和胃降逆方對非糜爛性反流病大鼠食管黏膜組織中肥大細(xì)胞類胰蛋白酶及相關(guān)因子表達(dá)的影響

劉佳麗，寇富舜，石 磊，王允亮，譚 祥，李曉紅，丁龐華，謝春娥，李軍祥

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100078)

非糜爛性反流病(non-erosive reflux disease，NERD)是常見的功能性消化系統(tǒng)疾病，臨床多存在反流、胃灼熱、胸痛或腹脹等典型的胃食管反流癥狀,亦有食管以外組織損傷而引起的咳喘等癥狀，發(fā)病率逐年上升[1]，嚴(yán)重影響患者的身心健康。NERD的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，研究發(fā)現(xiàn)，食管高敏感在NERD的發(fā)病中起著重要作用[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，平調(diào)寒熱的和胃降逆方在改善NERD 患者整體癥狀方面優(yōu)于奧美拉唑，且未見明顯不良反應(yīng)[3-4]。研究表明，消化系統(tǒng)出現(xiàn)功能異常時，活化的肥大細(xì)胞脫顆粒引起的致敏機(jī)制可特異性激活蛋白激酶2(protein kinase receptor 2，PAR2)，促使機(jī)體釋放P 物質(zhì)(substance P，SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)等神經(jīng)肽類物質(zhì)，誘導(dǎo)消化系統(tǒng)的內(nèi)臟傷害性感受器產(chǎn)生繼發(fā)性過敏，從而增加消化系統(tǒng)的內(nèi)臟高敏感狀態(tài)[5]。因此，本研究通過構(gòu)建內(nèi)臟高敏感性NERD大鼠模型，觀察和胃降逆方對其血清SP、CGRP、PAR2及食管黏膜組織中肥大細(xì)胞類胰蛋白酶(mast cell tryptase,MCT)表達(dá)的影響，并探討該方的最佳劑型及劑量。

1 材料與方法

1.1 實驗動物無特定病原體級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠48只，體質(zhì)量250～280 g，由斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供，許可證號：SCXK(京) 2016-0002。室溫22～24 ℃、相對濕度50%～60%和 12 h晝夜循環(huán)標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件下分籠飼養(yǎng)，常規(guī)飼料，自由飲水，適應(yīng)環(huán)境1周。

1.2 藥物和胃降逆方藥物組成：黃芩9 g、黃連6 g、干姜9 g、清半夏9 g、浙貝母9 g、蒲公英9 g、龍膽草9 g、枳實9 g、全瓜蔞9 g、炙甘草3 g，藥材購自北京同仁堂有限責(zé)任公司，水煎劑和顆粒劑由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院根據(jù)相應(yīng)的加工工藝由上述藥材加工制成。配方顆粒劑購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司。奧美拉唑腸溶片購自山東新時代藥業(yè)有限公司(國藥準(zhǔn)字H20044871)。

1.3 主要試劑與儀器卵清蛋白、40 g·L-1多聚甲醛購自北京索萊寶科技有限公司，氫氧化鋁佐劑購自美國Sigma公司，水合氯醛購自北京酷來搏科技有限公司，MC Tryptase購自美國OmnimAbs公司，9.79 mol·L-1過氧化氫購自北京華騰化工有限公司，非免疫山羊血清、生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體、辣根過氧化酶標(biāo)記鏈霉親和素、蘇木精染色液、免疫組織化學(xué)染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，SP、CGRP、PAR2酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；灌注泵購自保定蘭格恒流泵有限公司，離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，電熱恒溫培養(yǎng)箱購自黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司，病理石蠟包埋機(jī)購自沈陽龍首電子儀器有限公司，石蠟切片機(jī)購自北京弘泰嘉業(yè)有限公司，顯微鏡、攝像裝置、成像軟件系統(tǒng)購自香港麥克奧迪公司，自動洗板機(jī)購自北京拓普分析儀器有限公司，酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.4 動物分組及模型制備大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法將所有大鼠分為空白組、模型組、奧美拉唑組、和胃降逆方配方顆粒組(配方顆粒組)、和胃降逆水煎劑組(水煎劑組)及和胃降逆方顆粒劑高、中、低劑量組(顆粒劑高、中、低劑量組)，每組6只。模型組、奧美拉唑組、配方顆粒組、水煎劑組及顆粒劑高、中、低劑量組大鼠參照楊敏等[6]的方法，腹腔注射卵清蛋白和氫氧化鋁佐劑混懸液1.5 mL(含卵清蛋白100 mg、氫氧化鋁200 mg)，構(gòu)建內(nèi)臟高敏感性NERD大鼠模型；空白組大鼠于同時間點腹腔注射等量生理鹽水。24 h后，奧美拉唑組、配方顆粒劑組與水煎劑組大鼠基于課題組前期實驗結(jié)果選定最佳劑量濃度，按照10 mL·kg-1分別給予840 mg·L-1奧美拉唑蒸餾水溶液、850 g·L-1和胃降逆配方顆粒劑溶液、850 g·L-1和胃降逆方水煎劑溶液灌胃[7]，顆粒劑高、中、低劑量組大鼠按照10 mL·kg-1分別給予440、220、140 g·L-1的和胃降逆方顆粒溶液灌胃，每日1次，連續(xù)2周；空白組、模型組大鼠在同時間點給予10 mL·kg-1的蒸餾水灌胃；灌胃第12天夜間開始禁食不禁水，第14天大鼠經(jīng)35 g·L-1水合氯醛麻醉，平臥位固定于保溫的干凈泡沫板上，頭部抬高20°～30°，切開腹壁和胃壁，將一引流管放置在賁門處以收集從食管滴注的液體；將單腔灌流管經(jīng)口置于食管內(nèi)，導(dǎo)管內(nèi)端開口位于食管和胃交界處上2～3 cm，固定導(dǎo)管，外端與持續(xù)注射泵相連，使用0.1 mol·L-1鹽酸滴注；空白組大鼠給予蒸餾水食管滴注；滴注液溫度保持 37 ℃，速度10 mL·h-1，共50 min。灌注完成后，斷頸處死大鼠，在食管齒狀線 2 cm 處取各組大鼠食管黏膜組織 1 cm，40 g·L-1多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm 厚度冠狀面連續(xù)切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，觀察食管黏膜組織形態(tài)學(xué)變化，參照文獻(xiàn)[8]方法，根據(jù)模型組NERD大鼠食管黏膜炎性細(xì)胞浸潤、基底層增生、乳突延長、細(xì)胞間隙增寬情況確定NERD大鼠模型狀態(tài)。

1.5 ELSIA法檢測各組大鼠血清SP、CGRP、PAR2蛋白表達(dá)灌胃第14天，各組灌注結(jié)束后，經(jīng)腹主動脈取血5～8 mL,4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min，吸取上層血清分裝至EP管中，-80 ℃冰箱保存。根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書，用純化的抗體包被96孔板，制成固相載體，分別往包被抗SP、CGRP、PAR2抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗體SP、CGRP、PAR2、過氧化物酶標(biāo)記的親和素，徹底洗滌后，分別用ELISA試劑盒中的底物3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺顯色，在過氧化物酶催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，然后在酸作用下轉(zhuǎn)化為黃色，其顏色深淺與樣本中SP、CGRP、PAR2的表達(dá)呈正相關(guān)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定的吸光度值即代表樣本中SP、CGRP、PAR2的濃度。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠食管黏膜組織中MCT表達(dá)灌胃第14天，各組灌注結(jié)束，腹主動脈取血后，斷頸處死大鼠，在距食管齒狀線 2 cm處取大鼠食管黏膜組織1 cm，40 g·L-1多聚甲醛固定，石蠟包埋；脫蠟水化后經(jīng)過氧化氫阻斷,非免疫性山羊血清封閉,加一抗，4 ℃孵育過夜，用相應(yīng)的生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(150)37 ℃孵育40 min，50 μL辣根過氧化酶標(biāo)記鏈霉親和素溶液(1200)37 ℃孵育40 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，固定，拍照。食管黏膜鱗狀上皮層出現(xiàn)深棕黃色或褐色顆粒為MCT陽性表達(dá)，顏色深淺及分布面積與MCT陽性表達(dá)呈正相關(guān)，運用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)檢測每個樣本的吸光度值和染色區(qū)域總面積(area),MCT的單位面積相對表達(dá)量=吸光度值/area。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠食管黏膜組織病理學(xué)改變空白組大鼠食管黏膜鱗狀上皮細(xì)胞間隙緊密，無明顯炎性細(xì)胞浸潤、鱗狀上皮層增生等表現(xiàn)(圖1A)。模型組大鼠食管黏膜鱗狀上皮細(xì)胞間隙明顯增寬，鱗狀上皮層存在少量炎性細(xì)胞浸潤，乳突出現(xiàn)一定延長(圖1B)。奧美拉唑組及各中藥干預(yù)組大鼠可見增寬的細(xì)胞間隙不同程度減小或恢復(fù)，炎性細(xì)胞及鱗狀上皮層增生均不明顯(圖1C～圖1H)。

A：空白組；B：模型組；C：奧美拉唑組；D：配方顆粒劑組；E：水煎劑組；F：顆粒劑高劑量組；G：顆粒劑中劑量組；H：顆粒劑低劑量組。

圖1 各組大鼠食管黏膜組織病理學(xué)改變(HE染色，×100)

Fig.1 Pathological changes of esophageal mucosa of rats in each group (HE staining,×100)

2.2 各組大鼠血清SP、CGRP、PAR2蛋白水平比較結(jié)果見表1。與空白組比較，模型組大鼠血清SP、CGRP蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；模型組大鼠血清PAR2蛋白表達(dá)水平與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，奧美拉唑組、顆粒劑中劑量組大鼠血清SP蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；配方顆粒組、水煎劑組及顆粒劑高、低劑量組大鼠血清SP蛋白表達(dá)水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，奧美拉唑組及顆粒劑高、中劑量組大鼠血清CGRP蛋白表達(dá)水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；配方顆粒組、水煎劑組及顆粒劑低劑量組大鼠血清CGRP蛋白表達(dá)水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，顆粒劑高劑量組大鼠血清PAR2蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其余各用藥組大鼠血清PAR2蛋白表達(dá)水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與奧美拉唑組比較，其余各用藥組大鼠血清SP蛋白表達(dá)水平均有不同程度的升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；水煎劑組和顆粒劑低劑量組大鼠血清CGRP蛋白表達(dá)水平高于奧美拉唑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；顆粒配方劑組及顆粒劑高、中劑量組大鼠血清CGRP蛋白表達(dá)水平與奧美拉唑組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與奧美拉唑組比較，其余各用藥組大鼠血清PAR2蛋白表達(dá)水平均有不同程度上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清SP、CGRP、PAR2蛋白表達(dá)水平比較

Tab.1 Comparison of the serum levels of SP,CGRP and PAR2 protein in each group of rats

組別nSP/(ng·L-1)CGRP/(ng·L-1)PAR2/(ng·L-1)空白組670.67±10.5523.41(21.03～24.47)89.84±38.14模型組6129.90±3.06a61.29(56.71～66.86)a65.98±8.41奧美拉唑組691.05±5.14b28.56(23.50～30.01)c98.14±33.79配方顆粒劑組6110.41±33.6041.36(38.46～47.93)110.41±33.60水煎劑組6119.83±81.7443.75(39.38～54.62)d119.83±81.74顆粒劑高劑量組695.21±12.0027.46(26.91～28.79)c130.77±69.25b顆粒劑中劑量組691.55±13.85b24.85(23.17～32.74)c 110.53±40.882顆粒劑低劑量組6114.61±12.5456.17(51.90～60.55)e123.45±66.148

注：與空白組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.05，cP<0.01；與奧美拉唑組比較dP<0.05，eP<0.01。

2.3 各組大鼠食管黏膜組織中MCT表達(dá)比較空白組、模型組、奧美拉唑組、配方顆粒劑組、水煎劑組及顆粒劑高、中、低劑量組大鼠食管黏膜組織中MCT相對表達(dá)量分別為0.69±0.12、1.16±0.39、0.55±0.16、0.97±0.08、0.51±0.22、1.17±0.20、0.63±0.06、0.65±0.07。與空白組比較，模型組大鼠食管黏膜組織中MCT的相對表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，奧美拉唑組、水煎劑組及顆粒劑中、低劑量組大鼠食管黏膜組織中MCT相對表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；配方顆粒劑組、顆粒劑高劑量組大鼠食管黏膜組織中MCT相對表達(dá)量與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。配方顆粒劑組、顆粒劑高劑量組大鼠食管黏膜組織中MCT相對表達(dá)量高于奧美拉唑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；水煎劑組及顆粒劑中、低劑量組大鼠食管黏膜組織中MCT相對表達(dá)量與奧美拉唑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

胃食管反流病是一種常見的危害極大的慢性上消化道疾病[9-10]，已經(jīng)成為影響人類身心健康的疾病之一，其發(fā)病率不斷上升，其中NERD占該病發(fā)病的70%[1]。目前，NERD的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟高敏感是NERD的重要病理生理機(jī)制，在其發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[11]。NERD患者對質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors，PPI)治療反應(yīng)差，可能與PPI不能消除內(nèi)臟高敏感性有關(guān)[12]。深入研究內(nèi)臟高敏感的分子機(jī)制將為NERD的治療提供重要依據(jù)。NERD屬于中醫(yī)學(xué)“嘈雜”、“吞酸”的范疇[13-14]，病機(jī)多因寒熱錯雜、脾不升清、胃失和降，治以平調(diào)寒熱、和胃降逆。和胃降逆方由黃芩、黃連、清半夏、干姜、浙貝母、蒲公英、龍膽草、枳實、全瓜蔞、炙甘草組成，共奏寒熱并調(diào)，和胃降逆、散結(jié)除痞之功。

肥大細(xì)胞是多種介質(zhì)的有效來源，具有介導(dǎo)促炎、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用。在消化系統(tǒng)疾病中，激活后的肥大細(xì)胞能通過刺激消化道神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)內(nèi)臟敏感性，進(jìn)而影響消化道的運動功能[15]。在對反流性食管疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞活化或脫顆粒能特異性激活PAR2受體,引起SP和CGRP的釋放[16]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，NERD患者食管黏膜組織中肥大細(xì)胞存在活化、脫顆粒等改變，可能在NERD發(fā)病中起重要作用[17]。PAR2激活參與了神經(jīng)遞質(zhì)和炎性因子釋放活動，可增加上皮通透性，調(diào)節(jié)內(nèi)臟高敏感狀態(tài)和疼痛[18]。本課題組前期研究也證實，和胃降逆方能通過下調(diào)NERD大鼠的5-羥色胺受體等神經(jīng)遞質(zhì)而調(diào)節(jié)內(nèi)臟高敏感狀態(tài)[19]。基于此，本研究對NERD大鼠給予和胃降逆方干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NERD大鼠食管黏膜組織中MCT及血清SP、CGRP蛋白表達(dá)有不同程度下降，PAR2蛋白的表達(dá)尚存在一定爭議，提示和胃降逆方可能通過多靶點起到有效治療NERD的作用。

SP和CGRP是傷害性刺激傳入神經(jīng)元局部釋放的炎性介質(zhì)，參與傳入神經(jīng)通路的高敏感，不僅存在于人類和其他哺乳動物的皮膚，也存在于內(nèi)臟器官[20-21]。SP是由神經(jīng)元分泌的肽類物質(zhì)，參與感受傷害性刺激及炎癥等生物過程[22]。在受到傷害性刺激時，肥大細(xì)胞脫顆粒所引起的繼發(fā)性反應(yīng)是由初級感覺神經(jīng)末梢刺激后從感覺神經(jīng)元末梢釋放的神經(jīng)肽類物質(zhì)所引起。釋放的SP除了參與局部血管擴(kuò)張外，又能反作用于肥大細(xì)胞，誘導(dǎo)其釋放組胺，進(jìn)而激活其他感覺神經(jīng)末梢，加重感覺刺激[23]。CGRP也是一種神經(jīng)肽，在消化系統(tǒng)功能性的內(nèi)臟傳入神經(jīng)敏化中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，NERD患者食管上皮組織中CGRP和SP表達(dá)增加，提示CGRP和SP是治療NERD的潛在作用靶點[24]。

PAR2是跨膜G蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員，表達(dá)于整個消化系統(tǒng)的上皮細(xì)胞以及腰椎區(qū)的外周和脊髓傳出神經(jīng)元[25]，因其易被胰蛋白酶在內(nèi)的絲氨酸蛋白酶特異性激活，使其有別于大多數(shù)的家族成員。研究證實，在消化系統(tǒng)中，PAR2的激活與內(nèi)臟痛覺過敏、通透性增加、運動等有關(guān)[26]。相關(guān)研究表明，PAR2的激活可能在NERD發(fā)病過程中起重要作用，將PAR2作為NERD的潛在治療靶點是必要的[27]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠食管黏膜鱗狀上皮層呈現(xiàn)出不同程度的細(xì)胞間隙增寬、少量炎細(xì)胞浸潤及乳突延長，而各用藥組大鼠病變較輕，提示卵清蛋白基礎(chǔ)致敏聯(lián)合酸灌注能夠誘導(dǎo)內(nèi)臟高敏感大鼠模型，而和胃降逆方能夠緩解NERD大鼠的病理變化。另外，模型組大鼠血清SP、CGRP蛋白表達(dá)水平顯著高于空白組，提示NERD大鼠出現(xiàn)SP、CGRP等敏感物質(zhì)的釋放；經(jīng)藥物干預(yù)后，與模型組比較，奧美拉唑組、顆粒劑中劑量組大鼠血清SP蛋白表達(dá)水平下降，奧美拉唑組及顆粒劑中、高劑量組大鼠血清CGRP蛋白表達(dá)水平顯著下降；而水煎劑組大鼠血清中CGRP蛋白表達(dá)水平顯著高于奧美拉唑組，顆粒劑中、高劑量組大鼠血清CGRP蛋白表達(dá)水平與奧美拉唑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；綜合以上結(jié)果，提示顆粒劑中劑量組在調(diào)節(jié)SP、CGRP釋放方面的效果最佳。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清PAR2表達(dá)水平低于空白組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此，PAR2作為和胃降逆方治療NERD的特異性靶點的設(shè)想有待進(jìn)一步研究證實；模型組大鼠食管黏膜組織中MCT表達(dá)顯著高于空白組，提示NERD大鼠存在肥大細(xì)胞激活的狀況。經(jīng)藥物干預(yù)后，奧美拉唑組、水煎劑組及顆粒劑低、中劑量組大鼠食管黏膜組織中MCT相對表達(dá)量顯著低于模型組，其余各用藥組大鼠食管黏膜組織中MCT相對表達(dá)量雖較模型組有不同程度下降，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；另外，配方顆粒劑組、顆粒劑高劑量組大鼠食管黏膜組織中MCT相對表達(dá)量高于奧美拉唑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；水煎劑組、顆粒劑中劑量組大鼠食管黏膜中MCT相對表達(dá)量與奧美拉唑組接近，提示水煎劑、中劑量顆粒劑抑制肥大細(xì)胞激活的效果更佳。

綜上所述，和胃降逆方可一定程度減輕NERD模型大鼠食管黏膜組織炎性增生及細(xì)胞間隙增寬的狀態(tài)，其機(jī)制可能與抑制食管黏膜組織中肥大細(xì)胞激活，降低血清SP、CGRP等神經(jīng)肽類物質(zhì)的表達(dá)，從而緩解內(nèi)臟高敏感狀態(tài)有關(guān)；同時，通過對和胃降逆方不同劑型和濃度的觀察，發(fā)現(xiàn)220 g·L-1和胃降逆方顆粒劑對NERD大鼠的改善效果最佳。