• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及應(yīng)用研究概述

    2021-03-31 05:31:58馮江浩魏思昂閆麗歡
    關(guān)鍵詞:外源小鼠活性

    馮江浩,魏思昂,閆麗歡,崔 潔,馮 焱*

    (1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院,山西太谷 030801;2.山西省太原市食品藥品檢驗(yàn)所,山西太原 030000)

    基因編輯技術(shù)是分子生物學(xué)研究中的重要手段,通過對目的片段序列的改變,從而影響基因的功能。它的出現(xiàn)推進(jìn)分子生物學(xué)的進(jìn)程,提高了對于基因結(jié)構(gòu)功能的研究效率。目前基因編輯的主要手段有3種,包括鋅指核酸酶 (zinc finger endonuclease,ZFN)技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技術(shù)和CRISPR/Cas9技術(shù)[1]。其中ZFN由于構(gòu)建繁瑣,逐漸被TALEN和CRISPR/Cas9所取代。CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌中對于外源DNA的一種防御機(jī)制,主要功能是對外源侵入的噬菌體以及外源質(zhì)粒進(jìn)行切割,破壞DNA結(jié)構(gòu),使其失去活性,無法轉(zhuǎn)錄以及翻譯蛋白對自身產(chǎn)生影響。CRISPR/Cas系統(tǒng)最早于1987年被發(fā)現(xiàn)有規(guī)律的重復(fù)序列,這些重復(fù)序列與噬菌體內(nèi)序列高度同源。Ⅱ型Cas9有核酸內(nèi)切酶活性[2]。在小鼠上實(shí)現(xiàn)基因編輯操作,將CRISPR/Cas9應(yīng)用于實(shí)際操作[3]。與TALEN相比,CRISPR/Cas9具有更加簡單的構(gòu)建過程和高效的剪切效率,但脫靶效應(yīng)也是限制其發(fā)展的核心問題之一。近年來CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)廣泛用于構(gòu)建動(dòng)物模型以及細(xì)胞層面的研究。

    1 CRISPR/Cas系統(tǒng)組成

    1.1 CRISPR/Cas結(jié)構(gòu)與分類

    CRISPR/Cas系統(tǒng)依Cas蛋白的不同可分為2個(gè)大類,5個(gè)亞型[4]。其中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ為第1類,Ⅱ、Ⅴ為第2類[10]。CRISPR/Cas系統(tǒng)分為CRISPR序列和Cas蛋白,CRISPR序列是一段DNA序列,由多個(gè)重復(fù)的單元構(gòu)成,每個(gè)單元由一段長度為24 bp~48 bp的高度保守的重復(fù)序列和26 bp~72 bp的間隔序列組成,稱為簇狀短回文間隔重復(fù)序列[5]。間隔序列是與外源DNA同源的序列,通過轉(zhuǎn)錄CRISPR-derived RNA(crRNA)指導(dǎo)Cas蛋白對目的序列的匹配。另一個(gè)部分是Cas蛋白家族和crRNA與Trans-activting crRNA(trRNA)形成的復(fù)合體,Cas蛋白家族的基因序列位于CRISPR序列上游與之相鄰,每一個(gè)類型的CRISPR/Cas系統(tǒng)所含的蛋白不同,功能亦不同。

    1.2 CRISPR/Cas功能

    CRISPR/Cas系統(tǒng)中CRISPR序列的功能是整合與指導(dǎo)作用,通過轉(zhuǎn)錄出crRNA指導(dǎo)Cas蛋白對目的序列進(jìn)行精準(zhǔn)切割。是一段與外源DNA同源的DNA序列,由Cas1、Cas2和Cas4將外源序列剪切后添加到CRISPR序列中。Cas蛋白是CRISPR/Cas系統(tǒng)中的功能運(yùn)行單位,不同Cas蛋白配合將外源DNA序列進(jìn)行處理,整合獲取外源序列信息,之后由具有DNA內(nèi)切酶活性的Cas蛋白對目的序列進(jìn)行切割,破壞外源DNA結(jié)構(gòu)達(dá)到防御目的,這一過程中需要CRISPR序列轉(zhuǎn)錄的crRNA指導(dǎo)及trRNA的激活,形成有活性RNA-Cas蛋白復(fù)合體。

    2 CRISPR/Cas系統(tǒng)運(yùn)行機(jī)制

    CRISPR/Cas系統(tǒng)由于組成不同可分為外源DNA侵入與處理、前體crRNA轉(zhuǎn)錄加工和Cas蛋白識(shí)別切割三個(gè)階段。以Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)為例。首先是外源DNA侵入到細(xì)胞內(nèi)部并在細(xì)胞內(nèi)部展開,暴露出其DNA序列,之后4個(gè)Cas1與2個(gè)Cas2蛋白形成一個(gè)復(fù)合體,根據(jù)外源DNA的形狀不同附著其上進(jìn)行切割[6]。位置位于重復(fù)序列的5′端稱為原間隔序列的部位,形成一段短的DNA片段,此DNA片段會(huì)被插入到CRISPR序列的前端位于前導(dǎo)序列后的第1個(gè)重復(fù)序列上。第二步是CRISPR序列由RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,CRISPR序列轉(zhuǎn)錄出前體crRNA[3]。此crRNA無活性,包含CRISPR序列啟動(dòng)子后所有的重復(fù)序列與間隔序列單元。CRISPR序列中的重復(fù)序列會(huì)轉(zhuǎn)錄出于前體crRNA序列中互補(bǔ)的trRNA[7-8]。當(dāng)前體crRNA中的一個(gè)crRNA單元與互補(bǔ)的trRNA配對后同時(shí)與Cas9蛋白結(jié)合時(shí)由RNase Ⅲ對前體crRNA進(jìn)行切割形成具有活性的crRNA,一個(gè)完整的具有切割外源DNA活性crRNA-trRNA-Cas9復(fù)合體形成。第3步是Cas9蛋白復(fù)合體對外源DNA進(jìn)行切割,降解外源DNA,此過程是Cas9蛋白復(fù)合體對目的序列的識(shí)別。是由Cas9蛋白先對目標(biāo)DNA上的PAM序列進(jìn)行識(shí)別出匹配的protospacer adjacent motif(PAM)序列后由Cas9蛋白復(fù)合體內(nèi)的crRNA序列與PAM序列后長度約為23 bp的DNA序列的互補(bǔ)鏈進(jìn)行匹配。成功后Cas9蛋白的酶切活性區(qū)域在PAM序列的5′ 端進(jìn)行切割,形成DNA雙鏈斷裂破壞DNA結(jié)構(gòu)完整性使外源DNA失活,完成一個(gè)完整的防御外源DNA過程。

    3 CRISPR/Cas9缺陷及優(yōu)化

    天然的CRISPR/Cas系統(tǒng)十分復(fù)雜且過于龐大,第1類中的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型CRISPR/Cas系統(tǒng)由于其中的Cas蛋白種類多,且識(shí)別與切割目的序列的部位于同一個(gè)Cas蛋白上,在應(yīng)用中不易操作,所以不常用于基因編輯處理,第2類中的Ⅱ、Ⅴ型CRISPR/Cas系統(tǒng)中的Cas蛋白種類少,且識(shí)別與切割目的DNA序列的結(jié)構(gòu)都位于同一個(gè)Cas蛋白上,是實(shí)際應(yīng)用中的理想材料。

    在基因編輯操作中只需要CRISPR/Cas系統(tǒng)中對于目的序列的識(shí)別與切割的能力,因此CRISPR序列就成為可去除的非必要部分,只保留能夠正常轉(zhuǎn)錄翻譯Cas9蛋白的DNA序列。在基因編輯操作中通常只有1到2個(gè)目標(biāo)位點(diǎn),不需要CRISPR序列中完整龐大的多余序列,所以CRISPR序列可被人為轉(zhuǎn)錄的crRNA所代替,省略前體crRNA的處理步驟。此外,同過將trRNA與crRNA連接在同一條RNA鏈上形成單一的引導(dǎo)RNA (gRNA) 可進(jìn)一步簡化Cas9在實(shí)際應(yīng)用上的操作。常用的Cas9主要有從鏈膿桿菌 (Streptococcuspyogenes,spCas9)中獲得的spCas9和從金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus,saCas9) 中獲得的saCas9[8-9]。spCas9被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的基因編輯操作,而saCas9因其序列較短更加適合由噬菌體攜帶,因此更適用于基因治療的研究。不同Cas9蛋白識(shí)別的PAM序列不同,根據(jù)使用要求,采用噬菌體共進(jìn)化的方法,產(chǎn)生多種spCas9的亞種可識(shí)別多種長度,序列不同的PAM序列[10]。進(jìn)一步擴(kuò)大Cas9可識(shí)別的DNA序列范圍,達(dá)到更加靈活的應(yīng)用。

    dCas9是一種沒有DNA內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白變體。其可以同gRNA與DNA的匹配結(jié)合到目的序列上,但不能夠?qū)NA雙鏈進(jìn)行切割,形成DNA雙鏈斷裂,可以額外連接上切割DNA雙鏈中一條鏈的酶,設(shè)計(jì)兩個(gè)切割位點(diǎn),從而提高編輯精確程度。在動(dòng)物試驗(yàn)中,為了獲得正確的試驗(yàn)體,對于切割靶點(diǎn)的選擇以及gRNA序列的設(shè)計(jì),選擇合適的靶點(diǎn)以及gRNA設(shè)計(jì)是對于降低脫靶效率的關(guān)鍵步驟。對Cas9蛋白的不斷突變產(chǎn)生多種識(shí)別不同PAM序列的變體,一方面擴(kuò)展Cas9可識(shí)別的序列種類,也降低脫靶的可能性[11]。從Cas9蛋白入手將限制性內(nèi)切酶的Fok I區(qū)連接到無催化活性的Cas9 (dead Cas9,dCas9) 上,當(dāng)兩個(gè)dCas9形成二聚體才能切割形成DSBs,設(shè)計(jì)兩個(gè)gRNA靶點(diǎn)來切割一個(gè)位點(diǎn),來降低脫靶效率[12]。用GAL4/UAS二元系統(tǒng)對CRISPR/Cas9進(jìn)行改造,使其可以在果蠅中組織特異性表達(dá),增加CRISPR/Cas9的精準(zhǔn)性,降低脫靶可能帶來的危害。對于實(shí)驗(yàn)體的脫靶檢測也是于設(shè)計(jì)相對應(yīng)的步驟,選擇合適的檢測手段,降低假陽性與假陰性的出現(xiàn),提高檢測精準(zhǔn)度[13]。

    4 CRISPR/Cas9應(yīng)用

    4.1 研究領(lǐng)域應(yīng)用

    4.1.1 基因敲入與敲除 CRISPR/Cas9系統(tǒng)最常用于基因敲除與敲入,對于某些基因位點(diǎn)的敲除效率能達(dá)到95%以上[14]。用Cas9蛋白作為DNA內(nèi)切酶靶向切割DNA序列,產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂,經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)的同源重組(HDR)或非同源末端重組(NHEJ)將DSBs修復(fù)。HDR修復(fù)常用于Cas9基因編輯操作,可以根據(jù)人為提供的具有同源臂的模板進(jìn)行DBSs的修復(fù),達(dá)到基因敲入的操作。設(shè)計(jì)兩條gRNA對目的序列上、下游進(jìn)行匹配達(dá)到基因定點(diǎn)敲除的操作。將Cas9基因連接上具有組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子并整合到基因組中,可實(shí)現(xiàn)Cas9組織特異性的表達(dá),達(dá)到具有組織特異性的切除目的DNA的能力[13]。對于某些致死基因的敲除可使用cre-LoxP系統(tǒng)制備條件性敲除的動(dòng)物模型使目的基因在動(dòng)物體內(nèi)有條件性地敲除保證個(gè)體存活[14-15]。條件性敲除需要的制備兩個(gè)LoxP插入位點(diǎn)的donor,在小鼠試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雙donor效率要低于整合的單donor效率[16]。在基因序列中插入LoxP序列難度較大需要多次斷裂重組,在斑馬魚中實(shí)現(xiàn)了不需要HR的一步插入LoxP序列的方式。在敲入操作中同樣由于會(huì)有目的基因序列的插入需要制備donor,因此對于細(xì)胞的修復(fù)方式就更傾向于準(zhǔn)確性更高的HR修復(fù)[17]。在兔模型中敲入操作中HR修復(fù)促進(jìn)劑RS-1對提高插入成功率有顯著效果,而NHEJ抑制劑SCRP-7對于敲入成功率無顯著影響[18]。隨著更多的Cas蛋白的開發(fā),CRISPR/Cas9系統(tǒng)有了更多的功能,最常用的仍是其基本的敲入與敲除功能。

    4.1.2 DNA單堿基突變 大多數(shù)基因編輯操作都是基于對DNA雙鏈切割形成DSBs后通過細(xì)胞內(nèi)修復(fù)方式進(jìn)行,這種方法可插入或去除較長的基因序列,對于單個(gè)核苷酸的突變需求操作過于繁瑣。Cas9的突變體dCas9由于人為突變失去了對DNA雙鏈切割形成DSBs的酶活性,將dCas9與胞苷脫氨酶混合后可將胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏亩纬蒀-T,G-A的突變達(dá)到點(diǎn)突變的效果,此方法不需要形成DNA雙鏈斷裂,降低錯(cuò)配可能性,提高編輯效率。此外dCas13可對RNA進(jìn)行點(diǎn)突變,在不改變DNA序列的情況下對轉(zhuǎn)錄后修飾有很大的應(yīng)用空間。

    4.1.3 表觀遺傳調(diào)控 表觀遺傳調(diào)控是不改變DNA序列而對性狀進(jìn)行調(diào)控,用dCas9突變失去切割DNA雙鏈的能力,保留對于目標(biāo)序列的識(shí)別能力,設(shè)計(jì)一段與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子等相關(guān)原件匹配的gRNA序列使dCas9能夠識(shí)別并結(jié)合在目標(biāo)位點(diǎn)上,同時(shí)可在dCas9上連接相應(yīng)的激活或抑制蛋白,達(dá)到激活或抑制目標(biāo)DNA的轉(zhuǎn)錄,以此來調(diào)控生物個(gè)體的性狀。

    4.2 動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用

    4.2.1 疾病模型構(gòu)建 用CRISPR/Cas9進(jìn)行動(dòng)物疾病模型的構(gòu)建是基于其對基因的插入以及缺失的功能,構(gòu)建各種基因缺陷型的疾病模型來模擬各種情況。心腦血管疾病、糖尿病、肥胖等都可以用CRISPR/Cas9 進(jìn)行模型的構(gòu)建。CRISPR/Cas9能夠構(gòu)建的動(dòng)物疾病模型類型多范圍廣,不論是小動(dòng)物模型諸如小鼠、大鼠、斑馬魚等或是大動(dòng)物模型如兔、豬等都可使用。從2013年成功用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對小鼠受精卵進(jìn)行編輯后,許多不同疾病模型相繼構(gòu)建成功[19-22]。近年來用CRISPR/Cas9 進(jìn)行模型構(gòu)建的技術(shù)趨于成熟,對疾病的發(fā)病機(jī)制有很大幫助。有研究成功構(gòu)建出肺鱗狀細(xì)胞癌的小鼠模型,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了免疫療法的試驗(yàn)[23]。通過CRISPR/Cas9 在Notch3的第33個(gè)外顯子上插入了終止序列阻止其完整翻譯蛋白,致小鼠表現(xiàn)出腦膜側(cè)綜合癥的癥狀,并在大動(dòng)物模型構(gòu)建方面成功構(gòu)建出豬的亨廷頓氏舞蹈癥模型,闡述了亨廷頓氏舞蹈癥模型中的神經(jīng)退行性變化[24]。

    4.2.2 基因治療 基因治療的一個(gè)策略是使用腺病毒作為載體搭載Cas9系統(tǒng)的DNA,較為合適的是SaCas9蛋白。SaCas9蛋白的基因組序列很短約為3 300 bp,適合由經(jīng)過改造的腺病毒攜帶,注入到細(xì)胞內(nèi)部[25]。研究表明,用腺病毒攜帶saCas9蛋白基因,將其運(yùn)送到被人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的T細(xì)胞內(nèi),對新產(chǎn)生的HIV進(jìn)行切割,阻止其繼續(xù)擴(kuò)散至其他細(xì)胞,有效降低HIV的擴(kuò)散,達(dá)到對HIV的抑制[26]。在人類胚胎中用CRISPR/Cas9修正了MYCBPC3基因的致病性突變解決了胚胎的遺傳性肥厚型心肌病[27]。通過對遺傳性酪氨酸血癥小鼠用注射的方式成功使小鼠的部分肝細(xì)胞表達(dá)Fah蛋白緩解了體重降低的現(xiàn)象[28]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在腫瘤的免疫療法中的可行性已得到初步驗(yàn)證,在非小細(xì)胞肺癌的免疫治療中,將患者自身的T細(xì)胞取出并用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除PD-1基因后進(jìn)行擴(kuò)增,再注入患者體內(nèi)以達(dá)到抗腫瘤的目的[29]。

    猜你喜歡
    外源小鼠活性
    具有外源輸入的船舶橫搖運(yùn)動(dòng)NARX神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測
    陽桃根化學(xué)成分及其體外抗腫瘤活性
    中成藥(2021年5期)2021-07-21 08:38:32
    小鼠大腦中的“冬眠開關(guān)”
    外源鉛脅迫對青稞生長及鉛積累的影響
    簡述活性包裝的分類及應(yīng)用(一)
    上海包裝(2019年2期)2019-05-20 09:10:52
    金絲草化學(xué)成分及其體外抗HBV 活性
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:19:49
    外源鈣對干旱脅迫下火棘種子萌發(fā)的影響
    米小鼠和它的伙伴們
    外源添加皂苷對斑玉蕈生長發(fā)育的影響
    Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
    少妇的逼好多水| 伦理电影免费视频| 国产精品一区二区性色av| 成人综合一区亚洲| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲欧洲日产国产| 中文天堂在线官网| 成人一区二区视频在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 在线观看国产h片| 日韩伦理黄色片| 亚洲中文av在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日本av手机在线免费观看| 在线观看一区二区三区| h日本视频在线播放| 国产深夜福利视频在线观看| 97热精品久久久久久| 亚洲综合色惰| 国产熟女欧美一区二区| 一级爰片在线观看| 五月天丁香电影| 日韩av免费高清视频| 人体艺术视频欧美日本| 最近最新中文字幕大全电影3| av不卡在线播放| 青春草亚洲视频在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 熟女电影av网| 99久久精品一区二区三区| 免费看av在线观看网站| 国模一区二区三区四区视频| 国产精品免费大片| 最新中文字幕久久久久| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久久精品免费免费高清| a级毛色黄片| 综合色丁香网| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲电影在线观看av| 成人综合一区亚洲| 欧美丝袜亚洲另类| 嫩草影院入口| 99久久中文字幕三级久久日本| 全区人妻精品视频| 久久热精品热| www.av在线官网国产| 成年免费大片在线观看| 日韩强制内射视频| 黄色日韩在线| 久久久久网色| 美女国产视频在线观看| 黄色一级大片看看| 乱系列少妇在线播放| www.色视频.com| 久久婷婷青草| 亚洲精品国产av成人精品| 最黄视频免费看| 久久亚洲国产成人精品v| 国产成人免费无遮挡视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 香蕉精品网在线| 亚州av有码| 亚洲av二区三区四区| 一级a做视频免费观看| .国产精品久久| 久久久久性生活片| 美女国产视频在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 国产高清国产精品国产三级 | 18+在线观看网站| 午夜老司机福利剧场| 黄片无遮挡物在线观看| 青春草视频在线免费观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| av.在线天堂| 成人二区视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲精品视频女| 久久婷婷青草| 男人爽女人下面视频在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 性高湖久久久久久久久免费观看| 内地一区二区视频在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 草草在线视频免费看| 九九在线视频观看精品| 精品亚洲成国产av| 一本一本综合久久| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区四那| 少妇人妻精品综合一区二区| 激情五月婷婷亚洲| freevideosex欧美| 亚洲最大成人中文| 日日啪夜夜爽| 国产高清有码在线观看视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 尾随美女入室| 插阴视频在线观看视频| 黄片wwwwww| 免费看光身美女| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲欧洲日产国产| 久久精品国产自在天天线| 女性生殖器流出的白浆| 一级爰片在线观看| 国产视频内射| 美女福利国产在线 | 国产男女内射视频| 日韩制服骚丝袜av| 2022亚洲国产成人精品| www.av在线官网国产| 亚洲第一av免费看| 欧美丝袜亚洲另类| 18禁在线播放成人免费| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲一区二区三区欧美精品| 成人一区二区视频在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 夫妻午夜视频| 中文欧美无线码| a级一级毛片免费在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲第一区二区三区不卡| 18+在线观看网站| 国产精品一区www在线观看| 精品一区在线观看国产| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久亚洲国产成人精品v| 国产69精品久久久久777片| 18禁在线播放成人免费| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 男人添女人高潮全过程视频| 在线 av 中文字幕| 国产精品欧美亚洲77777| 久久久午夜欧美精品| 亚洲成色77777| 麻豆成人av视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久这里有精品视频免费| 男人狂女人下面高潮的视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久精品国产自在天天线| 亚洲电影在线观看av| 国产毛片在线视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 简卡轻食公司| av在线播放精品| 七月丁香在线播放| 婷婷色麻豆天堂久久| 日本黄色日本黄色录像| 少妇精品久久久久久久| 国产在视频线精品| 草草在线视频免费看| 久久精品人妻少妇| 精品酒店卫生间| 蜜桃在线观看..| 久久久久久人妻| 久久久色成人| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 婷婷色综合www| 有码 亚洲区| 亚洲精品视频女| 女性生殖器流出的白浆| 欧美成人午夜免费资源| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美另类一区| 少妇被粗大猛烈的视频| .国产精品久久| 国产精品人妻久久久久久| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久久久成人免费电影| 久久久欧美国产精品| 国产精品久久久久久久久免| 国产成人a∨麻豆精品| 精品人妻视频免费看| 亚洲最大成人中文| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产高清有码在线观看视频| 久久99精品国语久久久| 欧美日本视频| 精品一区在线观看国产| 街头女战士在线观看网站| 国产深夜福利视频在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产高清三级在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 嫩草影院新地址| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲人成网站在线观看播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 超碰97精品在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 精品人妻视频免费看| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产日韩欧美在线精品| 国产精品伦人一区二区| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产在视频线精品| 激情五月婷婷亚洲| 国产精品人妻久久久影院| av福利片在线观看| 精品人妻视频免费看| 亚洲国产成人一精品久久久| 大话2 男鬼变身卡| 日韩一区二区三区影片| 欧美性感艳星| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 观看av在线不卡| 麻豆乱淫一区二区| 欧美+日韩+精品| 国产精品爽爽va在线观看网站| 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩伦理黄色片| 极品教师在线视频| av免费观看日本| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美精品一区二区免费开放| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美区成人在线视频| 深爱激情五月婷婷| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 岛国毛片在线播放| 草草在线视频免费看| 成人二区视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 免费看av在线观看网站| 在线观看美女被高潮喷水网站| 青春草视频在线免费观看| 日韩大片免费观看网站| 精品一区二区三卡| 欧美日韩视频精品一区| 色5月婷婷丁香| 亚洲成人中文字幕在线播放| 秋霞在线观看毛片| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产乱人视频| av在线app专区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 制服丝袜香蕉在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲精品国产av成人精品| 老熟女久久久| 欧美人与善性xxx| 边亲边吃奶的免费视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲第一av免费看| .国产精品久久| 夫妻性生交免费视频一级片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产在线一区二区三区精| 插阴视频在线观看视频| 国产精品欧美亚洲77777| 日韩av不卡免费在线播放| 久久久欧美国产精品| 伊人久久精品亚洲午夜| av在线老鸭窝| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产亚洲最大av| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 欧美+日韩+精品| 少妇精品久久久久久久| 亚洲av综合色区一区| 高清欧美精品videossex| 麻豆国产97在线/欧美| 少妇人妻 视频| 色综合色国产| 亚洲精品456在线播放app| 国产精品一区www在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 寂寞人妻少妇视频99o| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 97精品久久久久久久久久精品| 一级毛片我不卡| 22中文网久久字幕| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲,欧美,日韩| 久久国产精品大桥未久av | tube8黄色片| 欧美精品亚洲一区二区| 91精品国产国语对白视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲怡红院男人天堂| 插逼视频在线观看| kizo精华| 性色av一级| av卡一久久| 国产精品一区二区在线不卡| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久精品人妻少妇| 国产成人freesex在线| 国产精品久久久久久久久免| 春色校园在线视频观看| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲av男天堂| 99热国产这里只有精品6| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 久久久久久久国产电影| 久久久色成人| 久久精品久久精品一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美+日韩+精品| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 一级黄片播放器| 美女内射精品一级片tv| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲怡红院男人天堂| 中文欧美无线码| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 在线天堂最新版资源| 日本黄色日本黄色录像| 另类亚洲欧美激情| 亚洲图色成人| 久久久久性生活片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产亚洲精品久久久com| 久久6这里有精品| 国产男人的电影天堂91| 日韩三级伦理在线观看| 国产 一区精品| 久久99蜜桃精品久久| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产男女超爽视频在线观看| 久久热精品热| 精品国产乱码久久久久久小说| 十分钟在线观看高清视频www | 国产91av在线免费观看| 国产色爽女视频免费观看| 午夜免费观看性视频| 日韩国内少妇激情av| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 青春草国产在线视频| 亚洲四区av| 一级毛片我不卡| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久久久久人妻| 国产伦理片在线播放av一区| kizo精华| 一个人看视频在线观看www免费| 久久精品国产亚洲av涩爱| 免费av不卡在线播放| 亚洲电影在线观看av| 久久人妻熟女aⅴ| 免费人妻精品一区二区三区视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 99九九线精品视频在线观看视频| av国产精品久久久久影院| 国产在视频线精品| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲成人手机| 国产精品久久久久成人av| 热99国产精品久久久久久7| 在线免费观看不下载黄p国产| 性色av一级| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 欧美97在线视频| 久久精品国产亚洲av天美| 极品教师在线视频| 久久人人爽人人片av| 国产精品一二三区在线看| 欧美3d第一页| 久热久热在线精品观看| 少妇 在线观看| 久久99热6这里只有精品| 亚洲人成网站高清观看| 免费黄网站久久成人精品| 91精品国产九色| 一级毛片电影观看| 各种免费的搞黄视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 免费观看a级毛片全部| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲性久久影院| 亚洲精品一二三| 成人午夜精彩视频在线观看| av在线app专区| 99热这里只有是精品在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 在线 av 中文字幕| 一本一本综合久久| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 又爽又黄a免费视频| 免费观看的影片在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 丰满乱子伦码专区| 欧美国产精品一级二级三级 | 久久精品国产亚洲av涩爱| 成人毛片60女人毛片免费| 街头女战士在线观看网站| 婷婷色综合大香蕉| 免费av中文字幕在线| 能在线免费看毛片的网站| 久久精品久久久久久久性| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 日韩视频在线欧美| 十八禁网站网址无遮挡 | 国产精品一及| 一级a做视频免费观看| 午夜福利视频精品| 国产成人aa在线观看| 亚洲精品第二区| 国产爽快片一区二区三区| 久久婷婷青草| 国产精品.久久久| 亚洲欧美精品专区久久| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久久亚洲精品成人影院| 身体一侧抽搐| 免费av中文字幕在线| 一级av片app| 国产永久视频网站| 国产av国产精品国产| tube8黄色片| av在线观看视频网站免费| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久精品国产a三级三级三级| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久久久久久国产电影| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 黄色欧美视频在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片 | 久久久久久久久久成人| 国产一区二区三区av在线| 好男人视频免费观看在线| 青春草视频在线免费观看| 国产黄色免费在线视频| 久久 成人 亚洲| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产一区二区三区av在线| 日本一二三区视频观看| 午夜视频国产福利| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产高清三级在线| 91aial.com中文字幕在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久久a久久爽久久v久久| 成人亚洲精品一区在线观看 | 青春草亚洲视频在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 只有这里有精品99| 成人特级av手机在线观看| 99久久人妻综合| av网站免费在线观看视频| 国产免费视频播放在线视频| 午夜免费观看性视频| 在线观看一区二区三区| 男人和女人高潮做爰伦理| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久久久久久久久久丰满| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 日韩人妻高清精品专区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 成人毛片60女人毛片免费| 在线看a的网站| 国产精品欧美亚洲77777| 特大巨黑吊av在线直播| 午夜福利高清视频| 大片免费播放器 马上看| 少妇熟女欧美另类| av专区在线播放| 亚洲国产av新网站| 久久精品夜色国产| 人体艺术视频欧美日本| 青春草亚洲视频在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看 | 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 91aial.com中文字幕在线观看| av不卡在线播放| 看十八女毛片水多多多| 多毛熟女@视频| 高清在线视频一区二区三区| 久久99蜜桃精品久久| av女优亚洲男人天堂| 三级经典国产精品| 偷拍熟女少妇极品色| 日本欧美视频一区| 日韩精品有码人妻一区| 国产中年淑女户外野战色| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 男男h啪啪无遮挡| 一个人看视频在线观看www免费| 2018国产大陆天天弄谢| 老熟女久久久| 欧美日韩在线观看h| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲综合色惰| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品国产三级专区第一集| 国产精品久久久久成人av| 亚洲中文av在线| 超碰av人人做人人爽久久| 免费少妇av软件| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久色成人| 国产熟女欧美一区二区| 国产高清有码在线观看视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 99久久人妻综合| 亚洲欧美日韩无卡精品| 水蜜桃什么品种好| 插逼视频在线观看| 午夜福利视频精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产亚洲最大av| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲成人一二三区av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久久久久精品性色| 国产免费福利视频在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国产亚洲最大av| 久久婷婷青草| 七月丁香在线播放| 国产91av在线免费观看| 国产精品国产三级专区第一集| 男人爽女人下面视频在线观看| 色网站视频免费| 91精品国产国语对白视频| 亚洲无线观看免费| 国产男女内射视频| 国产成人a区在线观看| 又大又黄又爽视频免费| 欧美3d第一页| 国产精品成人在线| 欧美3d第一页| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 精品午夜福利在线看| 免费黄网站久久成人精品| 日韩中字成人| 熟女电影av网| 久久 成人 亚洲| 18+在线观看网站| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲不卡免费看| 国产 一区精品| 婷婷色av中文字幕| 在线观看免费日韩欧美大片 | 国产成人精品福利久久| 国产综合精华液| 欧美日本视频| 国国产精品蜜臀av免费| 成人美女网站在线观看视频| 97超视频在线观看视频| 一级爰片在线观看| 男女边摸边吃奶| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美三级亚洲精品| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲最大成人中文| 免费观看性生交大片5| 内射极品少妇av片p| 观看美女的网站| 亚洲欧美日韩东京热| 久久97久久精品| 黄色日韩在线| 午夜福利影视在线免费观看| 全区人妻精品视频| 日本一二三区视频观看| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产av码专区亚洲av| 午夜老司机福利剧场| av.在线天堂| 一本一本综合久久| 男的添女的下面高潮视频| 熟女人妻精品中文字幕| 成人毛片a级毛片在线播放| 黄色视频在线播放观看不卡| 日韩欧美 国产精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 2022亚洲国产成人精品| 三级国产精品片| 国产精品成人在线| 欧美 日韩 精品 国产| 日韩伦理黄色片| 亚洲精品一区蜜桃| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产高清三级在线| 夫妻午夜视频| 国产精品人妻久久久久久| 我要看日韩黄色一级片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久影院123|