獼猴源毛滴蟲的鑒定

蒙笑

摘要：本研究以18個(gè) SrRNA和5.8個(gè) SrRNA基因?yàn)榛A(chǔ)，對(duì)引起獼猴腹瀉的腸內(nèi)毛滴蟲病進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并對(duì)其進(jìn)行了病理切片、碘液染色。通過對(duì)三毛滴蟲18 SrRNA、五毛滴蟲5.8 SrRNA的序列進(jìn)行 PCR分析，對(duì)其進(jìn)行了序列比較，并建立了演化樹。形態(tài)學(xué)分析表明，毛滴蟲為梨形或接近卵形，2～5條營養(yǎng)體前鞭毛和1條后鞭毛；三毛滴蟲18 SrRNA、五毛滴蟲5.8個(gè) SrRNA序列的 PCR分析只得到18個(gè) SrRNA，而18個(gè) SrRNA的測序與 GenBank公司公布的三毛滴蟲胚胎序列有97.2%的相似性。通過對(duì)猴源毛滴蟲的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的研究，證實(shí)其為獼猴源三毛滴蟲，該研究為獼猴腸內(nèi)寄生蟲的鑒別和檢測提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：獼猴；三毛滴蟲；形態(tài)觀察；18SrＲNA序列；基因分析

0 引言

獼猴是一種重要的非人類靈長目，是研究人體健康與疾病的理想動(dòng)物，在普通環(huán)境下飼養(yǎng)的獼猴，會(huì)被寄生體感染，寄生蟲感染對(duì)獼猴的健康和對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響很大。三毛滴蟲是一種寄生在動(dòng)物的腸道內(nèi)的寄生蟲，造成動(dòng)物的反復(fù)拉肚子，對(duì)身體的養(yǎng)分吸收有很大的影響，嚴(yán)重地威脅到了它們的生命，嚴(yán)重威脅到了獼猴的養(yǎng)殖。迄今為止，關(guān)于三毛滴蟲屬的形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等已在豬、貓等物種中進(jìn)行了大量的研究，但關(guān)于其形態(tài)及分子特征的研究卻很少。本文以獼猴腸道毛滴蟲體為研究對(duì)象，利用18 SrRNA基因序列，對(duì)毛滴蟲進(jìn)行了精確的鑒別，為毛滴蟲病的臨床診斷提供了依據(jù)。

1 病原毛滴蟲的分類及其形態(tài)特征

毛滴蟲屬于原蟲門、鞭毛蟲綱、動(dòng)鞭毛綱、毛滴蟲目、毛滴蟲科、毛滴蟲屬、三毛滴蟲屬[1]。

1.1 寄生于人的毛滴蟲

已知四種可寄生于人體的毛滴蟲，即人五毛滴蟲、弱雙核阿米巴、口腔毛滴蟲、陰道毛滴蟲，主要為陰道毛滴蟲。人五毛滴蟲是一種寄生在人類和哺乳類動(dòng)物的腸道中的寄生蟲，具有卵形的細(xì)胞核和1個(gè)副基器，具有4條前鞭毛、1條獨(dú)立的前鞭毛、1條后鞭毛，后鞭毛從波動(dòng)膜的左邊一直到蟲體的末端脫離波動(dòng)膜，并在體外游離。軟質(zhì)雙核阿米巴是阿米巴型的鞭毛蟲，寄生在人體的結(jié)腸黏膜上，沒有包囊，只在滋養(yǎng)體期；直徑7～12μm，長有假足，寬而透明，尖端有分支；由于其結(jié)構(gòu)及抗原特征都屬鞭毛蟲，因此將其歸入毛滴蟲科?？谇幻蜗x寄生在牙垢和齲洞中，前鞭毛4條，后鞭毛沒有游離端，僅有一個(gè)核，在蟲體前方；柱狀結(jié)構(gòu)細(xì)長，沿著昆蟲的尾端延伸。

1.2 寄生于動(dòng)物的毛滴蟲

1.2.1 寄生于豬的毛滴蟲

可感染豬的毛滴蟲有多種分類方法，可以為臨床診斷和治療提供重要依據(jù)，因此，應(yīng)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法進(jìn)行分類分析更具有科學(xué)性。利用三毛滴蟲體18 SrRNA和5毛滴蟲5.8 SrRNA的形態(tài)學(xué)分析，對(duì)毛滴蟲進(jìn)行了初步的分析，結(jié)果表明，三毛滴蟲體與犬胚胎具有97.2%的相似度。研究發(fā)現(xiàn)，在獼猴體內(nèi)的毛滴蟲為三毛滴蟲，在標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)三毛滴蟲和五毛滴蟲的雜交，為獼猴體內(nèi)腸道寄生蟲病的診斷和治療提供依據(jù)[2]。

巴特里四毛滴蟲是一種常見的寄生蟲，主要分布在盲腸、結(jié)腸，有時(shí)在小腸內(nèi)，其體形較圓三毛滴蟲、豬三毛滴蟲為卵形；動(dòng)作迅速，方向不定，常做環(huán)形動(dòng)作，形體變化較大；前部有3～4條不同長度的鞭毛，從尾端向后伸展，呈3～5條波紋。三毛滴蟲以鼻道、胃、盲腸為主要寄生蟲；在小腸中發(fā)現(xiàn)有結(jié)腸，其形態(tài)為長梭，有時(shí)為梨狀；動(dòng)作迅速，3條相同長度的鞭毛在身體的前方，并有一條橫穿整個(gè)身體的波膜。三毛滴蟲（T.ro tun da）是一種寄生于盲腸、結(jié)腸的寄生蟲，其形態(tài)一般為梨形，有時(shí)為圓形或卵形，其活動(dòng)速度較豬三毛滴蟲和巴特里毛滴蟲慢，具有3條前鞭毛，長度基本相同，起伏膜的改變?yōu)楣饣虿ɡ藸?。三毛滴蟲（T.fo et us）是一種寄生在豬腸中的寄生蟲，其外形為卵形，具3～6條前鞭和1條后鞭毛。

1.2.2 寄生于反芻動(dòng)物的毛滴蟲

三毛滴蟲可在牛生殖道內(nèi)寄生，而人五毛滴蟲則能在牛、鹿的腸道內(nèi)寄生。

1.2.3 寄生于犬貓等寵物的毛滴蟲

三毛滴蟲、人五毛滴蟲等均能在犬、貓的腸道中傳播。人五毛滴蟲有感染人類和動(dòng)物的危險(xiǎn)。

2 毛滴蟲的致病性及其危害

毛滴蟲主要是在人體和脊柱的消化和排泄器官中傳播，而在幼蟲的營養(yǎng)期則是它的主要感染期，主要是由糞便、食物等途徑傳播，或者是由宿主傳播，在宿主被感染后，會(huì)發(fā)生二次分化，以吸收滲出液、細(xì)菌等物質(zhì)為養(yǎng)分，在適宜的環(huán)境下，培養(yǎng)基在適宜的環(huán)境中大量增殖，營養(yǎng)液呈圓形，鞭毛向內(nèi)層分化，并在體外生成一個(gè)球狀假囊泡，毛滴蟲可附著于靶臟腺上皮，并可致毒，導(dǎo)致了靶臟癌的發(fā)生。人類五毛滴蟲是一種寄生于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的生物共患病的生物，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，人類五毛滴蟲除了在犬貓之外，在其他種類的非靈長目和嚙齒類的排泄物中也發(fā)現(xiàn)了人類五毛滴蟲[3]。人五毛滴蟲是由人和動(dòng)物誤吃而感染的，比如感染了人的飲水和食品，比如蒼蠅等，感染后會(huì)出現(xiàn)痢疾、肺部感染、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。

本報(bào)告確認(rèn)：陰道毛滴蟲、口腔毛滴蟲可引起結(jié)膜及腦脊液、腎臟的炎癥，除了口腔的毛滴蟲之外，還在肺、胸膜等部位存在著可引起呼吸道疾病的陰道毛滴蟲和人五毛滴蟲。豬毛滴蟲可通過糞便接觸、交配、污染飼料等途徑傳播，通過飲用水等途徑進(jìn)行傳染，其隱性傳染的比例很高，如果在不健康的環(huán)境下，可以發(fā)展成豬毛滴蟲病，主要是以痢疾為主。

有研究顯示，豬三毛滴蟲會(huì)引起陰道炎、頑固性痢疾。三毛滴蟲病是一種常見的寄生蟲，可通過公?；蚱渚簜魅窘o母牛，造成三毛滴蟲病，造成不育癥，早期流產(chǎn)，或子宮積膿。嬰兒三毛滴蟲會(huì)引起貓拉肚子，研究表明，不管貓咪有沒有感染癥狀，都有三毛滴蟲病。禽毛滴蟲是一種常見的寄生蟲，主要是在家禽、火雞、鴿等動(dòng)物的消化道上傳播，可以通過飲水和飼料傳播，一般是因?yàn)槌粤锁澞?，也有可能是吃了帶有蟲子的鴿子而傳染的。前胃發(fā)生壞死性潰瘍，使上消化道、呼吸道堵塞，影響飲食和呼吸，從而導(dǎo)致動(dòng)物死亡。近年來，我國的毛滴蟲病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，一旦出現(xiàn)腹瀉、不孕、生長遲緩或誘發(fā)其他疾病等多種癥狀，對(duì)我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展將產(chǎn)生很大的影響[4]。

3 材料與方法

3.1 樣本

在開放式環(huán)境下，隨機(jī)選取30只獼猴，其體形消瘦，脫水，糞便呈黃棕色。

3.2 儀器及試劑

日本（Olympus）、PCR（美國）、DNA電泳組（美國）、凝膠成像機(jī)（美國）。2 xTaqPCR MasterMix及糞便基因組 DNA的抽提儀、可再生膠液再生試劑盒、盧戈碘液染色劑。

3.3 顯微鏡觀察

將1滴生理鹽水滴入載玻片中心，用竹簽將少量糞便蘸入生理鹽水中，涂成一層薄薄的、均勻的糞膜，用光學(xué)顯微鏡觀察其大體形態(tài)和營養(yǎng)液的形態(tài)。

3.4 毛滴蟲濃集

選擇在低倍顯微鏡下，每一視場中的5只以上的毛滴蟲營養(yǎng)體排樣。用針筒將5ml的糞便樣品在15ml的離心管中輕輕地抽出來，再加5ml的生理鹽水，混合均勻，用一層消毒紗布濾掉2次；然后加入5ml的生理鹽水和濾料混合，用2層或3層紗網(wǎng)過濾2遍，每隔一段時(shí)間將沉淀物除去，用3500r/min的離心機(jī)進(jìn)行5min的分離。稍稍晃動(dòng)，除去上部液體和中間的污物，在2ml的離心式管子底部沉淀1ml，加入1ml的生理鹽水，在3500 r/min的條件下進(jìn)行5min的離心，然后將剩余的液體丟棄。采用管底粗體標(biāo)本進(jìn)行碘溶液的浸漬及 DNA的抽取。

3.5 碘液染色

將濃縮后的試樣10ml放于1.5ml的離心機(jī)中，然后加10μl盧戈碘溶液，混合均勻，放置30s，等染色后將10μl滴在玻璃杯上，用玻璃罩遮蓋，放在一般的光學(xué)顯微鏡下。

3.6 獼猴毛滴蟲基因組DNA提取及PCＲ鑒定

采用濃縮處理的管底物樣品，根據(jù)樣品規(guī)格進(jìn)行了糞便 DNA抽取，測定 DNA含量>40ng/μl，OD260/OD280為1.7～2.0。

3.6.1 18SrＲNA基因序列擴(kuò)增

三毛滴蟲屬18 SrRNA的引物：P1（5'-GCTCG TAGTCAGC-3'）；下游的引子P2（5’-CCCAATTAG AACTCTATCTC-3'）對(duì)18 SrRNA的基因進(jìn)行了擴(kuò)增。PCR反應(yīng)系統(tǒng)：1ml的模板，12.5ml2 xTaqPCRMasterMix，1ml的上、下游引物和25ml的ddH2O，在72℃下延長5min。用1%的瓊脂凝膠電泳法對(duì)10μm PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，然后用膠再生試劑箱對(duì)目標(biāo) DNA進(jìn)行分離，然后進(jìn)行 DNA序列測定。

3.6.2 5.8SrＲNA基因序列擴(kuò)增

五毛滴蟲5.8 SrRNA的引物：P3（5’-TGCTTCAG TTCAGCGGTCTTCC-3'）；在此基礎(chǔ)上，對(duì)（5'-CGG

TAGGTGAACCTGCCGTTGG-3'）進(jìn)行了分析。PCR方法按3.6.1進(jìn)行。PCR反應(yīng)：94℃，5分鐘前進(jìn)行預(yù)處理；94、53、72℃、1min、35次。在72℃下延長5min。用1%的瓊脂凝膠電泳法測定10μlPCR的結(jié)果。

3.7 序列比對(duì)分析與進(jìn)化樹構(gòu)建

采用MegAlign軟件和 BLAST方法進(jìn)行了同源比對(duì)，并使用 MEGA7.0建立了一個(gè)系統(tǒng)演化樹，對(duì)不同種源之間的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析。

4 結(jié)果

4.1 形態(tài)觀察

在高倍顯微鏡下，可以觀察到大量的梨形、月牙形或類似卵形的蟲體，它們的移動(dòng)方向不確定，在蟲體的末端有一條較粗的軸桿狀突起，用碘溶液染色后，蟲體的形狀為卵形或梨形，蟲體末節(jié)有一條鞭毛突出，稱為后鞭毛；用油鏡觀察到的是昆蟲的前鞭，但是用常規(guī)的光學(xué)顯微鏡很難準(zhǔn)確地判別出鞭毛數(shù)。經(jīng)形態(tài)學(xué)分析，從猴腸中分離出的毛滴蟲可以被初步鑒定為猴源。

4.2 獼猴源三毛滴蟲18 SrRNA和5毛滴蟲5.8 SrRNA基因的克隆和序列分析

用1%的瓊脂糖凝膠電泳法對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，9份 PCR產(chǎn)物的目標(biāo)基因條帶在500～750 bp之間。對(duì)目標(biāo)基因條帶進(jìn)行分離、測序，得到了三毛滴蟲18 SrRNA基因序列，共656個(gè) bp。用1%的瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)五毛滴蟲5.8 SrRNA基因片段進(jìn)行 PCR分析，沒有得到300～400 bp的基因條帶。利用 DNASTAR的 Clustalw方法，將18個(gè) SrRNA序列與 GenBank上的代表性序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，從腹瀉狗的糞便中分離出的三毛滴蟲（三毛滴蟲）18 SrRNA序列（注冊號(hào)：AY754332）與其基因序列的相似性最高[5]。

4.3 18SrRNA基因序列的系統(tǒng)演化樹

結(jié)果：從獼猴糞中分離出的蟲體與已報(bào)告的狗胚胎三毛滴蟲18 SrRNA（注冊編號(hào)：AY754332）和從污水中分離的人用三毛滴蟲18 SrRNA（登記編號(hào)：KU939249），與其他毛滴蟲的親緣關(guān)系更近。通過對(duì)18 SrRNA基因序列的分析，確定了獼猴腸內(nèi)的毛滴蟲是猴源性三毛滴蟲。

5 討論

本文通過對(duì)獼猴的毛滴蟲致病特性的分析，以及利用形態(tài)學(xué)和分子學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)其進(jìn)行鑒別的文獻(xiàn)資料，為進(jìn)一步的分析和評(píng)價(jià)該技術(shù)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。毛滴蟲的一生很短，只有一種營養(yǎng)物質(zhì)，它的典型特點(diǎn)是：1個(gè)梨狀或橢圓狀，2～4條或3～5條前鞭，1條后鞭毛。如果是在惡劣的環(huán)境中，比如突然的氣溫變化，或者是有藥劑的作用，那么，營養(yǎng)液就會(huì)出現(xiàn)一些形態(tài)學(xué)上的變化，從而導(dǎo)致營養(yǎng)液的表層出現(xiàn)凹痕，并讓鞭毛向營養(yǎng)體內(nèi)凹陷。通過對(duì)30例猴子的糞便進(jìn)行涂片法的研究，結(jié)果表明：被毛滴蟲病1例、阿米巴原蟲1例、感染鞭蟲1例，其他均無發(fā)現(xiàn)，以毛滴蟲為主要病原體。此次在獼猴體內(nèi)見到的是一只蝌蚪形的毛滴蟲，其移動(dòng)方向是不確定的，前鞭毛2～5條，后鞭毛1條，但常規(guī)顯微鏡下難以正確識(shí)別，也沒有三毛滴蟲鞭毛。通過對(duì)其形態(tài)學(xué)的研究，可以將其作為猴源性的毛滴蟲進(jìn)行初步的研究。

在不同種類的情況下進(jìn)行分類學(xué)的研究，對(duì)于臨床上的疾病和疾病的診治有著重大的指導(dǎo)作用，所以采用常規(guī)的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法進(jìn)行分類學(xué)分析是比較科學(xué)的。采用三毛滴蟲體18 SrRNA和5毛滴蟲5.8 SrRNA的形態(tài)學(xué)方法，對(duì)毛滴蟲進(jìn)行了初步的檢測，發(fā)現(xiàn)從獼猴體內(nèi)提取的三毛滴蟲體與狗胚胎中的18 SrRNA RNA有97.2%的相似性。結(jié)果表明，從獼猴體排泄物中得到的毛滴蟲是三毛滴蟲，采集樣品中沒有三毛滴蟲與五毛滴蟲的雜交。本實(shí)驗(yàn)為獼猴體內(nèi)的腸道寄生蟲病的診治奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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[2] 李建華，韓紅衛(wèi)，宮鵬濤，等.豬三毛滴蟲長春株的形態(tài)觀察及其5.8SrＲNA基因分析[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2019，40（2）：121-124.

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[5] 孟瑩.犬源毛滴蟲的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究[D].吉林大學(xué)，2019.