維甲酸誘導基因G慢病毒表達載體的構(gòu)建及對肺癌細胞A549的影響

吳軍錄，權(quán)文強，姚懿雯，萬海英，李 冬

同濟大學附屬同濟醫(yī)院檢驗科，上海 200065

維甲酸誘導基因G慢病毒表達載體的構(gòu)建及對肺癌細胞A549的影響

吳軍錄，權(quán)文強，姚懿雯，萬海英，李 冬

同濟大學附屬同濟醫(yī)院檢驗科，上海 200065

背景與目的：維甲酸誘導基因G(retinoic acid-induced gene G，RIG-G)是從急性早幼粒細胞性白血病細胞系NB4細胞中克隆出的腫瘤抑制基因。我們通過調(diào)控基因(Tet-on)系統(tǒng)構(gòu)建受強力霉素(doxycycline，DOX)誘導RIG-G基因表達的A549細胞系，并觀察其對A549細胞增殖的作用。方法：采用實時定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)擴增RIG-G基因片段，利用LR重組系統(tǒng)構(gòu)建pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G慢病毒載體，對該慢病毒載體和Tet-on慢病毒載體包裝和病毒滴度測定后，感染A549細胞；采用有限稀釋法篩選穩(wěn)定株；使用細胞免疫熒光和蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)鑒定RIG-G基因受DOX調(diào)控表達的效果；CCK-8試驗檢測細胞增殖能力。結(jié)果：成功構(gòu)建pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G慢病毒載體，包裝后測得其活性滴度為1.0×108TU/mL；慢病毒經(jīng)Tet-on包裝后物理滴度為4×109VP/mL；RIG-G蛋白成功地在慢病毒感染后的A549穩(wěn)定株中合成和表達，并且受DOX的誘導調(diào)控。RIG-G蛋白表達成功后，A549細胞的增殖與對照組相比顯著降低(1.168±0.107 vs 2.099±0.162，P＜0.05)。結(jié)論：本研究成功建立了RIG-G基因可調(diào)控表達的A549穩(wěn)定株；RIG-G蛋白對A549的增殖有抑制作用。

維甲酸誘導基因G；慢病毒；表達調(diào)控；細胞增殖

維甲酸誘導基因G(retinoic acid-induced gene G，RIG-G)是從急性早幼粒細胞性白血病細胞系NB4細胞中克隆到的一個可以被維甲酸誘導表達的基因，位于10號染色體q24上，編碼一個含490個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)［1-3］。RIG-G是一個重要的腫瘤抑制基因，能通過上調(diào)細胞周期抑制因子p21和p27抑制白血病細胞增殖和促進細胞分化［4］，然而，RIG-G抑制腫瘤細胞增殖的具體機制及其在實體腫瘤細胞中是否同樣具有腫瘤抑制功能仍不清楚。近年來，利用慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的研究有很多，但同時利用調(diào)控基因(Tet-on)、報告基因(GFP)［5］和目的基因構(gòu)建細胞系的研究還不多見。本研究采用Tet-on表達系統(tǒng)，利用慢病毒載體介導RIG-G基因轉(zhuǎn)染肺癌細胞系A549細胞，建立可調(diào)控表達RIG-G蛋白的穩(wěn)定株，觀察RIG-G蛋白在肺癌細胞A549中的表達及生物學作用。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒

pTRE-Tight-RIG-G由上海血液學研究所饋贈；pLenti6/TO/V5-DEST、熒光質(zhì)粒pENTRGFP-IRES-MCS(pENTR-GIM)、四環(huán)素基因調(diào)控系統(tǒng)Tet-on(pLenti3.3/TR)、包裝質(zhì)粒Packaging Mix和標準質(zhì)粒pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP均購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞

人肺癌細胞系A549和人胚腎細胞系293T購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫，用DMEM(含10%的胎牛血清)置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 主要試劑和酶

兔源性RIG-G抗體由上海血液學研究所饋贈；鼠源性β-actin購自美國Santa Cruz公司；G418、胎牛血清(FBS)、DMEM和胰酶購自美國Gibco公司；LR重組系統(tǒng)(LR clonase Ⅱ)、Blasticidin S HCL和轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；強力霉素(doxycycline，DOX)購自美國Sigma公司；BamHⅠ和SgsⅠ購自加拿大Fermentas公司；細胞增殖和毒性檢測試劑盒(CCK-8)購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.4 構(gòu)建質(zhì)粒pENTR-GIM-RIG-G［6］

設計5’端和3’端帶BamHⅠ、SgsⅠ內(nèi)切酶的引物，根據(jù)質(zhì)粒pTRE-Tight-RIG-G中RIG-G基因的cDNA序列，以5’-ATAAGGATCC GCCGCCACCATGGACTACAAAGACGAT GAC-3’為正向引物，5’-TTATGGCGCGCC TCAGTTCAGTTGCTCTGAGTTAG-3’為反向引物擴增RIG-G基因，實時定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)產(chǎn)物及pENTR-GIM質(zhì)粒均用BamHⅠ和SgsⅠ雙酶切，用T4連接酶構(gòu)建成質(zhì)粒pENTR-GIM-RIG-G。

1.5 構(gòu)建慢病毒載體質(zhì)粒pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G［7］

使用Invitrogen公司的LR重組系統(tǒng)，將構(gòu)建成功的pENTR-GIM-RIG-G載體質(zhì)粒重組至慢病毒載體pLenti6/TO/V5-DEST載體上，篩選陽性克隆并測序，保留測序正確的重組質(zhì)粒。

1.6 慢病毒包裝及病毒滴度測定

轉(zhuǎn)染前1 d，將處于對數(shù)生長期的293T細胞在每個10 cm的培養(yǎng)皿中接種6×106個細胞，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)染前細胞密度為70%～80%，用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將慢病毒載體與包裝質(zhì)粒Packaging Mix共轉(zhuǎn)到293T細胞中，48 h后收集病毒上清液，600×g離心10 min，用0.45 μm的濾器過濾后，在4 ℃下，50 000×g離心2 h沉淀病毒顆粒，棄上清液，重懸于500 μL的DMEM中，分裝置于-80 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩Lenti6/TO/V5-GIM-RIG-G慢病毒活性滴度測定采用逐孔稀釋滴度法［8］；Tet-on慢病毒物理滴度測定采用qRT-PCR［9］。

1.7 構(gòu)建穩(wěn)定株A549-Tet-on-GIM-RIG-G

用Tet-on慢病毒液感染A549細胞，G418(800 μg/mL)篩選至陰性對照孔細胞全部死亡，擴增感染成功的細胞(A549-Tet-on)；再用pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G慢病毒液感染A549-Tet-on細胞，加Blasticidin S HCL(4 μg/mL)篩

選，穩(wěn)定株(A549-Tet-on-GIM-RIG-G)長出后，采用有限稀釋法挑選單克隆細胞。

1.8 通過蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測RIG-G蛋白的表達［10］

通過在培養(yǎng)液中加入DOX(2 μg/mL)調(diào)控RIG-G基因表達，在顯微鏡下觀察RIG-G基因熒光表達，采用Western blot檢測RIG-G蛋白表達。用空載體pLenti6/TO/V5-GIM質(zhì)粒感染A549-Tet-on細胞，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系A549-Tet-on-GIM作陰性對照。

1.9 CCK-8檢測RIG-G對A549細胞的作用

取對數(shù)生長期細胞，以5×103個/孔接種于96孔板中。實驗分為空白對照組、陰性對照組及實驗組，其中實驗組分為A549-Teton-GIM(±DOX)組和A549-Tet-on-GIM-RIGG(±DOX)組。每組設3個復孔。共接種6塊板，將其置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～6 d，每隔24 h取出1塊板，每孔加10 μL的CCK-8溶液，相同條件下溫育2 h，于450 nm處檢測各孔的吸光度(D)值。D值大小反應細胞增殖程度。

1.10 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計學軟件進行分析，以表示。組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒載體pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G的鑒定

根據(jù)質(zhì)粒pTRE-Tight-RIG-G中RIG-G基因的cDNA序列設計帶BamHⅠ、SgsⅠ內(nèi)切酶的引物，經(jīng)qRT-PCR擴增，產(chǎn)物用BamHⅠ和SgsⅠ酶切，連接到pENTR-GIM載體中，將連接好的質(zhì)粒pENTR-GIM-RIG-G重組到pLenti6/TO/ V5-DEST載體上，得到重組慢病毒載體pLenti6/ TO/V5-GIM-RIG-G，再經(jīng)BamHⅠ和SgsⅠ雙酶切，1.5%瓊脂糖電泳鑒定正確，可見一條特異性條帶，與理論值1 620 bp相符(圖1)，測序結(jié)果證明RIG-G基因序列正確，無明顯缺失或突變(圖2)。

2.2 慢病毒載體的滴度測定

將純化過的pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G病毒液稀釋感染已接種的293T細胞，轉(zhuǎn)染24 h后，在熒光顯微鏡下觀察可見大量綠色熒光(圖3)，提示轉(zhuǎn)染成功；第5天，根據(jù)各孔中熒光細胞數(shù)量計算出pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G慢病毒活性滴度為1.0×108TU/mL(圖4)。將標準質(zhì)粒pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP梯度稀釋，計算標準品的拷貝數(shù)，建標準曲線，經(jīng)qRT-PCR擴增慢病毒樣品計算出Tet-on慢病毒物理滴度為4×109VP/mL (表1、2)。

2.3 DOX對穩(wěn)定株中RIG-G基因的表達調(diào)控功能

用細胞免疫熒光和Western blot對穩(wěn)定株的RIG-G基因表達情況進行檢測。結(jié)果顯示，當培養(yǎng)液中不加DOX時，穩(wěn)定株中的RIG-G基因的表達呈陰性；當培養(yǎng)液中加入DOX后，RIG-G基因的表達顯著上升，而含空載體的A549-Tet-on-GIM細胞中RIG-G基因表達始終呈陰性(圖5～7)。結(jié)果表明，已成功構(gòu)建了過表達RIG-G基因的細胞模型，并且可以通過DOX調(diào)控RIG-G基因的表達。

圖 1 重組慢病毒載體經(jīng)雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果Fig. 1 Results of agarose gel electrophoresis analysis of recombinant lentiviral vectors by double enzyme digestion M: Marker; 1: PLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G vector; 2: RIG-G fragment; 3: Negative control.

圖 2 重組慢病毒載體經(jīng)雙酶切后RIG-G基因測序結(jié)果(部分) Fig. 2 RIG-G gene sequencing result of recombinant lentiviral vectors by double enzyme digestion (section)

圖 3 熒光顯微鏡下觀察pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G病毒液感染293T細胞24 h后的情況Fig. 3 293T cells infected by pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G virus for 24 h was observed under a fluorescence microscope (×100)

圖 4 熒光顯微鏡觀察pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G慢病毒不同滴度下對293T細胞的感染效率Fig. 4 Infection efficiency of different titer lentiviral vector pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G in 293T cells was examined under a fluorescence microscope

表 1 標準品參數(shù)值Tab. 1 Parameters of standard

表 2 Tet-on慢病毒樣品擴增參數(shù)值Tab. 2 Amplification parameters of Tet-on lentiviral samples

圖 5 熒光顯微鏡下觀察穩(wěn)定株的RIG-G基因表達情況Fig. 5 The RIG-G gene expressions of stable cells were observed under a fluorescence microscope (×100)

圖 6 免疫熒光檢測穩(wěn)定株的RIG-G蛋白表達情況Fig. 6 Expressions of RIG-G protein in stable cells were assayed by immune fluorescence staining (×400)

圖 7 Western blot檢測A549-Tet-on-GIM和A549-Tet-on-GIM-RIG-G細胞RIG-G蛋白表達情況Fig. 7 Expressions of RIG-G protein in A549-Tet-on-GIM and A549-Tet-on-GIM-RIG-G cells were examined by Western blot analysis

2.4 RIG-G蛋白對A549細胞增值活性的影響

CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)，RIG-G蛋白表達明顯抑制穩(wěn)定株的生長(圖8)。第6天，A549-Tet-on-GIMRIG-G細胞的CCK-8的D值與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(1.168±0.107 vs 2.099±0.162，P＜0.05)，而其他3組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結(jié)果表明，RIG-G蛋白表達具有抑制細胞增殖的能力。

圖 8 CCK-8檢測A549-Tet-on-GIM和A549-Tet-on-GIMRIG-G細胞的增殖情況Fig. 8 Cell proliferations of A549-Tet-on-GIM and A549-Tet-on-GIM-RIG-G cells were detected by CCK-8 analysis

3 討 論

目前，臨床對肺癌的主要治療手段是手術(shù)并輔以放療和化療，雖然有一定成效，但肺癌

的不良預后尚未得到根本改觀，5年生存率只有18%［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染RIG-G基因后，肺癌細胞A549的增殖顯著減慢。設想如果將RIG-G基因轉(zhuǎn)入肺癌患者的腫瘤細胞中，細胞的生長受到抑制將導致腫瘤的消亡。特別是在肺癌患者手術(shù)后轉(zhuǎn)入RIG-G基因用以清除手術(shù)殘留的腫瘤細胞，則將進一步降低肺癌的復發(fā)率，提高患者的生存率。本實驗構(gòu)建的肺癌細胞系同時含有調(diào)控基因(Tet-on)、報告基因(GFP)和目的基因(RIG-G)，其特點為含有綠色熒光蛋白的基因，翻譯出來的綠色熒光蛋白和RIG-G蛋白不是融合蛋白，其各具獨立空間結(jié)構(gòu)和生理活性，互不干擾，并方便RIG-G基因的表達、鑒定及定位追蹤。同時又選用Tet-on表達調(diào)控系統(tǒng)通過DOX來人為控制開啟或關(guān)閉RIG-G基因的表達，為臨床進行肺癌的基因治療提供了便利和安全的控制手段。

本實驗構(gòu)建pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G慢病毒載體，目的是為研究RIG-G基因在實體腫瘤中的作用提供基礎。Western blot檢測結(jié)果顯示，構(gòu)建的穩(wěn)定細胞株A549-Tet-on-GIM-RIG-G能夠在DOX的調(diào)控下開啟和關(guān)閉RIG-G基因的表達；細胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示，RIG-G蛋白在細胞質(zhì)中高表達，且具有低本底、高誘導表達的特征；CCK-8實驗證明，RIG-G蛋白表達后，A549細胞的增殖與對照組相比顯著降低(1.168±0.107 vs 2.099±0.162，P＜0.05)。上述結(jié)果與文獻報道的RIG-G蛋白具有抑制白血病細胞增殖的作用相一致［4］，說明RIG-G蛋白對實體腫瘤細胞也具有抑制功能。

本研究前期也構(gòu)建了慢病毒Tet-off表達系統(tǒng)，建立了A549細胞模型，發(fā)現(xiàn)該模型RIG-G蛋白的表達量也較高，但是加入DOX后并不能完全關(guān)閉RIG-G蛋白的表達。RIG-G蛋白的表達量一直較高，可能Tet-off表達系統(tǒng)具有一定的細胞特異性所致。本研究選用的Tet-on表達系統(tǒng)顯示出DOX調(diào)控RIG-G蛋白表達的能力更強、本底低和開關(guān)靈敏等特點，并且Tet-on表達系統(tǒng)僅在需要RIG-G蛋白表達時使用誘導藥物DOX，這樣既節(jié)省費用，又方便今后基礎研究和臨床治療應用的操作。但是，由于DOX本身對細胞生長有一定的抑制作用，因此，建議在進一步深入研究RIG-G基因功能的基礎上設立陰性對照。

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Construction of recombinant lentivirus vector containing retinoic acid-induced gene G and its effect

on human lung cancer A549 cell line

WU Junlu, QUAN Wenqiang, YAO Yiwen, WAN Haiying, LI Dong

(Department of Clinical Laboratory, Tongji Hosptial, Tongji University, Shanghai 200065, China)

LI Dong E-mail: 186ld@163.com

Background and purpose: Retinoic acid-induced gene G (RIG-G) is a tumor suppressor gene which is cloned by NB4 cell line from a acute promyelocytic leukemia cell. This study aimed to investigate the effect of RIG-G in lung cancer cells A549 by constructing a lentiviral vector expressing RIG-G under doxycycline (DOX) regulation. Methods: RIG-G gene amplification was performed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). pLenti6/ TO/V5-GIM-RIG-G lentiviral vector with GFP was built by LR recombination system. The concentration of pLenti6/ TO/V5-GIM-RIG-G lentiviral vector and Tet-on lentiviral vector were measured by virus titer method. After infecting A549 cells, stably transfected lines were selected via limiting dilution analysis. RIG-G gene expression was examined by immunofluorescence staining and Western blot assay. Cellular proliferation was determined by CCK-8 assay. Results: The concentrations of pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G lentiviral vector and Tet-on lentiviral vector were 1.0×108TU/mL and 4×109VP/mL, respectively. RIG-G was expressed in lentivirus infected A549 cells after adding DOX, and the amount of cells with GFP could be observed by fluorescence microscopy. After the expression of RIG-G protein, the proliferation activity of A594 cell was significantly inhibited compared to the control group (1.168±0.107 vs 2.099±0.162, P＜0.05). Conclusion: The regulated expression of RIG-G gene was established in A549 lung cancer cell line. The RIGG protein has potential abilities to inhibit the proliferation of lung cancer cell A549.

Retinoic acid-induced gene G; Lentiviral; Expression regulation; Cell proliferation

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.08.002

R73-35+1

A

1007-3639(2015)08-0566-06

2014-06-09

2014-08-11）

國家自然科學基金(81272603，81472179)；上海市浦江人才計劃(13PJ1407300)；2013年教育部留學回國人員科研啟動基金；上海申康醫(yī)院發(fā)展中心課題(SHDC22014008)。

李冬 E-mail：186ld@163.com