河南洛陽(yáng)地區(qū)流產(chǎn)奶牛感染性病原的分子檢測(cè)

翟 凱，錢偉鋒，王天奇，邵曉冬，閆文朝，韓利方，呂超超

（1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003；2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽(yáng) 471000）

河南洛陽(yáng)地區(qū)流產(chǎn)奶牛感染性病原的分子檢測(cè)

翟 凱1，錢偉鋒1，王天奇1，邵曉冬1，閆文朝1，韓利方1，呂超超2

（1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003；2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽(yáng) 471000）

為調(diào)查洛陽(yáng)地區(qū)引起奶牛流產(chǎn)的主要病原，于2013年7月至2014年3月，收集該地區(qū)6個(gè)奶牛場(chǎng)（或小區(qū)）共42頭新鮮流產(chǎn)胎牛，及其母體的血液、陰道分泌物和鼻腔分泌物，計(jì)為42例樣本，采用PCR或RT-PCR方法對(duì)所采集樣本進(jìn)行新孢子蟲、弓形蟲、胎兒三毛滴蟲、布魯菌、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）和牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）6種常見流產(chǎn)病原的核酸檢測(cè)。結(jié)果顯示，被檢樣本總感染率為42.9%（18/42），其中新孢子蟲感染率最高，為40.5%（17/42）；IBRV次之，為11.9%（5/42）；胎兒三毛滴蟲、布魯菌、弓形蟲和BVDV感染率分別為2.4%、2.4%、2.4%和0。14.3%（6/42）的被檢樣本存在混合感染，其中以新孢子蟲+IBRV混合感染為主（50%，3/6）。結(jié)合被檢流產(chǎn)奶牛的臨床特征及飼養(yǎng)管理等因素，推斷新孢子蟲是導(dǎo)致該地區(qū)奶牛流產(chǎn)的最主要病原，本研究結(jié)果將為該地區(qū)有效防控奶牛流產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

奶牛；流產(chǎn)；病原；PCR；新孢子蟲

奶牛流產(chǎn)導(dǎo)致產(chǎn)犢間隔擴(kuò)大，增加養(yǎng)牛的飼料成本，影響高產(chǎn)奶量的獲得和后備牛的擴(kuò)充，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每個(gè)流產(chǎn)病例平均經(jīng)濟(jì)損失達(dá)640美元[1-2]。一般認(rèn)為，牛場(chǎng)的年流產(chǎn)率在3%～5%為正?，F(xiàn)象，但據(jù)近年調(diào)查顯示，國(guó)內(nèi)奶牛流產(chǎn)率達(dá)10%～25%[1-3]。診斷分析流產(chǎn)原因，對(duì)預(yù)防和控制奶牛流產(chǎn)具有重要的意義。

引起妊娠母牛流產(chǎn)的原因可分為病原性因素和非病原性因素。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，病原性因素引起的奶牛流產(chǎn)最多達(dá)90%左右[2]，其中最常見

的相關(guān)病原有新孢子蟲（Neospora caninum）、弓形蟲（Toxoplasma gondii）、胎兒三毛滴蟲（Tritricho?monas foetus）、布魯菌（Brucella abortus）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectiousbovine rhinotracheitisvirus，IBRV）、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea vi?rus，BVDV）等[1-2，4-5]。本實(shí)驗(yàn)室于2013年7月對(duì)洛陽(yáng)地區(qū)部分奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)（小區(qū)）就奶牛流產(chǎn)情況進(jìn)行了調(diào)查，奶牛流產(chǎn)率均在10%以上，個(gè)別養(yǎng)殖戶的奶牛流產(chǎn)率高達(dá)20%，但引起流產(chǎn)的原因尚不清楚。為調(diào)查洛陽(yáng)地區(qū)引起奶牛流產(chǎn)的主要病原，本研究從該地區(qū)奶牛場(chǎng)（小區(qū)）采集流產(chǎn)胎牛及其母體的血液、鼻腔分泌物和陰道分泌物，通過(guò)PCR或RT-PCR方法檢測(cè)可能引起奶牛流產(chǎn)的6種病原，結(jié)合流產(chǎn)奶牛的臨床表現(xiàn)、養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理等方面因素，分析引起奶牛流產(chǎn)的主要病原，為該地區(qū)奶牛流產(chǎn)的科學(xué)防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 于2013年7月至2014年3月期間，采集洛陽(yáng)地區(qū)6個(gè)奶牛養(yǎng)殖小區(qū)42頭新鮮流產(chǎn)胎牛，及其對(duì)應(yīng)母體的血液、鼻腔分泌物和陰道分泌物，計(jì)為42份樣本。36個(gè)流產(chǎn)病例為妊娠5～7個(gè)月流產(chǎn)，流產(chǎn)母牛均未見其他明顯的臨床癥狀；其余6例為妊娠5個(gè)月內(nèi)流產(chǎn)。

所采集流產(chǎn)胎牛的心、腦組織用于新孢子蟲（N.caninum）和弓形蟲（T.gondii）的檢測(cè)，肝、脾、肺、腎用于IBRV、BVDV和布魯菌（B.abortus）的檢測(cè)，肺和皺胃內(nèi)容物用于胎兒三毛滴蟲（T.foetus）的檢測(cè)；母體鼻腔分泌物用于IBRV的檢測(cè)，陰道分泌物用于胎兒三毛滴蟲（T.foetus）、布魯菌（B. abortus）和BVDV的檢測(cè)；全血用于除胎兒三毛滴蟲外上述5種病原的檢測(cè)。

1.2 主要試劑 組織/血液/細(xì)胞DNA提取試劑盒為北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑、2×Easy Taq PCR SuperMix、DNA Marker DL-2 000、pEASY-T1 Simple克隆載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA凝膠回收純化試劑盒等為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 核酸提取和反轉(zhuǎn)錄 待測(cè)樣本的DNA和RNA提取、RNA的反轉(zhuǎn)錄分別參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 PCR檢測(cè) 弓形蟲的巢氏PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件參考ContiniC.等[6]的報(bào)道；新孢子蟲、胎兒三毛滴蟲、IBRV、BVDV和布魯菌的PCR擴(kuò)增引物及程序參考Yang N.等[4]的報(bào)道。PCR擴(kuò)增所針對(duì)的6種病原基因、目標(biāo)片段大小及引物序列見表1。隨機(jī)選取部分PCR陽(yáng)性產(chǎn)物，與pEASYT1 Simple克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選并鑒定后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種病原的PCR擴(kuò)增情況 除BVDV外，其余5種病原均有檢出（圖1～圖5）。測(cè)序及序列比對(duì)結(jié)果顯示，擴(kuò)增的布魯菌16sRNA基因、IBRV gB基因、弓形蟲B1基因和胎兒三毛滴蟲rRNA基因的序列分別與GeneBank中相應(yīng)病原序列（KC790986、

KF734618、HC607827和KJ439572）的核苷酸相似性均為100%。測(cè)得的3株新孢子蟲Nc5基因序列之間有4個(gè)堿基存在差異，相似性為99%。與GenBank中北京株新孢子蟲（JN106449、JN106453、JN106452）和國(guó)外報(bào)道的新孢子蟲序列（EU073600、AY911515、AY665722）的相似性為98%～99%。

表1 6種病原擴(kuò)增的引物

圖1 流產(chǎn)胎牛腦和心臟中新孢子蟲Nc5基因的巢氏PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A1、A2：1頭流產(chǎn)胎牛的腦、心；B1、B2：另1頭流產(chǎn)胎牛的腦、心；+：陽(yáng)性對(duì)照，-：陰性對(duì)照

圖2 1頭流產(chǎn)胎牛的肺、肝、脾、腎中IBRV gB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4：流產(chǎn)胎牛的肺、肝、脾、腎；+：陽(yáng)性對(duì)照；-：陰性對(duì)照

2.2 流產(chǎn)病例6種病原的檢出情況 42例樣本中有18例（42.9%）被檢出至少一種病原（表1）。其中，新孢子蟲感染率最高，為40.5%；其次為IBRV，為11.9%；胎兒三毛滴蟲、弓形蟲和布魯菌感染率均為2.4%，未檢出BVDV。同時(shí)感染2種或2種以上病原的樣本有6例，占被檢樣本總數(shù)的14.3%（6/42）。其中，新孢子蟲＋I(xiàn)BRV 3例，新孢子蟲＋胎兒三毛滴蟲、新孢子蟲＋弓形蟲、新孢子蟲＋布魯菌＋I(xiàn)BRV各1例。

圖3 流產(chǎn)胎牛肺組織中胎兒三毛滴蟲rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4：4頭流產(chǎn)胎牛的肺；+：陽(yáng)性對(duì)照；-：陰性對(duì)照

圖4 流產(chǎn)胎牛肺、肝、脾、腎中布魯菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4：流產(chǎn)胎牛的肺、肝、脾、腎；+：陽(yáng)性對(duì)照，-：陰性對(duì)照

圖5 流產(chǎn)母牛血液中弓形蟲B1基因的巢氏PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～6：6頭流產(chǎn)奶牛的血液；+：陽(yáng)性對(duì)照；-：陰性對(duì)照

2.3 不同類型樣品的檢出情況 17頭新孢子蟲陽(yáng)性的流產(chǎn)胎牛，有9例在其母體血液中檢出。5例IBRV陽(yáng)性的流產(chǎn)胎牛，有2例在其母體的血液和鼻腔分泌物檢出，有1例僅在其母體的鼻腔分泌物中檢出。弓形蟲陽(yáng)性病例僅見于1頭流產(chǎn)母牛，而在

其流產(chǎn)胎牛組織中未檢出，經(jīng)間接血凝試驗(yàn)（IHA）檢測(cè)，該流產(chǎn)母牛血清中存在弓形蟲抗體，但抗體水平較低（1∶64）。布魯菌陽(yáng)性的流產(chǎn)病例在其流產(chǎn)胎牛及其母體陰道分泌物中均被檢出，胎兒三毛滴蟲僅在1頭流產(chǎn)胎牛肺內(nèi)被檢出。

表2 流產(chǎn)奶牛42例樣本中6種病原的PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

導(dǎo)致奶牛流產(chǎn)的原因極其復(fù)雜，除非病原因素外，有約30多種病原可引起奶牛的流產(chǎn)。流產(chǎn)奶牛通常無(wú)典型的示病性臨床癥狀，也難以通過(guò)流產(chǎn)胎兒組織的病理變化確定病因。常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)如病原分離培養(yǎng)、病理組織學(xué)檢查等技術(shù)，耗時(shí)耗力且靈敏度較低。PCR方法特異性強(qiáng)，敏感性高，且具有快速診斷的優(yōu)點(diǎn)，可彌補(bǔ)以上診斷方法的不足[7]。

本研究以引起奶牛流產(chǎn)的6種常見病原為檢測(cè)對(duì)象，結(jié)果檢出5種病原。其中新孢子蟲的陽(yáng)性率最高，IBRV次之，布魯菌、弓形蟲、胎兒三毛滴蟲檢出率相對(duì)較低，表明新孢子蟲可能是引起洛陽(yáng)地區(qū)奶牛流產(chǎn)的主要病原因素。Yang N.等[4]于2012年對(duì)北京地區(qū)流產(chǎn)胎牛進(jìn)行9種病原的PCR檢測(cè)，結(jié)果IBRV和新孢子蟲的檢出率較高，分別是36.3%（29/ 80）和31.3%（25/80），而其他病原檢出率較低，與本調(diào)查檢測(cè)結(jié)果相似。然而，不同地區(qū)致奶牛流產(chǎn)的病原可能不同，如操國(guó)景等[2]2011年報(bào)道，北京某奶牛場(chǎng)新孢子蟲和牛病毒性腹瀉病毒抗體陽(yáng)性率分別為83%和75%，二者是主要病原因素，而布魯菌、李氏桿菌和牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體均為陰性；王雙山[1]等2013年報(bào)道，河南安陽(yáng)某規(guī)?；膛?chǎng)流產(chǎn)奶牛布魯菌、弓形蟲、新孢子蟲、衣原體抗體陽(yáng)性率分別為28%、10%、8%和0，前3種病原可能是導(dǎo)致奶牛流產(chǎn)的主要致病因素。國(guó)內(nèi)關(guān)于流產(chǎn)奶牛感染胎兒三毛滴蟲的報(bào)道較少，Yang N.等[4]2012年報(bào)道，北京地區(qū)奶牛流產(chǎn)胎兒肺中胎兒三毛滴蟲的PCR檢出率為5%（4/80），在其中1頭流產(chǎn)母牛的陰道分泌物中檢出，高于本調(diào)查的檢出率（2.4%）。不同地區(qū)致奶牛流產(chǎn)的病原因素的差異性可能與區(qū)域內(nèi)奶牛引種來(lái)源、飼養(yǎng)管理方式等方面有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，流產(chǎn)胎牛新孢子蟲的檢出率高達(dá)40.5%（18/28），低于北京地區(qū)Yao L.等[8]2009年的報(bào)道（57.7%），但高于Yang N.等[4]2012年的報(bào)道（31.3%）。在18例被檢出流產(chǎn)相關(guān)病原的樣本中，有17例為新孢子蟲陽(yáng)性。通過(guò)臨床調(diào)查得知，這17例新孢子蟲陽(yáng)性的奶牛均在妊娠5～7個(gè)月出現(xiàn)流產(chǎn)，且未見其他明顯的臨床表現(xiàn)，與KiowaiM.等[9]報(bào)道的新孢子蟲陽(yáng)性牛的平均流產(chǎn)時(shí)間為妊娠5～7個(gè)月相符。洛陽(yáng)地區(qū)奶牛養(yǎng)殖多以小區(qū)形式存在，一個(gè)小區(qū)內(nèi)有多家養(yǎng)殖戶，每戶有單獨(dú)的牛舍、活動(dòng)場(chǎng)和飼料庫(kù)。它們除共用一個(gè)通道進(jìn)入擠奶房外，引種、飼養(yǎng)管理、疫病診斷及防制等均各自獨(dú)立。同時(shí)，這些奶牛養(yǎng)殖小區(qū)內(nèi)均有犬存在，犬在夜間均被放開自由活動(dòng)，可自由進(jìn)入牛舍、活動(dòng)區(qū)和飼草存放區(qū)，其糞便中的卵囊可能會(huì)污染飼草及飲水。且多數(shù)畜主會(huì)把胎盤和流產(chǎn)的胎牛直接喂犬，從而使新孢子蟲在犬與奶牛之間循環(huán)傳播，這可能是流產(chǎn)胎牛新孢子蟲檢出率高的原因。根據(jù)Dubey JP.等[10]提出的奶牛感染新孢子蟲的風(fēng)險(xiǎn)因素，如牛場(chǎng)內(nèi)犬的存在、飼草飲水污染和缺乏管理等，可以推斷新孢子蟲是造成該地區(qū)奶牛流產(chǎn)的主要病原。

IBRV的檢出率為11.9%（5/42），總體陽(yáng)性率低于Yang N.等[4]2012年報(bào)道的北京地區(qū)流產(chǎn)胎牛36.3%的檢出率，亦低于石冬梅等[11]報(bào)道的河南省牛IBRV 59.29%的平均血清陽(yáng)性率。結(jié)果雖然表明IBRV在洛陽(yáng)地區(qū)流產(chǎn)奶牛相關(guān)病例中存在，但本研究所檢測(cè)的流產(chǎn)奶牛均未見厭食、發(fā)熱、咳嗽、呼吸加快和結(jié)膜炎等IBR特征性臨床癥狀，且在5頭IBRV陽(yáng)性病例中，有4頭的流產(chǎn)胎?；旌细腥拘骆咦酉x或布魯菌＋新孢子蟲，因此，IBRV可能不是該地區(qū)引起奶牛流產(chǎn)的主要病原。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)洛陽(yáng)地區(qū)部分奶牛場(chǎng)（小區(qū)）的流產(chǎn)樣本進(jìn)行6種常見病原的PCR檢測(cè)，結(jié)合流產(chǎn)奶牛的臨床特征、飼養(yǎng)管理等因素綜合分析，推斷新孢子蟲是引起該地區(qū)奶牛流產(chǎn)的主要病原。研究結(jié)果將為今后該地區(qū)奶牛流產(chǎn)的防控提供科學(xué)依據(jù)。

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M olecule Detection of Infectious Pathogens in Abortion Dairy Cattle in Luoyang

ZHAIKai1，QIANWei-feng1，WANG Tian-qi1，SHAO Xiao-dong1，YANWen-chao1，HAN Li-fang1，LV Chao-chao2
（1.College of Animal Science and Technology，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China；2.PuLike Biological Engineering Co.，Ltd，Luoyang 471000，China）

In order to investigate themain cause of abortions in dairy herds in Luoyang，a total of 42 clinical abortion cases in?cluding 42 fresh aborted fetuses and samples（blood，nasal secretions，and vaginal secretions）from the corresponding aborting dams in 6 dairy herdswere collected between July 2013 and March 2014.Six infectious pathogens Neospora caninum，Toxoplasma gon?dii，Tritrixhomonas foetus，Brucella abortus，infectious bovine rhinotracheitis virus（IBRV），and bovine viral diarrhea virus（BVDV）were exam ined by PCR or RT-PCR.Results from this study indicated that the total infection rate was 42.9%（18/42）.Ofwhich the infection rate of N.caninum was the highest（17/42，40.5%），followed by the rate of IBRV（5/42，11.9%）.The infection rates of T. foetus，B.abortus，T.gondii and BVDV were 2.4%，2.4%，2.4%and 0，respectively.Themixed infection ratewas 14.3%（6/42），of whichmixed infection by N.caninum and IBRV was common（3/6，50%）.Combined with the clinicalmanifestations of the aborting cows and management in these dairy herds，N.caninum was thought to be themost potential cause of abortions in dairy herds in Luoyang.This studywillprovide scientific basis for effective prevention and controlof abortion agents in dairy cows in the region.

dairy cow；abortion；pathogens；PCR；Neospora caninum

s：QIANWei-feng；WANG Tian-qi

S852.72+3

A

0529-6005（2015）11-0016-04

2014-08-25

河南科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金

翟凱（1989-），男，碩士生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)寄生蟲學(xué)，E-mail：1528562000@qq.com

錢偉鋒，E-mail：qw f2012@yeah.net；王天奇，E-mail：wtq@mail.haust.edu.cn