量已成為國內(nèi)外水產(chǎn)飼料品質(zhì)控制重要指標(biāo)之一。脂肪酸的測定方法有氣相色譜法［4-5］、液相色譜法［6］、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［7-8］、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［9-10］、紅外光譜法［11-12］等，國家標(biāo)準(zhǔn)方法［13］規(guī)定了飼料中的脂肪酸含量測定方法，該法采用索氏抽提法得到飼料油脂后，外標(biāo)法定量測定各種脂肪酸的含量，檢測周期長，操作步驟繁瑣，且對于添加微藻等原料的水產(chǎn)飼料，若采用該法測定脂肪酸，不能完全提取藻粉中的油脂，測定結(jié)果與產(chǎn)品標(biāo)示值相差較大。本試驗(yàn)采用酸熱法一次提取飼料中的油脂，內(nèi)標(biāo)法定量測定水產(chǎn)飼料中脂肪酸含量，旨在簡化前處理步驟，縮短檢測周期，為水產(chǎn)飼料脂肪酸的質(zhì)量控制提供簡便、快速、準(zhǔn)確可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

7890 A氣相色譜儀，配7683B自動(dòng)進(jìn)樣器、FID檢測器：美國Agilent科技有限公司；Allegra 64R冷凍離心機(jī)：美國Beckman Coulter公司。

Supelco37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mg／mL），十三烷酸（C13∶0）、豆蔻酸（C14∶0）、棕櫚酸（C16∶0）、棕櫚油酸（C16∶1）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1n9c）、亞油酸 （C18∶2n6）、亞麻 酸（C18∶3n3）、二十碳五烯酸（C20∶5n3）、二十二碳六烯酸（C22∶6n3）等10種脂肪酸及其甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、13%～15%三氟化硼-甲醇溶液：美國Sigma-Aldrich公司。

水產(chǎn)飼料樣品：四川當(dāng)?shù)仫暳鲜袌霾杉?/p>

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1.1 十三烷酸內(nèi)標(biāo)溶液

準(zhǔn)確稱取適量十三烷酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成10.0 mg／mL溶液，充分搖勻備用；準(zhǔn)確稱取適量十三烷酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，用異辛烷配制成0.25 mg／mL內(nèi)標(biāo)溶液，充分搖勻備用。

1.2.1.2 脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱取適量十三烷酸、豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等10種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品適量，用異辛烷分別配制 0.25、5.0、50.0、50.0、5.0、50.0、50.0、5.0、5.0、5.0 mg／mL的混合儲備液，充分搖勻備用。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Supelco SPTM-2560石英毛細(xì)管柱，100 m×0.25 mm×0.20μm；汽化室溫度：250℃；檢測器溫度：260℃；色譜柱初始溫度60℃，以4℃／min升至160℃，再以2℃／min升至240℃；載氣：高純氮；柱流速：1.0 mL／min；尾吹流速：40 mL／min；氫氣流速：35 mL／min；空氣流速：350 mL／min；分流比10∶1；進(jìn)樣量1μL。

1.2.3 樣品前處理

1.2.3.1 飼料油脂的提取

參考酸熱法［14］，稍作改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取飼料樣品1.0 g（精確至0.000 1 g），置50 mL離心管中，加入10.0 mg／mL十三烷酸內(nèi)標(biāo)溶液 0.5 mL、4 mol／L鹽酸6 mL，漩渦混勻1 min，置于60℃恒溫振蕩水槽，100 r／min振蕩30 min，沸水浴煮5 min，-20℃速冷后加入20 mL三氯甲烷-甲醇（1∶1）混合溶劑，漩渦混勻 2 min，5 000 r／min離心 10 min，取氯仿層，加等體積的0.1%氯化鈉溶液，混勻，5 000 r／min離心10 min，取氯仿層移至干燥的100 mL三角瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，得到油脂。

1.2.3.2 脂肪酸甲酯的制備［15］

所得油脂加10 mL 0.5 mol／L NaOH-CH3OH，充N2，連接冷凝器，置于水浴上回流10 min后立即加入7 mL 13%～15%BF3-CH3OH于沸騰的溶液中，繼續(xù)煮沸，回流20 min。加入20 mL異辛烷于沸騰的混合溶液中，停止加熱，加入20 mL飽和NaCl溶液，在漩渦混合器上混合1 min，靜置分層，移取4～5 mL上清液至10 mL具塞試管中，加入適量無水Na2SO4脫水，移取1 mL脫水試液作為樣品溶液備用。

1.2.4 分析測定

按上述色譜條件，待基線穩(wěn)定后，標(biāo)樣、樣品溶液分別等體積進(jìn)樣，進(jìn)行氣相色譜分析，以樣品峰的保留時(shí)間與脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各脂肪酸的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 水產(chǎn)飼料油脂提取方法的選擇

飼料油脂的提取方法有索氏抽提法、酸水解-索氏抽提法［16］，因從飼料經(jīng)銷商了解到，本試驗(yàn)采集的部分水產(chǎn)飼料樣品中添加了DHA藻粉，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)就采用酸水解-索氏抽提法測定樣品粗脂肪含量，結(jié)果見表1，6個(gè)樣品所得粗脂肪測定結(jié)果均大大低于產(chǎn)品標(biāo)示含量，這可能是因?yàn)樵囼?yàn)樣品添加了一定量的DHA藻粉，采用常規(guī)的酸水解法未有效破壞DHA藻粉的細(xì)胞壁，所用石油醚極性弱、提取效果不理想。試驗(yàn)參考了文獻(xiàn)［15］酸熱法，利用鹽酸對細(xì)胞壁中糖及蛋白質(zhì)等成分的作用，在60℃水浴中振蕩30 min，使原來結(jié)構(gòu)緊密的細(xì)胞壁變得疏松，再經(jīng)沸水浴及-20℃速凍處理，使細(xì)胞壁進(jìn)一步被破壞，再用極性較強(qiáng)的三氯甲烷-甲醇混合溶劑有效地浸提出DHA藻粉細(xì)胞中的油脂。事實(shí)證明，酸熱法所得粗脂肪測定結(jié)果與產(chǎn)品標(biāo)示含量基本一致，所得油脂中的DHA含量與酸水解-索氏抽提法相比大大提高，進(jìn)一步說明酸水解-索氏抽提法不能充分有效提取DHA藻粉中的油脂。

表1 2種油脂提取方法脂肪測定結(jié)果比較／g／100 g

2.2 色譜條件及內(nèi)標(biāo)物的選擇

為了使37種混合脂肪酸甲酯能夠完全分離、準(zhǔn)確定量，參考了國家標(biāo)準(zhǔn)［17］，選擇可完全分離脂肪酸異構(gòu)體的SPTM-2560石英毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm i.d.×0.20μm），試驗(yàn)采用程序升溫，對色譜條件進(jìn)行了選擇、優(yōu)化，選擇分離時(shí)間較短、能把Supelco37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各脂肪酸甲酯達(dá)到最佳分離狀態(tài)時(shí)的條件確定為色譜條件。在此色譜條件下，37種脂肪酸甲酯出峰順序見圖1。

色譜內(nèi)標(biāo)物應(yīng)與被測組分的相對分子質(zhì)量和沸點(diǎn)相近、結(jié)構(gòu)相似，且保留時(shí)間相近，但又能分開。試驗(yàn)選擇十三烷酸為內(nèi)標(biāo)物，按照所選擇的色譜條件，供試品不加內(nèi)標(biāo)物、加內(nèi)標(biāo)物的色譜圖如圖2、圖3。結(jié)果表明，待測成分及內(nèi)標(biāo)物分離效果良好，十三烷酸是較理想的內(nèi)標(biāo)物。

圖1 Supelco 37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 飼料樣品未加內(nèi)標(biāo)物色譜圖

圖3 飼料樣品加內(nèi)標(biāo)物色譜圖

2.3 線性范圍

分別準(zhǔn)確移取0.10、0.20、0.50、1.0、2.0 mL脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.2.1.2），用 0.25 mg／mL十三烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液（1.2.1.1）稀釋至10.0 mL，搖勻，在上述色譜條件下分析測定。以各脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)（x），相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明，相關(guān)系數(shù)均在0.997 6以上，說明在測定的濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)ID的響應(yīng)與脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度成線性相關(guān)。

表2 9種脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）

2.4 回收率、精密度和最低定量限

準(zhǔn)確稱取飼料樣品1.0 g（精確至0.000 1 g），置50 mL離心管中，分別添加3個(gè)濃度梯度的9種脂肪酸，其中棕櫚酸、油酸、亞油酸添加量為10.0、20.0、50.0 mg，其余 6種脂肪酸添加量為 1.0、2.0、5.0 mg，每個(gè)梯度重復(fù)2次，方法的回收率結(jié)果和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。以信噪比S／N＝10且回收率和精密度較好的濃度點(diǎn)計(jì)算最低定量限（LOQ），9種脂肪酸甲酯的最低定量限為2 mg／kg。

2.5 實(shí)際樣品測定

按上述方法，分別測定6批水產(chǎn)飼料樣品的脂肪酸含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果／mg／100 g

3 結(jié)論

采用酸熱法提取飼料油脂，氫氧化鉀-甲醇皂化、三氟化硼-甲醇甲酯化進(jìn)行衍生，前處理簡單、快速、易操作，SPTM-2560毛細(xì)管柱可有效分離各種脂肪酸甲酯的異構(gòu)體，分離效果好，用十三烷酸內(nèi)標(biāo)物定量，測定結(jié)果重現(xiàn)性好、可信度高，為水產(chǎn)飼料脂肪酸的質(zhì)量控制提供了檢測方法依據(jù)。

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Determination of Fatty Acids in Aquatic Feed with Gas Chromatography by Using Internal Standard Method

Zhang Fengping1，2Luo Binyue1Du Xueli1Cao Jing2Liu Yaomin1
（Key Laboratory of Aquatic，Livestock，Poultry Nutrition and Healthy Culturing，Ministry of Agriculture，Tongwei Co.Ltd.1，Chengdu 610041）
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University2，Shanghai 201306）

A gas chromatographic method for determination of fatty acids in aquatic feed was established and tridecanoic acid was selected as the internal standard substance.The lipid of aquatic feed samplewas extracted by acidheatingmethod，saponified with KOH-CH3OH and the fatty acids were methylated with BF3-CH3OH.The obtained fatty acid methyl esterswere seperated by gas chromatography using a SPTM-2560 capillary column and analyzed by a flame ionization detector.Retention time of the peaks could be applied for quantative analysis.Internal standard method was used for quantitative analysis.The results showed that under the condition of selected chromatography，37 kinds of fatty acid methyl esters can separate wellwithin 65 min.Standard recovery rate ofmain 9 kinds of fatty acid was 88.4%～107.5%with relative standard deviation of2.28%～4.79% ，and the limit of quantitation（S／N＝10）was 2.0 mg／kg.The simple，effective and reproduciblemethod can be used for the fatty acids determination of a lot of aquatic feed samples.

gas chromatography，internal standard method，fatty acids，aquatic feed

S816.2

A

1003-0174（2015）01-0136-05

四川省科技支撐計(jì)劃（2011NZ0071）

2013-09-29

張鳳枰，男，1972年出生，高級工程師，食品飼料質(zhì)量安全檢測