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    CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及應(yīng)用研究概述

    2021-03-31 05:31:58馮江浩魏思昂閆麗歡
    關(guān)鍵詞:外源小鼠活性

    馮江浩,魏思昂,閆麗歡,崔 潔,馮 焱*

    (1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院,山西太谷 030801;2.山西省太原市食品藥品檢驗(yàn)所,山西太原 030000)

    基因編輯技術(shù)是分子生物學(xué)研究中的重要手段,通過對目的片段序列的改變,從而影響基因的功能。它的出現(xiàn)推進(jìn)分子生物學(xué)的進(jìn)程,提高了對于基因結(jié)構(gòu)功能的研究效率。目前基因編輯的主要手段有3種,包括鋅指核酸酶 (zinc finger endonuclease,ZFN)技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技術(shù)和CRISPR/Cas9技術(shù)[1]。其中ZFN由于構(gòu)建繁瑣,逐漸被TALEN和CRISPR/Cas9所取代。CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌中對于外源DNA的一種防御機(jī)制,主要功能是對外源侵入的噬菌體以及外源質(zhì)粒進(jìn)行切割,破壞DNA結(jié)構(gòu),使其失去活性,無法轉(zhuǎn)錄以及翻譯蛋白對自身產(chǎn)生影響。CRISPR/Cas系統(tǒng)最早于1987年被發(fā)現(xiàn)有規(guī)律的重復(fù)序列,這些重復(fù)序列與噬菌體內(nèi)序列高度同源。Ⅱ型Cas9有核酸內(nèi)切酶活性[2]。在小鼠上實(shí)現(xiàn)基因編輯操作,將CRISPR/Cas9應(yīng)用于實(shí)際操作[3]。與TALEN相比,CRISPR/Cas9具有更加簡單的構(gòu)建過程和高效的剪切效率,但脫靶效應(yīng)也是限制其發(fā)展的核心問題之一。近年來CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)廣泛用于構(gòu)建動(dòng)物模型以及細(xì)胞層面的研究。

    1 CRISPR/Cas系統(tǒng)組成

    1.1 CRISPR/Cas結(jié)構(gòu)與分類

    CRISPR/Cas系統(tǒng)依Cas蛋白的不同可分為2個(gè)大類,5個(gè)亞型[4]。其中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ為第1類,Ⅱ、Ⅴ為第2類[10]。CRISPR/Cas系統(tǒng)分為CRISPR序列和Cas蛋白,CRISPR序列是一段DNA序列,由多個(gè)重復(fù)的單元構(gòu)成,每個(gè)單元由一段長度為24 bp~48 bp的高度保守的重復(fù)序列和26 bp~72 bp的間隔序列組成,稱為簇狀短回文間隔重復(fù)序列[5]。間隔序列是與外源DNA同源的序列,通過轉(zhuǎn)錄CRISPR-derived RNA(crRNA)指導(dǎo)Cas蛋白對目的序列的匹配。另一個(gè)部分是Cas蛋白家族和crRNA與Trans-activting crRNA(trRNA)形成的復(fù)合體,Cas蛋白家族的基因序列位于CRISPR序列上游與之相鄰,每一個(gè)類型的CRISPR/Cas系統(tǒng)所含的蛋白不同,功能亦不同。

    1.2 CRISPR/Cas功能

    CRISPR/Cas系統(tǒng)中CRISPR序列的功能是整合與指導(dǎo)作用,通過轉(zhuǎn)錄出crRNA指導(dǎo)Cas蛋白對目的序列進(jìn)行精準(zhǔn)切割。是一段與外源DNA同源的DNA序列,由Cas1、Cas2和Cas4將外源序列剪切后添加到CRISPR序列中。Cas蛋白是CRISPR/Cas系統(tǒng)中的功能運(yùn)行單位,不同Cas蛋白配合將外源DNA序列進(jìn)行處理,整合獲取外源序列信息,之后由具有DNA內(nèi)切酶活性的Cas蛋白對目的序列進(jìn)行切割,破壞外源DNA結(jié)構(gòu)達(dá)到防御目的,這一過程中需要CRISPR序列轉(zhuǎn)錄的crRNA指導(dǎo)及trRNA的激活,形成有活性RNA-Cas蛋白復(fù)合體。

    2 CRISPR/Cas系統(tǒng)運(yùn)行機(jī)制

    CRISPR/Cas系統(tǒng)由于組成不同可分為外源DNA侵入與處理、前體crRNA轉(zhuǎn)錄加工和Cas蛋白識(shí)別切割三個(gè)階段。以Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)為例。首先是外源DNA侵入到細(xì)胞內(nèi)部并在細(xì)胞內(nèi)部展開,暴露出其DNA序列,之后4個(gè)Cas1與2個(gè)Cas2蛋白形成一個(gè)復(fù)合體,根據(jù)外源DNA的形狀不同附著其上進(jìn)行切割[6]。位置位于重復(fù)序列的5′端稱為原間隔序列的部位,形成一段短的DNA片段,此DNA片段會(huì)被插入到CRISPR序列的前端位于前導(dǎo)序列后的第1個(gè)重復(fù)序列上。第二步是CRISPR序列由RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,CRISPR序列轉(zhuǎn)錄出前體crRNA[3]。此crRNA無活性,包含CRISPR序列啟動(dòng)子后所有的重復(fù)序列與間隔序列單元。CRISPR序列中的重復(fù)序列會(huì)轉(zhuǎn)錄出于前體crRNA序列中互補(bǔ)的trRNA[7-8]。當(dāng)前體crRNA中的一個(gè)crRNA單元與互補(bǔ)的trRNA配對后同時(shí)與Cas9蛋白結(jié)合時(shí)由RNase Ⅲ對前體crRNA進(jìn)行切割形成具有活性的crRNA,一個(gè)完整的具有切割外源DNA活性crRNA-trRNA-Cas9復(fù)合體形成。第3步是Cas9蛋白復(fù)合體對外源DNA進(jìn)行切割,降解外源DNA,此過程是Cas9蛋白復(fù)合體對目的序列的識(shí)別。是由Cas9蛋白先對目標(biāo)DNA上的PAM序列進(jìn)行識(shí)別出匹配的protospacer adjacent motif(PAM)序列后由Cas9蛋白復(fù)合體內(nèi)的crRNA序列與PAM序列后長度約為23 bp的DNA序列的互補(bǔ)鏈進(jìn)行匹配。成功后Cas9蛋白的酶切活性區(qū)域在PAM序列的5′ 端進(jìn)行切割,形成DNA雙鏈斷裂破壞DNA結(jié)構(gòu)完整性使外源DNA失活,完成一個(gè)完整的防御外源DNA過程。

    3 CRISPR/Cas9缺陷及優(yōu)化

    天然的CRISPR/Cas系統(tǒng)十分復(fù)雜且過于龐大,第1類中的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型CRISPR/Cas系統(tǒng)由于其中的Cas蛋白種類多,且識(shí)別與切割目的序列的部位于同一個(gè)Cas蛋白上,在應(yīng)用中不易操作,所以不常用于基因編輯處理,第2類中的Ⅱ、Ⅴ型CRISPR/Cas系統(tǒng)中的Cas蛋白種類少,且識(shí)別與切割目的DNA序列的結(jié)構(gòu)都位于同一個(gè)Cas蛋白上,是實(shí)際應(yīng)用中的理想材料。

    在基因編輯操作中只需要CRISPR/Cas系統(tǒng)中對于目的序列的識(shí)別與切割的能力,因此CRISPR序列就成為可去除的非必要部分,只保留能夠正常轉(zhuǎn)錄翻譯Cas9蛋白的DNA序列。在基因編輯操作中通常只有1到2個(gè)目標(biāo)位點(diǎn),不需要CRISPR序列中完整龐大的多余序列,所以CRISPR序列可被人為轉(zhuǎn)錄的crRNA所代替,省略前體crRNA的處理步驟。此外,同過將trRNA與crRNA連接在同一條RNA鏈上形成單一的引導(dǎo)RNA (gRNA) 可進(jìn)一步簡化Cas9在實(shí)際應(yīng)用上的操作。常用的Cas9主要有從鏈膿桿菌 (Streptococcuspyogenes,spCas9)中獲得的spCas9和從金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus,saCas9) 中獲得的saCas9[8-9]。spCas9被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的基因編輯操作,而saCas9因其序列較短更加適合由噬菌體攜帶,因此更適用于基因治療的研究。不同Cas9蛋白識(shí)別的PAM序列不同,根據(jù)使用要求,采用噬菌體共進(jìn)化的方法,產(chǎn)生多種spCas9的亞種可識(shí)別多種長度,序列不同的PAM序列[10]。進(jìn)一步擴(kuò)大Cas9可識(shí)別的DNA序列范圍,達(dá)到更加靈活的應(yīng)用。

    dCas9是一種沒有DNA內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白變體。其可以同gRNA與DNA的匹配結(jié)合到目的序列上,但不能夠?qū)NA雙鏈進(jìn)行切割,形成DNA雙鏈斷裂,可以額外連接上切割DNA雙鏈中一條鏈的酶,設(shè)計(jì)兩個(gè)切割位點(diǎn),從而提高編輯精確程度。在動(dòng)物試驗(yàn)中,為了獲得正確的試驗(yàn)體,對于切割靶點(diǎn)的選擇以及gRNA序列的設(shè)計(jì),選擇合適的靶點(diǎn)以及gRNA設(shè)計(jì)是對于降低脫靶效率的關(guān)鍵步驟。對Cas9蛋白的不斷突變產(chǎn)生多種識(shí)別不同PAM序列的變體,一方面擴(kuò)展Cas9可識(shí)別的序列種類,也降低脫靶的可能性[11]。從Cas9蛋白入手將限制性內(nèi)切酶的Fok I區(qū)連接到無催化活性的Cas9 (dead Cas9,dCas9) 上,當(dāng)兩個(gè)dCas9形成二聚體才能切割形成DSBs,設(shè)計(jì)兩個(gè)gRNA靶點(diǎn)來切割一個(gè)位點(diǎn),來降低脫靶效率[12]。用GAL4/UAS二元系統(tǒng)對CRISPR/Cas9進(jìn)行改造,使其可以在果蠅中組織特異性表達(dá),增加CRISPR/Cas9的精準(zhǔn)性,降低脫靶可能帶來的危害。對于實(shí)驗(yàn)體的脫靶檢測也是于設(shè)計(jì)相對應(yīng)的步驟,選擇合適的檢測手段,降低假陽性與假陰性的出現(xiàn),提高檢測精準(zhǔn)度[13]。

    4 CRISPR/Cas9應(yīng)用

    4.1 研究領(lǐng)域應(yīng)用

    4.1.1 基因敲入與敲除 CRISPR/Cas9系統(tǒng)最常用于基因敲除與敲入,對于某些基因位點(diǎn)的敲除效率能達(dá)到95%以上[14]。用Cas9蛋白作為DNA內(nèi)切酶靶向切割DNA序列,產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂,經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)的同源重組(HDR)或非同源末端重組(NHEJ)將DSBs修復(fù)。HDR修復(fù)常用于Cas9基因編輯操作,可以根據(jù)人為提供的具有同源臂的模板進(jìn)行DBSs的修復(fù),達(dá)到基因敲入的操作。設(shè)計(jì)兩條gRNA對目的序列上、下游進(jìn)行匹配達(dá)到基因定點(diǎn)敲除的操作。將Cas9基因連接上具有組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子并整合到基因組中,可實(shí)現(xiàn)Cas9組織特異性的表達(dá),達(dá)到具有組織特異性的切除目的DNA的能力[13]。對于某些致死基因的敲除可使用cre-LoxP系統(tǒng)制備條件性敲除的動(dòng)物模型使目的基因在動(dòng)物體內(nèi)有條件性地敲除保證個(gè)體存活[14-15]。條件性敲除需要的制備兩個(gè)LoxP插入位點(diǎn)的donor,在小鼠試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雙donor效率要低于整合的單donor效率[16]。在基因序列中插入LoxP序列難度較大需要多次斷裂重組,在斑馬魚中實(shí)現(xiàn)了不需要HR的一步插入LoxP序列的方式。在敲入操作中同樣由于會(huì)有目的基因序列的插入需要制備donor,因此對于細(xì)胞的修復(fù)方式就更傾向于準(zhǔn)確性更高的HR修復(fù)[17]。在兔模型中敲入操作中HR修復(fù)促進(jìn)劑RS-1對提高插入成功率有顯著效果,而NHEJ抑制劑SCRP-7對于敲入成功率無顯著影響[18]。隨著更多的Cas蛋白的開發(fā),CRISPR/Cas9系統(tǒng)有了更多的功能,最常用的仍是其基本的敲入與敲除功能。

    4.1.2 DNA單堿基突變 大多數(shù)基因編輯操作都是基于對DNA雙鏈切割形成DSBs后通過細(xì)胞內(nèi)修復(fù)方式進(jìn)行,這種方法可插入或去除較長的基因序列,對于單個(gè)核苷酸的突變需求操作過于繁瑣。Cas9的突變體dCas9由于人為突變失去了對DNA雙鏈切割形成DSBs的酶活性,將dCas9與胞苷脫氨酶混合后可將胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏亩纬蒀-T,G-A的突變達(dá)到點(diǎn)突變的效果,此方法不需要形成DNA雙鏈斷裂,降低錯(cuò)配可能性,提高編輯效率。此外dCas13可對RNA進(jìn)行點(diǎn)突變,在不改變DNA序列的情況下對轉(zhuǎn)錄后修飾有很大的應(yīng)用空間。

    4.1.3 表觀遺傳調(diào)控 表觀遺傳調(diào)控是不改變DNA序列而對性狀進(jìn)行調(diào)控,用dCas9突變失去切割DNA雙鏈的能力,保留對于目標(biāo)序列的識(shí)別能力,設(shè)計(jì)一段與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子等相關(guān)原件匹配的gRNA序列使dCas9能夠識(shí)別并結(jié)合在目標(biāo)位點(diǎn)上,同時(shí)可在dCas9上連接相應(yīng)的激活或抑制蛋白,達(dá)到激活或抑制目標(biāo)DNA的轉(zhuǎn)錄,以此來調(diào)控生物個(gè)體的性狀。

    4.2 動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用

    4.2.1 疾病模型構(gòu)建 用CRISPR/Cas9進(jìn)行動(dòng)物疾病模型的構(gòu)建是基于其對基因的插入以及缺失的功能,構(gòu)建各種基因缺陷型的疾病模型來模擬各種情況。心腦血管疾病、糖尿病、肥胖等都可以用CRISPR/Cas9 進(jìn)行模型的構(gòu)建。CRISPR/Cas9能夠構(gòu)建的動(dòng)物疾病模型類型多范圍廣,不論是小動(dòng)物模型諸如小鼠、大鼠、斑馬魚等或是大動(dòng)物模型如兔、豬等都可使用。從2013年成功用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對小鼠受精卵進(jìn)行編輯后,許多不同疾病模型相繼構(gòu)建成功[19-22]。近年來用CRISPR/Cas9 進(jìn)行模型構(gòu)建的技術(shù)趨于成熟,對疾病的發(fā)病機(jī)制有很大幫助。有研究成功構(gòu)建出肺鱗狀細(xì)胞癌的小鼠模型,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了免疫療法的試驗(yàn)[23]。通過CRISPR/Cas9 在Notch3的第33個(gè)外顯子上插入了終止序列阻止其完整翻譯蛋白,致小鼠表現(xiàn)出腦膜側(cè)綜合癥的癥狀,并在大動(dòng)物模型構(gòu)建方面成功構(gòu)建出豬的亨廷頓氏舞蹈癥模型,闡述了亨廷頓氏舞蹈癥模型中的神經(jīng)退行性變化[24]。

    4.2.2 基因治療 基因治療的一個(gè)策略是使用腺病毒作為載體搭載Cas9系統(tǒng)的DNA,較為合適的是SaCas9蛋白。SaCas9蛋白的基因組序列很短約為3 300 bp,適合由經(jīng)過改造的腺病毒攜帶,注入到細(xì)胞內(nèi)部[25]。研究表明,用腺病毒攜帶saCas9蛋白基因,將其運(yùn)送到被人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的T細(xì)胞內(nèi),對新產(chǎn)生的HIV進(jìn)行切割,阻止其繼續(xù)擴(kuò)散至其他細(xì)胞,有效降低HIV的擴(kuò)散,達(dá)到對HIV的抑制[26]。在人類胚胎中用CRISPR/Cas9修正了MYCBPC3基因的致病性突變解決了胚胎的遺傳性肥厚型心肌病[27]。通過對遺傳性酪氨酸血癥小鼠用注射的方式成功使小鼠的部分肝細(xì)胞表達(dá)Fah蛋白緩解了體重降低的現(xiàn)象[28]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在腫瘤的免疫療法中的可行性已得到初步驗(yàn)證,在非小細(xì)胞肺癌的免疫治療中,將患者自身的T細(xì)胞取出并用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除PD-1基因后進(jìn)行擴(kuò)增,再注入患者體內(nèi)以達(dá)到抗腫瘤的目的[29]。

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