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    西安某動物醫(yī)院門診貓毛滴蟲病的調查與分析

    2021-03-29 01:46:42王品雪張金鳳
    動物醫(yī)學進展 2021年3期
    關鍵詞:毛滴蟲感染率糞便

    王品雪,張金鳳,馬 麗,姚 倩,林 青,2,3*

    (1.西北農林科技大學動物醫(yī)學院,陜西楊凌 712100;2.家畜疫病病原生物學國家重點實驗室(中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所),甘肅蘭州 730046;3.青海大學省部共建三江源生態(tài)與高原農牧業(yè)國家重點實驗室,青海西寧 810016)

    人五毛滴蟲(Pentatrichomonashominis)和胎兒三毛滴蟲(Tritrichomonasfoetus)是引起貓毛滴蟲病的兩種主要病原,其中以胎兒三毛滴蟲更為常見。Levy G M等[1]首次通過分子生物學方法確定了胎兒三毛滴蟲為貓毛滴蟲病的病原。感染胎兒三毛滴蟲的貓可出現(xiàn)淋巴漿細胞性、中性粒細胞性結腸炎和慢性惡臭大腸性腹瀉[2],一些幼貓甚至會出現(xiàn)大便失禁[3]。胎兒三毛滴蟲可寄生于多種宿主的不同部位,蟲體通過糞-口途徑傳播[2]。貓?zhí)喝蜗x的感染率視檢測方法而定,在2%~82%范圍內不等[4-8]。感染胎兒三毛滴蟲并出現(xiàn)腹瀉癥狀的貓多為幼貓,年齡范圍為1月齡至16歲不等[2,9]。人五毛滴蟲宿主范圍廣泛,定殖于多種脊椎動物的腸道內,呈世界性分布。人、犬和貓等不同宿主來源的人五毛滴蟲均為同一蟲種,因而存在人獸共患風險。一般情況下,感染人五毛滴蟲并不會出現(xiàn)明顯的臨床癥狀,但當宿主體況不佳或免疫力下降時,則會引發(fā)胃腸道反應,造成宿主胃腸不適[10-11]。

    貓毛滴蟲病作為一種臨床常見的消化道疾病,可引起貓的腹瀉,主要表現(xiàn)為頻繁排出少量液態(tài)至半成型狀態(tài)的糞便,通?;煊醒汉宛つぃ疟憔o張,對貓的健康帶來威脅,已經引起了獸醫(yī)學領域的重視。近年來,病原性原蟲的檢測技術得到提升,除了常規(guī)化驗檢測以外,分子生物學技術如聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction,PCR)技術在臨床也得到運用。本研究擬通過分子生物學方法對西安某動物醫(yī)院門診貓毛滴蟲病的感染情況進行調查,以期為該病的臨床診療和預防提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 糞便樣品來源 樣本均來自西安某動物醫(yī)院2018年-2019年來院就診貓,總計57份糞便樣品,其中春季2份、夏季21份、秋季15份和冬季19份。所有樣本均使用采便器直接從就診動物直腸內取出,保存于生理鹽水中,并進行光學顯微鏡鏡檢。鏡檢后剩余樣品冷藏運輸回實驗室,置-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.2 主要試劑 Diff-Quik染色液,珠海貝索生物技術有限公司產品;EZNA?Stool DNA 試劑盒(D4015-02),OMEGA Bio-Tek公司產品;dNTP Mixture(2.5 mmol/L)、溴化乙錠(Ethidium bromide,EB)、TaKaRa公司產品;TaqDNA Polymerase,康為世紀公司產品;瓊脂糖、6×Loading buffer、DNA標準DL2 000等,北京擎科新業(yè)生物技術有限公司產品;其他試劑為國產分析純。

    1.1.3 主要儀器 HC-3018高速離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司產品;VORTEX-5渦旋混合器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司產品;TC-XP-D型PCR儀,杭州博日科技有限公司產品;DYY-7C電泳儀,北京六一生物科技有限公司產品。

    1.2 方法

    1.2.1 糞便檢查 采集的糞便直接涂片鏡檢,在光學顯微鏡下(放大倍數(shù)100×40)尋找有無運動的毛滴蟲。如未發(fā)現(xiàn)運動的蟲體,可進行染色鏡檢。按Diff-Quik染色液操作步驟進行。在光學顯微鏡下(放大倍數(shù)10×1 000)觀察結果。

    1.2.2 糞便樣品DNA提取 冷凍儲存的糞便樣品解凍后按照OMEGA D4015 E.Z.N.A.?Stool DNA Kit病原檢測說明書進行DNA提取,提取后的DNA置于-20℃保存,用于PCR擴增。

    1.2.3 引物的設計 參考GenBank公布的人五毛滴蟲ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段(AY758392.1),用Primer Premier 5設計其特異性內、外側引物(表1)。參考GenBank公布的胎兒三毛滴蟲ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段(AF466749.1)設計胎兒三毛滴蟲的外側引物,其內側引物參照文獻[12]設計的引物序列(表1)。引物均由北京擎科生物科技有限公司西安分公司合成。

    表1 ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段的引物

    1.2.4 毛滴蟲套式PCR擴增 PCR反應體系為25 μL:10×PCR buffer(15 mmol/L Mg2+)2.5 μL,dNTP mixture(2.5 mmol/L)2 μL,上、下游引物各1 μL,TaqDNA polymerase(5 U/μL)0.125 μL,DNA模板1 μL,滅菌雙蒸水補至25 μL。人五毛滴蟲第1輪PCR反應參數(shù)為:94℃ 5 min;94℃ 30 s,51.5℃ 30 s,72℃ 1 min,循環(huán)30次;72℃再延伸10 min;第2輪PCR反應參數(shù)將第1輪中退火溫度改為52℃,再次延伸時間改為7 min,其余條件不變。胎兒三毛滴蟲第1輪PCR反應參數(shù)為:94℃ 5 min;94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 1 min,循環(huán)30次;72℃再延伸10 min;第2輪PCR反應參數(shù)將第1輪中退火溫度改為54℃,再次延伸時間改為7 min,其余條件不變。所得PCR產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,紫外成像儀觀察結果。

    1.2.5 DNA測序與分析 將陽性PCR產物送至北京擎科生物科技有限公司西安分公司測序,在NCBI上進行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),并用MegAlign軟件將獲得的ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段與已報道的參考序列進行比對分析,確定蟲種。

    1.2.6 統(tǒng)計分析 利用SPSS 20.0軟件,按照不同季節(jié)和貓的年齡、性別、腹瀉癥狀、品種等不同因素對貓毛滴蟲的感染率分別進行差異顯著性分析,運用卡方檢驗和費希爾精確檢驗得出結果,當P<0.01時,差異極顯著;P<0.05時,差異顯著;P>0.05時,差異不顯著。

    2 結果

    2.1 光學顯微鏡觀察結果

    直腸采集的糞便立即在顯微鏡下鏡檢,可觀察到突進式運動的毛滴蟲,蟲體呈半透明的水滴樣。Diff-Quik染色后放大1 000倍可看到位于蟲體一側的波動膜與細胞核,蟲體中部有一與波動膜平行的軸桿,同時可觀察到滴蟲有4根鞭毛,其中前鞭毛3根,后鞭毛1根(圖1)。本次共收集到貓的糞便樣品57份,光學顯微鏡檢出毛滴蟲陽性樣品數(shù)為12份,即通過臨床光學顯微鏡檢查結果顯示,貓的毛滴蟲感染率為21.1%。

    圖1 毛滴蟲光學顯微鏡檢查結果(1 000×)

    2.2 套式PCR檢查結果

    用套式PCR分別對人五毛滴蟲以及胎兒三毛滴蟲ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段進行擴增,結果與預期相同,即人五毛滴蟲片段長度為548 bp(圖2),胎兒三毛滴蟲片段長度為348 bp(圖3)。

    M.DNA標準DL 2 000;N.陰性對照;1~4.糞便樣品

    M.DNA標準DL 2 000;N.陰性對照;1~5.糞便樣品

    57份貓的糞便樣品經套式PCR檢測,結果顯示,貓的毛滴蟲陽性樣品總數(shù)為28份,總感染率為49.1%。其中檢出人五毛滴蟲陽性樣品3份,即貓的人五毛滴蟲感染率為5.3%;檢出胎兒三毛滴蟲陽性樣品27份,即貓的胎兒三毛滴蟲感染率為47.4%;其中有2份樣品同時檢出了人五毛滴蟲和胎兒三毛滴蟲,即二者的混合感染率為3.5%(表2)。

    表2 貓毛滴蟲的感染率

    2.3 貓毛滴蟲感染情況的影響因素分析

    本次檢測結果顯示,有人五毛滴蟲和胎兒三毛滴蟲共2種毛滴蟲的感染。但由于人五毛滴蟲陽性樣品數(shù)僅有3例,故不做統(tǒng)計分析,僅對胎兒三毛滴蟲的感染率進行統(tǒng)計學分析。結果顯示,貓?zhí)喝蜗x的感染率在不同季節(jié)間存在顯著差異(P<0.05),其中,春季最高為100%,秋、冬季相對較低,分別為33.3%和31.6%。而年齡、性別、腹瀉癥狀和品種因素等均對貓?zhí)喝蜗x的感染率無顯著性影響(P>0.05)(表3、表4)。

    表3 貓?zhí)喝蜗x感染情況的影響因素分析

    表4 貓?zhí)喝蜗x感染情況的品種因素分析

    2.4 序列比對分析結果

    測序共得到11條胎兒三毛滴蟲ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列片段,這些片段經Blast和MegAlign軟件比對分析,顯示與已報道的胎兒三毛滴蟲核酸序列相似性高達99%以上(圖4)。

    3 討論

    本次調查在西安某動物醫(yī)院就診的貓中同樣也檢出了胎兒三毛滴蟲和人五毛滴蟲,且貓?zhí)喝蜗x的感染率明顯高于人五毛滴蟲的。調查結果表明,貓?zhí)喝蜗x的感染率在不同季節(jié)的差異性顯著,其中,春季和夏季的感染率較高,而冬季的感染率最低。雖然受樣本量的影響,貓?zhí)喝蜗x易感性與季節(jié)的相關性仍需通過更多的調查與研究來明確,但是春季和夏季氣候溫暖,胎兒三毛滴蟲在濕潤的糞便中能存活較長時間[2],這有利于毛滴蟲病的傳播。對臨床病例進行診斷時,也提示有必要基于流行季節(jié)做出預判。本次調查結果還表明,年齡、性別、腹瀉癥狀、品種等因素均對貓?zhí)喝蜗x的感染率無顯著性影響。無論幼齡貓還是成年貓均可感染胎兒三毛滴蟲。感染胎兒三毛滴蟲的貓的年齡范圍為1月齡至16歲不等[2,9],本次調查也發(fā)現(xiàn)成年貓感染胎兒三毛滴蟲。報道稱貓?zhí)喝蜗x易感性沒有性別傾向性[4,13]。本研究結果也表明,貓?zhí)喝蜗x的感染率與貓的性別之間無顯著性關聯(lián)。腹瀉是貓毛滴蟲病的一項主要臨床表現(xiàn),關于胎兒三毛滴蟲感染的報道多是基于患貓出現(xiàn)腹瀉癥狀后進行檢測[4,14-15]。有報道稱,腹瀉癥狀與貓?zhí)喝蜗x感染存在聯(lián)系[16-17],也有報道稱貓?zhí)喝蜗x感染與糞便狀態(tài)無顯著聯(lián)系[5,8]。本次調查顯示,貓腹瀉表現(xiàn)與感染胎兒三毛滴蟲無顯著性關聯(lián),考慮到樣本數(shù)量相對較少的因素,建議后續(xù)做進一步的調查研究。關于品種因素,純種貓群有感染率較高[18-19],但純種貓和混血貓都可能感染胎兒三毛滴蟲[13]。本次調查的結果同樣顯示,不同品種的貓對胎兒三毛滴蟲的感染率無顯著性差異。

    胎兒三毛滴蟲和人五毛滴蟲是毛滴蟲中的兩個重要種類,均可寄生于多種動物和人類,尤其在與人們關系最為密切的伴侶動物犬和貓中常見。盡管這兩種毛滴蟲感染后多呈亞臨床感染,但無論是考慮保護動物健康,還是關注人獸共患病的潛在傳播風險,均需要引起人們的高度重視。

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