L-絲氨酸的微生物法制備研究進(jìn)展*

朱林江，李崎

1(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無(wú)錫，214122)

L-絲氨酸屬于非必需氨基酸，但具有重要的生理功能和應(yīng)用價(jià)值，已被應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域，包括醫(yī)藥領(lǐng)域的氨基酸輸液和滴眼液，食品領(lǐng)域的飲料添加劑以及化妝品領(lǐng)域的天然保濕因子等。其生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、蛋白水解法、酶的生物轉(zhuǎn)化法、微生物細(xì)胞的前體轉(zhuǎn)化和微生物直接發(fā)酵法等［1］。目前，主要的生產(chǎn)方式是微生物前體轉(zhuǎn)化，但生產(chǎn)成本偏高，使L-絲氨酸的價(jià)格仍保持較高水平，其中醫(yī)藥級(jí)的L-絲氨酸價(jià)格約為40美元/kg。與其他氨基酸不同，L-絲氨酸是細(xì)胞中心代謝的產(chǎn)物，而非典型的代謝途徑末端產(chǎn)物，胞內(nèi)代謝運(yùn)轉(zhuǎn)速度較快，其生物制備難度較大。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是代謝工程、合成生物學(xué)和基因組工程的快速發(fā)展，人們對(duì)工業(yè)微生物的生理和代謝改造能力進(jìn)一步加強(qiáng)，能夠重構(gòu)各種化合物的合成途徑，包括氨基酸、有機(jī)酸、新型能源化合物以及生物材料等等［2-3］。因此，通過微生物直接利用廉價(jià)的糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的制備方法重新受到關(guān)注。通過實(shí)時(shí)代謝通量分析，解析了L-絲氨酸中心代謝流的部分特征［4］;通過代謝工程方法，提高了微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸的能力，產(chǎn)量達(dá)到了35 g/L以上［5-6］。本文從 L-絲氨酸作為中心代謝產(chǎn)物的特征、微生物前體轉(zhuǎn)化制備方法以及絲氨酸合成途徑的代謝工程改造3個(gè)方面闡述其相關(guān)研究進(jìn)展，并探討存在的問題。

1 L-絲氨酸的中心代謝產(chǎn)物特征

許多氨基酸的合成途徑較為復(fù)雜，但一般是合成代謝途徑的末端產(chǎn)物，分解途徑較為簡(jiǎn)單。而L-絲氨酸的合成途徑剛好相反，如圖1所示。

圖1在微生物細(xì)胞內(nèi)的典型L-絲氨酸合成途徑中，合成步驟較為簡(jiǎn)單:即葡萄糖經(jīng)過EMP途徑，到關(guān)鍵的L-絲氨酸合成前體3-磷酸甘油酸(3-BG)，再通過3步的酶促反應(yīng)生成L-絲氨酸。這3步反應(yīng)分別是:①NAD+依賴的3-磷酸甘油酸脫氫酶(PGDH)催化氧化3-BG生成3-羥磷酸丙酮;②在磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(PSAT)催化下進(jìn)行轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，生成3-磷酸絲氨酸;③最后，由磷酸絲氨酸磷酸酶(PSP)催化生成L-絲氨酸。這一簡(jiǎn)單的合成途徑，同樣存在著典型的氨基酸反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。如在谷氨酸棒桿菌中［4］，PGDH受到L-絲氨酸的反饋調(diào)節(jié)，其調(diào)控活性中心均位于酶的C-端，與天冬氨酸脫氫酶、高絲氨酸脫氫酶和蘇氨酸脫氫酶等氨基酸合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶相似，可通過點(diǎn)突變消除L-絲氨酸的反饋抑制作用。

圖1 胞內(nèi)L-絲氨酸的合成代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of L-serine synthesis in microbial cell

盡管L-絲氨酸的合成代謝途徑較為簡(jiǎn)單，但在胞外過量積累的難度卻較大。這是由于L-絲氨酸存在復(fù)雜的分解代謝途徑，并參與了胞內(nèi)C-1活性單元的循環(huán)，即屬于胞內(nèi)中心代謝產(chǎn)物。如圖1所示，L-絲氨酸是許多胞內(nèi)化合物合成的前體物，包括甘氨酸、半胱氨酸、色氨酸等氨基酸，嘌呤、胸腺嘧啶之類的核酸堿基以及磷脂酰絲氨酸(磷脂合成)。通過同位素示蹤實(shí)驗(yàn)證實(shí)，若胞內(nèi)過量積累絲氨酸，會(huì)迅速地被絲氨酸脫水酶L-SerDH催化生成丙酮酸，進(jìn)入細(xì)胞的主代謝流［7］。此外，絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)與四氫葉酸共同作用，將L-絲氨酸被轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼?，此反?yīng)為細(xì)胞提供了重要的C-1單元化合物N5，N10-亞甲基四氫葉酸。該C-1化合物可進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為其他活性的C-1單元化合物，包括5-甲基四氫葉酸和10-甲基四氫葉酸。這3種C-1活性化合物參與胞內(nèi)多種重要化合物的合成，包括蛋氨酸、嘧啶、D-泛酸和tRNAfMet。隨后重新被轉(zhuǎn)化為四氫葉酸，完成1次C-1單元的循環(huán)。由于C-1循環(huán)參與了這些胞內(nèi)重要代謝物的合成，使SHMT的表達(dá)是細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的［8］。在E.coli中，通過SHMT的碳代謝流通量被估計(jì)占總EMP途徑通量的15%。而在谷氨酸幫桿菌中，流經(jīng)絲氨酸的碳代謝通量占全細(xì)胞葡萄糖碳代謝通量的7.5%［9］。所以，L-絲氨酸合成代謝途徑，除了具有典型的氨基酸合成途徑中的反饋調(diào)節(jié)和支路競(jìng)爭(zhēng)等之外，同時(shí)還為細(xì)胞提供重要生物活性的C-1單元，是胞內(nèi)重要的中心代謝產(chǎn)物。所以，L-絲氨酸在胞內(nèi)的代謝運(yùn)轉(zhuǎn)速度極快，參與胞內(nèi)C-1單元循環(huán)，部分降解分支途徑不能直接刪除，極大地增加生物法制備L-絲氨酸的難度。

2 L-絲氨酸的微生物前體轉(zhuǎn)化制備方法

由于L-絲氨酸在胞內(nèi)的中心代謝物特征，通過傳統(tǒng)氨基酸生產(chǎn)菌選育方法難以得到高產(chǎn)菌株，比如用氨基酸結(jié)構(gòu)類似物消除反饋抑制和營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株篩選等方法，只能選育得到數(shù)克每升合成能力的突變菌株［10］。由此，人們轉(zhuǎn)向了微生物前體轉(zhuǎn)化的方法制備L-絲氨酸，即利用SHMT催化反應(yīng)的逆反應(yīng)，將較為便宜的前體物如甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸。該逆反應(yīng)是將外加的甘氨酸和胞內(nèi)活性C-1單元N5，N10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸和四氫葉酸。為使微生物細(xì)胞實(shí)現(xiàn)這種逆反應(yīng)，并過量積累絲氨酸，需要選育甘氨酸耐受性的菌株，同時(shí)能夠利用簡(jiǎn)單的C-1單元化合物(如甲醇或甲醛)取代胞內(nèi)合成的活性C-1單元化合物。后來(lái)發(fā)現(xiàn)一些甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌具備這種代謝特征，它們的SHMT能夠以外加的簡(jiǎn)單C-1單元化合物為底物合成絲氨酸，如一些假單胞菌(Pseudomonas)、石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacter paraffineus)、嗜甲基生絲微菌(Hyphomicrobium methylovorum)、球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)和白八疊球菌(Sarcina albida)等［6，10］。這些細(xì)菌被證實(shí)能夠通過乙醛酸循環(huán)和絲氨酸循環(huán)，如圖2所示，吸收胞外的C-1單元化合物作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，合成丙酮酸，提供細(xì)胞的生長(zhǎng)［11］。所以改造這些甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌，可應(yīng)用前體物甘氨酸、C-1單元化合物甲醇或甲醛，通過SHMT介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)換的方法制備L-絲氨酸。

選育的微生物前體物轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)L-絲氨酸的菌株包括［6］:①假單胞菌3ab，在甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中，將甘氨酸轉(zhuǎn)化為絲氨酸，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到50%，絲氨酸產(chǎn)量約7 g/L;②假單胞菌MS31，同樣利用甲醇，通過選育，降低絲氨酸的降解，使產(chǎn)量可達(dá)24 g/L;③嗜甲基生絲微菌GM2，利用甲醇，經(jīng)過提高甲醇脫氫酶和SHMT的活性，并結(jié)合分批次補(bǔ)料和穩(wěn)定期細(xì)胞的發(fā)酵策略，合成了45 g/L的絲氨酸，其甘氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為50%［12］;④球形節(jié)桿菌和白八疊球菌，可積累21 g/L的絲氨酸。以上選育的菌株均能直接利用胞外簡(jiǎn)單的C-1化合物，L-絲氨酸產(chǎn)量得到了顯著提高，但甘氨酸轉(zhuǎn)化率并不高，增加了絲氨酸的生產(chǎn)成本。后來(lái)選育了1株具有較高轉(zhuǎn)化率的甲基營(yíng)養(yǎng)型(Methylobacterium sp.)菌株MN43，利用甲醇，將甘氨酸轉(zhuǎn)化為絲氨酸的效率接近93%，且能夠合成65 g/L的絲氨酸，具備了良好的生產(chǎn)性能［13］。由于高濃度的甘氨酸會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)以及絲氨酸在胞內(nèi)降解的不可避免性，由此衍生出了另一種微生物轉(zhuǎn)化的方法，即利用過量表達(dá)了SHMT酶的滲透性細(xì)胞或裂解的胞漿，將甘氨酸直接轉(zhuǎn)化合成絲氨酸，消除L-絲氨酸的降解反應(yīng)。其典型的例子是產(chǎn)氣克氏桿菌(Klebsiella aerogenes)［14］，通過胞內(nèi)高效過量表達(dá)E.coli來(lái)源的SHMT，使表達(dá)的酶蛋白占細(xì)胞總蛋白的10%，并將30 g/L的高密度細(xì)胞滲透化或破碎，添加一定濃度的四氫葉酸和甲醛的條件下，高效轉(zhuǎn)化甘氨酸為絲氨酸，其轉(zhuǎn)化率達(dá)到88%，且絲氨酸產(chǎn)量達(dá)到了450 g/L。不過，該方法的原料成本和胞漿制作成本相對(duì)較高。隨著分子生物學(xué)方法在工業(yè)菌株改造中的廣泛應(yīng)用，近幾年，針對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌利用C-1化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-絲氨酸的特征，已有遺傳改造的研究報(bào)到，即通過表達(dá)載體提高胞內(nèi)SHMT表達(dá)水平，從而顯著性提高L-絲氨酸的產(chǎn)率［15］;或是篩選不同生物來(lái)源的高活性SHMT 酶，如海藻希瓦氏菌［16］和變形假單胞菌［17］，應(yīng)用于甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌中，提高其L-絲氨酸轉(zhuǎn)化效率。

3 從糖質(zhì)原料發(fā)酵制備L-絲氨酸

圖2 甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌固定化甲醇和甲醛的絲氨酸循環(huán)和乙醛酸再生循環(huán)Fig.2 Methanol and formaldehyde fixation via the serine cycle and glyoxylate regeneration cycle in methylotrophs

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，人們對(duì)微生物的改造能力不斷增強(qiáng)，采用低成本的糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的微生物直接發(fā)酵法重新受到關(guān)注。目前，已通過傳統(tǒng)誘變育種和代謝工程相結(jié)合的方法，選育了一些具有工業(yè)應(yīng)用潛力的L-絲氨酸生產(chǎn)菌株，從葡萄糖或蔗糖直接發(fā)酵合成L-絲氨酸。其中典型菌株包括:①德國(guó)的Eggeling課題組通過代謝工程策略，改造谷氨酸幫桿菌的模式菌株Corynebacterium glutamicum ATCC 13032，成為了1株性能良好的L-絲氨酸生產(chǎn)菌株。其主要策略包括解除了L-絲氨酸合成途徑關(guān)鍵酶PGDH的反饋抑制、強(qiáng)化從3-磷酸甘油酸合成絲氨酸的合成途徑、消除絲氨酸脫水酶LSerDH介導(dǎo)的降解途徑和調(diào)節(jié)C-1單元循環(huán)等，最終使谷氨酸棒桿菌在簡(jiǎn)單的葡萄糖培養(yǎng)基中，胞外積累35 g/L 以上的 L-絲氨酸［5，18］，也有報(bào)道其產(chǎn)量已達(dá)到了50 g/L［6］。②由許正宏課題組選育的谷氨酸棒桿菌SYPS-062，該菌株通過多次誘變育種和相似的代謝工程策略，即消除反饋抑制、強(qiáng)化合成途徑、消弱降解途徑等，使該菌株能夠在蔗糖的簡(jiǎn)單培養(yǎng)基中，合成25 g/L以上的絲氨酸，但其副產(chǎn)物丙氨酸和纈氨酸積累較高［19-20］。通過發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，產(chǎn)量也已達(dá)到30 g/L的水平。③新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物所保藏有1株黃色短桿菌S112(Brevibacterium flavum)，通過誘變育種和遺傳育種相結(jié)合，解除了反饋抑制和擴(kuò)增上游的合成路徑，使該菌株合成絲氨酸的能力達(dá)到了18 g/L［21］，具備良好的工業(yè)應(yīng)用潛力。④其他一些通過代謝工程改造的菌株，包括解除反饋抑制和減弱降解途徑的谷氨酸奉桿菌SER-8［22］和大腸桿菌NW-7［23］，但其 L-絲氨酸合成水平均較低。

以上選育的L-絲氨酸生產(chǎn)菌，主要通過代謝工程方法進(jìn)行改造，其主要策略包括:(1)消除合成途徑中的反饋抑制。在谷氨酸幫桿菌中，PDGH由serA基因編碼，含有530個(gè)氨基酸，其C-端部分序列與催化功能無(wú)關(guān)，但被證實(shí)包含L-絲氨酸的變構(gòu)調(diào)節(jié)中心。通過刪除第197個(gè)氨基酸，可完全消除絲氨酸的反饋抑制，同時(shí)不影響催化活性［4］。而在大腸桿菌中，通過改造PDGH的His344和Asn346兩個(gè)位點(diǎn)為丙氨酸，可消除絲氨酸的反饋抑制［23］。(2)強(qiáng)化上游的合成途徑，主要是過量表達(dá)serB和serC以及經(jīng)過改造serA。(3)消弱L-絲氨酸的降解途徑。主要涉及兩條降解途徑，即絲氨酸脫氫酶(sdaA編碼)催化其轉(zhuǎn)換為丙酮酸，從而進(jìn)入主代謝流，通過刪除sdaA可有效地降低絲氨酸的降解速率;通過SHMT酶(glyA編碼)催化其轉(zhuǎn)化為甘氨酸，由于該酶是細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的，所以通過減弱glyA的表達(dá)或采用人工誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制其表達(dá)，可有效地阻止絲氨酸的降解，但也會(huì)降低細(xì)胞的生長(zhǎng)速率［18，24］。(4)C-1 單元循環(huán)的調(diào)控。該策略是通過調(diào)控SHMT催化反應(yīng)中的輔因子四氫葉酸的合成水平，從而有效控制絲氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸反應(yīng)。即通過刪除四氫葉酸合成途徑中的pabAB基因，降低胞內(nèi)四氫葉酸的濃度，使其成為生長(zhǎng)的限制性因子，有效地減弱L-絲氨酸的降解速率，使其在發(fā)酵初期便開始積累，提高了生產(chǎn)速率［5，25］。細(xì)胞生長(zhǎng)所需的四氫葉酸，則以外加葉酸的方式或添加復(fù)合發(fā)酵培養(yǎng)基的方法，如玉米漿等［5］，用于發(fā)酵過程的優(yōu)化控制。這種應(yīng)用維生素為限制性因子，促進(jìn)目的代謝產(chǎn)物的積累，已成為代謝工程改造的一個(gè)新策略，被應(yīng)用到其他氨基酸的合成中，如限制泛酸的濃度，提高纈氨酸的合成［26］。

通過以上代謝工程策略，使菌株生產(chǎn)中心代謝產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸的能力顯著提高。其中，改造中心代謝產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸合成途徑的特殊策略是以四氫葉酸作為限制性輔因子對(duì)其合成進(jìn)行改造，取代了胞內(nèi)重要代謝酶的調(diào)控，同時(shí)刪除了sadA介導(dǎo)的降解分支，不但積累高濃度的絲氨酸，而且保持較好的生長(zhǎng)速率。不過，絲氨酸代謝工程改造中仍有存在一些問題亟待解決，比如副產(chǎn)物積累的問題，即部分碳流通過EMP途徑流經(jīng)丙酮酸，從而形成副產(chǎn)物，比如丙氨酸和纈氨酸［27-28］;當(dāng)胞外糖源濃度下降時(shí)，細(xì)胞開始利用胞外積累的絲氨酸作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，造成發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛入y以降低到較低水平，不利于工業(yè)生產(chǎn)，所以需要進(jìn)一步調(diào)控生產(chǎn)菌株降解絲氨酸性能;此外生產(chǎn)菌株的轉(zhuǎn)化率有待進(jìn)一步提高。針對(duì)以上這些問題，需要我們應(yīng)用系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)絲氨酸作為中心代謝物在細(xì)胞能量代謝、C-1單元活性化合物循環(huán)和其他潛在的合成途徑中所起的作用［29］，更好地解決中心代謝產(chǎn)物積累的技術(shù)難題;將系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)與L-絲氨酸發(fā)酵條件優(yōu)化相結(jié)合，理解溶氧水平、碳代謝流方向以及輔酶平衡等因素對(duì)L-絲氨酸胞外積累的影響;同時(shí)需要借助最新發(fā)展的高效的基因組工程技術(shù)［2］，包括已經(jīng)在谷氨酸棒桿菌中實(shí)現(xiàn)了的寡核苷酸介導(dǎo)的多位點(diǎn)基因組同步修飾技術(shù)［30］，對(duì)生產(chǎn)菌株的基因組進(jìn)行高效改造;增強(qiáng)菌株利用不同糖質(zhì)原料的能力，包括淀粉、木糖等［31-32］，降低微生物發(fā)酵制備L-絲氨酸的成本。

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