采用ATP生物發(fā)光法分析6株常見細菌ATP含量差異

田雨，侯玉柱，柯潤輝，尹建軍，宋全厚

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

ATP生物發(fā)光法是新近發(fā)展起來的一種微生物快速檢測技術［1］，具有快速、簡單、經(jīng)濟的特點［2］，目前主要應用在食品生產(chǎn)企業(yè)的日常衛(wèi)生管控方面［3-4］，它與涂抹法結合可快速測定食品生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)各個衛(wèi)生關鍵控制點的衛(wèi)生狀況［5-6］，快速評估，及時發(fā)現(xiàn)問題，降低微生物污染發(fā)生的可能性［7-8］。

由于ATP生物發(fā)光法無法定性鑒別細菌種類［9-12］，因此不同細菌 ATP 含量是否一致［13-14］，對該方法的檢測結果影響較大。鑒于此，本研究以ATP生物發(fā)光法為基礎，輔以GB4789.2-2010方法，選擇大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、乳酸鏈球菌、乳酸片球菌等6種常見細菌，分析和對比不同常見細菌中ATP含量的差異性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株

大腸埃希氏菌(CICC10389、CICC20234);枯草芽孢桿菌(CICC10275);蠟狀芽孢桿菌(CICC20511);乳酸鏈球菌(CICC20711);乳酸片球菌(CICC20719)。

1.1.2 儀器與試劑

ATP熒光檢測儀(SF0012型)，購于中質賽福(北京)科技儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱;渦旋振蕩器;高壓滅菌鍋。

ATP標準品(三磷酸腺苷二鈉鹽);復合熒光試劑(產(chǎn)品編號ZF0011)，購于中質賽福(北京)科技儀器有限公司;平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(PCA);無菌生理鹽水;無菌水。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立6株細菌的菌落總數(shù)(CFU/mL)與ATP熒光值(RLU/50μL)的數(shù)學模型

自冷藏的斜面培養(yǎng)基中挑取6株細菌——大腸埃希氏菌(CICC10389、CICC20234)、枯草芽孢桿菌(CICC10275)、蠟狀芽孢桿菌(CICC20511)、乳酸鏈球菌(CICC20711)、乳酸片球菌(CICC20719)，分別劃線接種于培養(yǎng)皿中，36℃培養(yǎng)24 h。將10 mL無菌生理鹽水注入已劃線培養(yǎng)24 h的平皿培養(yǎng)基表面，打散其上的菌落并收集于無菌玻璃試管中，振蕩搖勻，作為菌懸液原液。吸取每株細菌的菌懸液原液各1 mL放入無菌玻璃試管中，加4 mL生理鹽水混合均勻，配制成稀釋度為10-1的6株細菌的混合液。以無菌生理鹽水10倍梯度稀釋各細菌的菌懸液原液及其混合液，配制成10-1～10-8梯度稀釋菌液。吸取 10-6、10-7、10-8梯度稀釋菌液各 1 mL，按照GB4789.2-2010測定其菌落總數(shù)。再吸取各菌株及其混合菌液的梯度稀釋液各50 μL于樣品杯中，加25 μL復合熒光試劑，放入ATP熒光檢測儀中測定其熒光值。以菌液的菌落總數(shù)(CFU/mL)及ATP熒光值(RLU/50μL)建立數(shù)學模型。

1.2.2 建立ATP標準溶液濃度與其熒光值的數(shù)學模型

稱取ATP標準品0.055 1 g，以無菌水定容于100 mL容量瓶，即得10-6mol/mL的ATP基礎溶液。吸取ATP基礎溶液1 mL，以無菌水定容于100 mL容量瓶，即得10-8mol/mL的ATP基礎稀釋溶液。對10-8mol/mL的ATP基礎稀釋溶液進行10倍梯度稀釋，配制濃度為10-9～10-13mol/mL的ATP標準系列溶液。吸取ATP標準系列溶液各50 μL于樣品杯中，加25 μL復合熒光試劑，以微量熒光檢測儀測定其熒光值。根據(jù)ATP標準系列溶液的濃度(mol/mL)與相應的熒光值(RLU/50μL)，建立數(shù)學模型。

2 結果與分析

2.1 各細菌的ATP熒光值(RLU/50μL)與菌落總數(shù)(CFU/mL)的關系

分別測定大腸埃希氏菌(CICC10389、CICC20234)、枯草芽孢桿菌(CICC10275)、蠟狀芽孢桿菌(CICC20511)、乳酸鏈球菌(CICC20711)、乳酸片球菌(CICC20719)等6株細菌的ATP熒光值和菌落總數(shù)，由于每次可測得5～6對數(shù)據(jù)，為獲得統(tǒng)計學中的大樣本數(shù)量(n≥30)，多次重復測定，保證每株細菌測得30對或30對以上的數(shù)據(jù)用于建立數(shù)學模型。表1內是6株細菌及其混合菌液的菌落總數(shù)對數(shù)值［log10(CFU/mL)］與ATP熒光值對數(shù)值［log10(RLU)］的數(shù)學模型，由表1的數(shù)學模型，可計算出6株細菌在相同熒光值下對應的菌落總數(shù)，見表2。

表1 六株細菌的菌落總數(shù)與ATP熒光值的數(shù)學模型Table 1 Mathematical models between aerobic plate count and ATP fluorescence value of six strains

表2 六株細菌及其混合物在不同ATP熒光值下的菌落總數(shù)CFU/mLTable 2 Aerobic plate counts of six strains and their mixture with different ATP fluorescence values CFU/mL

由表2可知，當熒光值為100時，6株細菌及其混合物的菌落總數(shù)基本維持在104CFU/mL左右，并且隨著熒光值的10倍遞增，菌落總數(shù)也呈現(xiàn)10倍遞增趨勢，當熒光值達到1 000 000(儀器的最大量程為7位數(shù))時，菌落總數(shù)始終保持在108CFU/mL的水平。因此，當熒光值相同時，無論是單一純菌樣品還是含有多種混合細菌的樣品，其菌落總數(shù)都保持在相同或相近的數(shù)量級上。

為了進一步確認在ATP熒光值均相同的情況下，6株細菌及其混合菌液的菌落總數(shù)是否存在明顯差異，對表2中6株細菌的菌落總數(shù)進行無重復的雙因素方差分析，結果見表3。

由表 3可知，F(xiàn)行=8.13＞F行crit=2.87，P=4.62×10-4＜0.05，表示當 ATP熒光值(在100～1 000 000RLU/50 μL范圍內)數(shù)量級不同時，實驗所用的6株細菌的菌落總數(shù)有明顯差異。即ATP熒光值的數(shù)量級對各細菌的菌落總數(shù)有顯著影響。而F列=1.31＜F列crit=2.71，P=0.30＞0.05，表示當 ATP熒光值(在100～1 000 000 RLU/50μL范圍內)相同時，各細菌的菌落總數(shù)無顯著差異。即細菌的種類雖然會導致ATP生物發(fā)光法所測得的菌落總數(shù)各不相同，但差異并不明顯，不會對菌落總數(shù)的報告結果產(chǎn)生顯著影響。

表3 六株細菌在相同熒光值下的菌落總數(shù)的無重復雙因素方差分析CFU/mLTable 3 No repeat two-way ANOVA of aerobic plate counts of six strains and their mixture with same ATP fluorescence value CFU/mL

2.2 ATP濃度與熒光值的關系

表4 ATP標準溶液濃度與相應的熒光值Table 4 Concentration of ATP standard solution and their fluorescence value

根據(jù)ATP濃度的對數(shù)值和熒光值的對數(shù)值建立數(shù)學模型，如圖1。

圖1 ATP標準溶液濃度與其相應熒光值的數(shù)學模型Fig.1 A mathematical model between concentration of ATP standard solution and their fluorescence values

可知ATP含量與其熒光值的相關數(shù)學模型為:

Y=0.968 5X+15.443 4

其中，Y為ATP熒光值的對數(shù)值［log10(RLU)］;X為ATP標準溶液濃度的對數(shù)值［log10(mol/mL)］;二者相關系數(shù)(R2)為0.994 3，數(shù)學模型線性良好。

2.3 各細菌的菌落總數(shù)與ATP濃度的關系

將ATP濃度與熒光值的數(shù)學模型Y=0.968 5X+15.443 4(見圖1)代入表1中的6株菌落總數(shù)與熒光值的數(shù)學模型，可推導出株菌落總數(shù)對數(shù)與ATP濃度對數(shù)值的數(shù)學模型，見表5。

表5 六株細菌的菌落總數(shù)與ATP含量的數(shù)學模型Table 5 Mathematical models between aerobic plate count and ATP content

根據(jù)表5中的數(shù)學模型，可計算不同菌落總數(shù)水平下的各細菌ATP含量(mol)。但由于受本研究所使用的ATP熒光檢測儀量程所限(見表2)，僅選取104～108CFU/mL(與ATP熒光檢測儀100～1 000 000 RLU的量程相對應)共5個數(shù)量級的菌落總數(shù)，代入表5的數(shù)學模型進行計算。

表6 六株細菌在不同菌落總數(shù)下的ATP含量Table 6 ATP contents of six strains with different aerobic plate counts

由表6可知，6株細菌的ATP含量均隨菌落總數(shù)的10倍增長而逐級提高，當菌落總數(shù)為104CFU/mL時，6種細菌的ATP總量基本都在10-14mol/mL的水平。當菌落總數(shù)為108CFU/mL時，6種細菌的ATP總量基本都在10-10mol/mL的水平。雖然大部分細菌的ATP總量并不是絕對嚴格地隨菌落總數(shù)的10倍遞增，其兩位有效數(shù)字往往有所不同;但當菌落總數(shù)相同時，各細菌的ATP含量都在相同或相近的數(shù)量級上。

為確定在菌落總數(shù)均相同的情況下，6株細菌的ATP總含量是否存在顯著差異，對表6中的數(shù)據(jù)進行無重復的雙因素方差分析，結果如下:

由表7可知，F(xiàn)行=10.11＞F行crit=2.87，P=1.21×10-5＜0.05，表示當菌落總數(shù)的數(shù)量級(1～108CFU/mL)不同時，實驗所用的6株株細菌的ATP總含量有明顯的差異。即菌落總數(shù)的數(shù)量級對各細菌的ATP總含量有顯著影響。而F列=1.24＜F列crit=2.71，P=0.33＞0.05，表示當菌落總數(shù)相同時，不同細菌的ATP含量無明顯差異。即細菌的種類不會對ATP生物發(fā)光法所測得的各細菌的ATP總含量產(chǎn)生顯著影響。而根據(jù)圖1中的數(shù)學模型，ATP含量與其熒光值線性相關(R2=0.994 3)，因此雖然6株細菌種屬不同，但當其菌落總數(shù)相同時，所測定的ATP熒光值無明顯差異。

表7 六株細菌在不同菌落總數(shù)下的ATP含量的無重復因素方差分析mol/LTable 7 No repeat two-way ANOVA of ATP contents of six strains with different aerobic plate counts mol/L

3 結論

目前，對ATP生物發(fā)光法的研究，多集中在溫度、pH值、提取劑等外在因素對微生物檢測結果的影響［15-16］，關于不同種類細菌中ATP含量的研究較為稀少［17］。張國龍［18］、張虹妍［19］等為了驗證抗結核藥物的作用，曾以ATP生物發(fā)光法測定結核分枝桿菌的ATP含量，但并未橫向比對不同細菌種類之間的差別。本研究分析和比對了大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、乳酸鏈球菌、乳酸片球菌等6株常見細菌的ATP含量，這對ATP生物發(fā)光法的實際應用具有重要意義——在使用該方法快速檢測樣品的細菌數(shù)量時，可以忽略體積相似或相近的細菌的種屬差異，根據(jù)數(shù)學模型推算菌落總數(shù)，為食品生產(chǎn)加工企業(yè)的衛(wèi)生管控提供快速、準確的技術支撐。

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