防治稻水象甲優(yōu)效球孢白僵菌YS03菌株產(chǎn)孢培養(yǎng)基優(yōu)化

狄雪塬，楊茂發(fā)，3*，鄒 曉

(1.貴州大學昆蟲研究所，貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴陽 550025;2.貴州大學真菌資源研究所，貴陽 550025;3.貴州大學煙草學院，貴陽 550025)

稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel 原產(chǎn)北美，19 世紀隨著密西西比河流域水稻大規(guī)模種植而轉(zhuǎn)入稻田危害，并逐漸成為水稻的毀滅性害蟲(Zou et al.，2004)，1988年傳至中國，是我國重要的檢疫害蟲，其成蟲取食水稻的細嫩部分，影響水稻的光合作用，幼蟲危害根部，阻礙養(yǎng)分傳輸，使水稻苗生長速度減緩，植株矮化，分蘗能力下降，最終導致水稻產(chǎn)量下降，一般造成減產(chǎn)10%-30%，嚴重時達50% 以上，甚至絕收(Zou et al.，2004)。

目前對稻水象甲的防治主要以化學防治為主(蔡明等，2000)，化學藥劑可以在短時間內(nèi)控制蟲口的數(shù)量，但農(nóng)藥的大量使用導致稻水象甲抗藥性問題日趨嚴重，并帶來了防治成本的增加和生態(tài)系統(tǒng)惡化等一系列問題(Saito et al.，2005)。生物防治是基于生態(tài)平衡的原理，利用天敵的作用來調(diào)節(jié)有害生物種群密度，使之長期穩(wěn)定在不危害的水平(蔡明等，2003)，但原產(chǎn)于北美洲的天敵并沒有隨之傳入，因此稻水象甲的天敵匱乏，生物防治研究進展甚微(于風泉等，2003)。

20 世紀80年代，日本學者致力于尋找其天敵，研究得出只有綠僵菌和白僵菌對成蟲具有較強的致病性，可被作為微生物防治的材料(Nagano，1987;Yozhlzawa，1993)。球孢白僵菌是一種致病性強、寄主范圍廣、適應性廣的昆蟲病原真菌，可侵染15 目149 科的700 余昆蟲，因其還具有不污染環(huán)境、無公害、易培養(yǎng)等優(yōu)點，在生物防治中日益受到關(guān)注(岡田齊夫和馬桂椿，1984)。20 世紀80年代以來，國內(nèi)學者開展了較多的利用球孢白僵菌防治稻水象甲的試驗研究(李增智，1996;蔣明星等，2002;于鳳泉等，2003;徐進等，2013;關(guān)志堅等，2014)，篩選了一些致病力強的菌株，并在田間應用上表現(xiàn)出良好的防效。球孢白僵菌YS03 菌株系本項目組徐進(2013)等篩選出的對稻水象甲成蟲致病力強的優(yōu)效菌株，該菌株在孢子濃度為2.0×108個/mL 接種處理后，26℃條件下第15 天供試成蟲平均校正死亡率達96.55%。為了讓YS03 菌株有效的應用于稻水象甲的防控實踐中，我們對其培養(yǎng)基的配方進行了初步探索，旨在研究出原料廉價易得、制備方法簡便、營養(yǎng)能完全滿足菌種生長且方便批量生產(chǎn)的培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:YS03 白僵菌菌種，由貴州大學生命科學學院真菌資源研究所提供。

原料:麥麩、米糠、玉米粉、花生、面粉、燕麥、豌豆粉、百合粉等。

藥品:蛋白胨、葡萄糖、瓊脂等。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)

由貴州大學生命科學學院真菌資源研究所提供的YS03 白僵菌菌株，先將保藏的菌種接種在PDA 斜面培養(yǎng)基上于25℃及12L∶12D 條件下活化培養(yǎng)7 d 待用。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

市場上購買原材料，以PDA 培養(yǎng)基中提供的營養(yǎng)成分含量(主要依據(jù)碳源和氮源)為參照，根據(jù)各材料所含營養(yǎng)成分的不同，每種材料設計3個梯度，各梯度原材料加水1000 mL，煮沸20-30 min，用紗布過濾，加水至1000 mL，再加入30 g 瓊脂，加熱讓其充分溶解即可。

1.2.3 培養(yǎng)基單因素篩選實驗

將制備好的培養(yǎng)基滅菌然后倒平板，編號，待其冷卻凝固，將之前培養(yǎng)好的YS03 白僵菌用直徑1 cm 的打孔器打孔，接在培養(yǎng)皿上，每皿接3孔，25℃培養(yǎng)，48 h 后第一次觀察并記錄菌落直徑及生長狀態(tài)，之后每24 h 觀察一次，觀察7 d，然后用血球計數(shù)法測量各培養(yǎng)基的孢子量。

1.2.4 培養(yǎng)基的響應面優(yōu)化

根據(jù)單因素結(jié)果利用Box-Behnken 進行試驗設計，共有17 組試驗，把每組試驗的不同配方按比例稱好，培養(yǎng)基的制備同1.2.2，觀察方法同1.2.3。將得出的結(jié)果輸入Design-Expert 8.0 中進行響應面分析，從而優(yōu)化培養(yǎng)基的組分，獲得最佳配方。

1.2.5 驗證實驗

經(jīng)過Design-Expert 8.0 的響應面分析得出一個最佳配方，重復以上培養(yǎng)基的制備和試驗方法，以PDA 培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基，驗證試驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的單因素實驗

8種單因素實驗結(jié)果采用SPSS 17.0 對數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，方差分析，得到各因素之間差異顯著，多重比較選出對YS03 球孢白僵菌產(chǎn)孢量影響比較大的三種原料:花生50 g，麥麩150 g，玉米粉200 g，從而篩選出花生、麥麩、玉米粉三種配料作為制備培養(yǎng)基的基礎原料。

2.2 培養(yǎng)基的響應面優(yōu)化

2.2.1 Box-Behnken 實驗設計

根據(jù)Box-Behnken 的中心組合實驗設計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，選取花生、麥麩、玉米粉對YS03 球孢白僵菌產(chǎn)孢量影響較大的三個因素，在單因素試驗的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法進行試驗設計，實驗的各因素水平見表2，實驗設計及結(jié)果如表3，其中12 組為析因試驗，5 組為重復的中心點試驗，用于考察模型的誤差。

表1 不同濃度產(chǎn)孢量的方差分析Table 1 Analysis of variance (ANOVA)for different concentration of spore yields

表2 響應面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of RAS test

表3 實驗設計及結(jié)果Table 3 Experimental design and results

(續(xù)上表)

2.2.2 二次回歸模型的建立及顯著性檢驗

利用統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得出多元線性模型回歸結(jié)果:Y=-3.96258×108+5.54067×106X1+1.731×106X2+5.273×105X3+2.04×104X1X2-2.49×104X1X3+1.92×104X2X3-4.104×104X12-3.05×104X22-2.97×104X32，其中X1、X2、X3分別是花生、麥麩和玉米粉，Y值為產(chǎn)孢量。對該二項式回歸模型進行方差分析，見表3。該模型方程具有顯著差異。失擬差不顯著，表明方程的擬合不足實驗不顯著，沒有明顯失擬因素存在，對模型是有利的。因此，該模型可以用于對YS03 球孢白僵菌的產(chǎn)孢量進行分析和預測。

表4 產(chǎn)孢量回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA)for regression equation

2.2.3 響應曲面分析與優(yōu)化條件的確定

為了進一步探索X1、X2、X3的交互作用對響應值Y 的影響，采用Design-Expert 軟件繪制了等高線圖及對應的三圍響應曲面圖。圖1-3 為分別固定三個影響因素之一，考察其他兩個因素對響應值影響的曲面圖，圖底部平面為等高線，等高線圖的重合區(qū)域用來進行各影響因素的優(yōu)化。等高線的形狀和線間的疏密程度均能反應出兩變量間交互作用的大小，橢圓形、線間密度大的表示交互作用大，圓形、線間密度小的表示交互作用小;響應面曲面傾斜度大表示交互作用大，響應面曲面傾斜度小表示交互作用小 (雷欣宇等，2013)。由圖1-3 分析可得，兩兩因素之間對響應值Y 均有一定的交互作用，其中花生和玉米粉的交互作用最為顯著。

圖1 為X2(麥麩)在0 水平時，X1(花生)與X3(玉米粉)交互作用的等高線圖及相應響應面圖。由圖可知，當X1值一定時，隨著X3值在一定范圍內(nèi)增加，響應值Y 也隨之增加，在X3取值在85-105 范圍內(nèi)，Y 達到最大值，但當X1繼續(xù)增加時，Y 值則會下降。說明玉米粉的含量在一定范圍內(nèi)會增加白僵菌的產(chǎn)孢量，但超過這個范圍，便會抑制產(chǎn)孢量。當X3值一定時，隨著X1值得增加，Y 值也是先上升后下降，X1取值范圍為45-105 時，產(chǎn)孢量最大，X1值過高過低都不利于白僵菌的產(chǎn)孢量。

同理，由圖2、圖3 分析可得，當X1值一定時，產(chǎn)孢量達到最大值時，X2的取值范圍為78-80，當X2值一定時，產(chǎn)孢量達到最大值時，X1的取值范圍為55-65;當X2值一定時，X3取值范圍在85-105 時，產(chǎn)孢量可達到最大響應值區(qū)域，當X3值一定時，X2取值范圍在70-80 時，產(chǎn)孢量可達到最大響應值區(qū)域。

根據(jù)Box-Behhnken 實驗設計結(jié)果，優(yōu)化的最終結(jié)果為:花生59.59 g，麥麩76.08 g，玉米粉88.33 g，這個最佳配方產(chǎn)孢量的預測值為6.76×107個/mL。

圖1 花生與玉米粉交互作用響應面圖及等高線圖Fig.1 Response surface and contour plot showing the interactive effects of peanut and maizena on the spore yields

圖2 花生與麥麩交互作用響應面圖及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot showing the interactive effects of peanut and bran on the spore yields

圖3 麥麩與玉米粉交互作用響應面圖等高線圖Fig.3 Response surface and contour plot showing the interactive effects of bran and maizena on the spore yields

2.3 驗證實驗

為了驗證模型預測的準確性及優(yōu)化培養(yǎng)基產(chǎn)孢量的效果，對優(yōu)化后的培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基(PDA)分別進行產(chǎn)孢量測定試驗，優(yōu)化培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量為6.15×107個/mL，其實際試驗值與模型預測值6.76×107個/mL 基本一致，說明此配方是可靠的。對照培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量為3.2×107個/mL，優(yōu)化培養(yǎng)基產(chǎn)孢量是對照組產(chǎn)孢量的1.92 倍。

3 結(jié)論與討論

球孢白僵菌是一種重要昆蟲病原真菌，已經(jīng)用于多種農(nóng)林害蟲的微生物防治 (羅成等，2011)，徐進等(2013)篩選出了對稻水象甲的致病力強的優(yōu)效球孢白僵菌YS03 菌株，本試驗通過單因素試驗、響應面試驗得出使YS03 球孢白僵菌產(chǎn)孢量最大的培養(yǎng)基配方為花生∶麥麩∶玉米粉=2.6∶3.5∶3.9。

前人對培養(yǎng)基的篩選做了很多工作，篩選出葡萄糖2%、牛肉蛋白胨1%、牛肉浸膏0.3% 和K2HPO41%為嗜線蟲致病桿菌HB310 培養(yǎng)基的最佳配方 (王永娟等，2014);葡萄糖3.2%、CaCO30.84%和番茄33%為嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基的最佳配方(雷欣宇等，2013)，這些均是對細菌培養(yǎng)基的優(yōu)化，而對球孢白僵菌培養(yǎng)基的篩選及優(yōu)化，徐文靜等 (2006)實驗表明球孢白僵菌在L-broth 培養(yǎng)基上生長最快;王韜遠等 (2013)研究得出，在PPDA 培養(yǎng)基中添加70 mg/L 的多果定，125 mg/L 頭孢霉素和138 mg/L 硫酸卡那霉素為球孢白僵菌最適培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基的優(yōu)化都是基于已有培養(yǎng)基進行優(yōu)化的，而本實驗則是利用簡單易得的農(nóng)副產(chǎn)品篩選出適合球孢白僵菌YS03 菌株生長的培養(yǎng)基配方，且其產(chǎn)孢量并不低于已有培養(yǎng)基。

王濱等(2000)做球孢白僵菌選擇性培養(yǎng)基的篩選時，篩選出燕麥培養(yǎng)基對球孢白僵菌生長有利而對其它雜菌有明顯的抑制作用。本實驗也發(fā)現(xiàn)，燕麥培養(yǎng)基菌落生長和產(chǎn)孢量都不理想，幾乎沒有雜菌出現(xiàn)，這一現(xiàn)象與王濱的實驗結(jié)果一致。徐文靜等(2006)以菌落直徑為觀測值得出PDA 培養(yǎng)基要優(yōu)于花生培養(yǎng)基，本實驗以產(chǎn)孢量為觀測值，花生培養(yǎng)基要優(yōu)于PDA 培養(yǎng)基，本實驗的花生培養(yǎng)基與徐文靜實驗中的花生培養(yǎng)基成分不同，且觀測的生物學特性不同，可能還存在別的原因，有待進一步探討。

從響應面分析圖中可看出，每種配料都是在一定范圍內(nèi)產(chǎn)孢量會達到最高值，隨著配料的繼續(xù)增加，產(chǎn)孢量反而會減少，說明白僵菌對不同營養(yǎng)的需求是有一定比例的，過高過低都不能使菌株很好的生長，只有配料比例適當才能更好更快的培養(yǎng)白僵菌。

鄺灼彬等(2005)在最適溫度下，得到的球孢白僵菌的最高產(chǎn)孢量達6.40×107個/mL，齊永霞等(2011)實驗中球孢白僵菌最高產(chǎn)孢量為5.42×107個/mL。本試驗優(yōu)化后的最佳配方使白僵菌的產(chǎn)孢量達到6.15×107個/mL，與其他研究者產(chǎn)孢量的差異可能由于培養(yǎng)條件和菌株差異引起的，試驗中對照培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量僅為3.2×107個/mL，優(yōu)化培養(yǎng)基產(chǎn)孢量是對照組(PDA)產(chǎn)孢量的1.92 倍，且優(yōu)化后的培養(yǎng)基要優(yōu)于任何單一培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量，表明優(yōu)化后的培養(yǎng)基能增加產(chǎn)孢量，其配方能較好的滿足規(guī)模化培養(yǎng)白僵菌的需要，且配方材料簡單易得，該研究具有較好的應用前景。

References)

Cai M，Song YK，Qu CM，et al.The rice water weevil field investigation and check method of Liaoning ［J］.Liaoning Agricultural Science，2003，6:39-40.［蔡明，宋雅坤，曲昌明，等.遼寧省稻水象甲田間調(diào)查與檢驗方法［J］.遼寧農(nóng)業(yè)科學，2003，6:39-40］

Cai M，Xing Y，Zhao TC，et al.The causes and control countermeasures of the rice water weevil，in 2000.［J］.Liaoning Agricultural Science，2000，5:36-37.［蔡明，邢巖，趙鐵成，等.2000年稻水象甲大發(fā)生原因及控制對策［J］.遼寧農(nóng)業(yè)科學，2000，5:36-37］

Gang TQF，Ma GC.1984.The rice water weevil was spreading in Japen［J］.Plant Quarantine，1984，36 (12):561-565.［岡田齊夫，馬桂椿.稻水象甲正在日本稻區(qū)傳播蔓延［J］.植物檢疫，1984，36 (12):561-565］

Guan JZ，F(xiàn)u WJ，Tuerxun AHMT，et al.The control effect of Beauveria on the rice water weevil ［J］.Plant Protection，2014，12:37-38.［關(guān)志堅，付文君，吐爾遜·阿合買提，等.白僵菌對稻水象甲防治效果［J］.植物保護，2014，12:37-38］

Jiang MX，Shang HW，Cheng JA.Bioassay of Beauveria bassiana against the rice water weevil，Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel ［J］.Journal of Plant Protection，2002，29 (3):287-288.［蔣明星，商晗武，程家安.球孢白僵菌對稻水象甲成蟲的毒力測定［J］.植物保護學報，2002，29 (3):287-288］

Kuang ZB，Lv LH，F(xiàn)eng X，et al.The influence of temperature and common pesticide on the biological characteristics of Beauveria bassiana ［J］.Journal of South China Agricultural University，2005，26 (3):26-29.［鄺灼彬，呂利華，馮夏，等.溫度及常見農(nóng)藥對球孢白僵菌生物學特性的影響［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2005，26 (3):26-29］

Lei XY，Kang JP，Zeng FK，et al.Optimization of enrichment medium for Lactobacillus acidophilus by response surface methodology ［J］.Food Science and Technology，2013，38 (1):7-12.［雷欣宇，康建平，曾凡坤，等.嗜酸乳桿菌增殖培養(yǎng)基的響應面優(yōu)化［J］.食品科技，2013，38 (1):7-12］

Li ZZ.The development of insect mycology.In:Botanical Society of China Mycological Society Insect Mycology Professional Group，ed.Insect Mycology Research and Application in China ［C］.1996.［李增智.昆蟲真菌學的發(fā)展.見:中國植物學會真菌學會蟲生真菌專業(yè)組，編.中國蟲生真菌研究與應用［C］.1996］

Luo C，Ying SH，F(xiàn)eng MG.Selection and formulation of a Beauveria bassiana strain with high virulence towards Spodoptera litura(Lepidoptera:Noctuidae)［J］.Chinese Journal of Biological Control，2011，27 (2):188-196.［羅成，應盛華，馮明光.球孢白僵菌對斜紋夜蛾高毒菌株篩選與制劑的研發(fā)［J］.中國生物防治學報，2011，27 (2):188-196］

Nagano TY.Rice water weevil parasitized by green muscadine fungus Metarhizium sp.［J］.Ann.Rept .Plant，1987，(38):90-91.

Qi YX，Chen FX，Li ZZ.Effects of carbon and nitrogen sources on the biological characteristics and antifungal activity of Beauveria bassiana ［J］.Acta Laser Biology Sinica，2011，20 (1):38-44.［齊永霞，陳方新，李增智.不同碳、氮營養(yǎng)對球孢白僵菌生物學特性和抑菌活性的影響［J］.激光生物學報，2011，20 (1):38-44.］

Saito T，Hirai K，Way OM.The rice water weevil，Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (Coleoptera Curculionidae) ［J］.Applied Entomology and Zoology，2005，40 (1):31-39.

Wang B，F(xiàn)an MZ，Li ZZ.Selective medium screening of Beauveria bassiana［J］.Journal of Anhui Agricultural University，2000，27 (1):23-28.［王濱，樊美珍，李增智.球孢白僵菌選擇性培養(yǎng)基的篩選［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學學報，2000，27 (1):23-28］

Wang TY，Xu WJ，Zhang ZK，et al.The application and screening of isolation medium for Beauveria bassiana ［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2013，29 (9):134-138.［王韜遠，徐文靜，張正坤，等.球孢白僵菌分離培養(yǎng)基的篩選及應用［J］.中國農(nóng)學通報，2013，29 (9):134-138］

Wang YJ，Zhang J，Kong FF，et al.Screening of original medium and optimizing fermentation conditions of Xenorhabdus nematophila HB310 ［J］.Journal of Environmental Entomology，2014，36(6):997-1003.［王永娟，張杰，孔繁芳，等.嗜線蟲致病桿菌HB310 培養(yǎng)基篩選和培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］.環(huán)境昆蟲學報，2014，36 (6):997-1003］

Xu J，Yang MF，Yang DX，et al.Bioassay of pathogenicity of different Beauveria bassiana on rice water weevil ［J］.Guizhou Agricultural Sciences，2013，41 (3):69-72.［徐進，楊茂發(fā)，楊大星，等.不同球孢白僵菌對稻水象甲成蟲的致病力的測定［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學，2013，41 (3):69-72］

Xu WJ，Ma DL，Liu N，et al.Selection of the optimal medium of Beauveria bassiana and genetic transformation seletion markers［J］.Journal of Jilin Agricultural Science，2006，31 (1):50-52.［徐文靜，馬德良，劉娜，等.球孢白僵菌最適培養(yǎng)基篩選和遺傳轉(zhuǎn)化篩選標記的研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)科學，2006，31 (1):50-52］

Yozhlzawa E.Microbial control of the rice water weevil with entomogenous fungi.In:Hirai K，eds.Establishment Spread and Management of the Rice Water Weevil and Migratory Rice Pests in East Asia ［C］.Narc Tsukuba，1993.

Yu FQ，Li ZQ，Liu PB，et al.Research progress on biological control of the rice water weevil ［J］.Liaoning Agricultural Sciences，2003，6:19-20.［于鳳泉，李志強，劉培斌，等.稻水象甲生物防治研究進展［J］.遼寧農(nóng)業(yè)科學，2003，6:19-20］

Zou L，Stout JM，Dunand TR.The effects of feeding by the water weevil，Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel，on the growth and yield［J］.Agricultural and Forest Entomology，2004，(1):47-53.

Zou L，Stout JM，Ring RD.Density-yield relationships for rice water weevil on rice for different varieties and under different water management regimes ［J］.Crop Protection，2004，23 (6):543-550.