毛滴蟲病診斷技術(shù)研究進展

朱易斌,蔡海明,魏光偉,廖申權(quán),戚南山,李 娟,呂敏娜,林栩慧,胡俊菁,張健騑,陳進軍,孫銘飛*

(1.廣東海洋大學(xué),廣東湛江 524088;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽流感等家禽重大疾病防控 重點實驗室,廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室,廣東廣州 510640)

毛滴蟲為寄生于人和脊椎動物消化道或泌尿生殖道等的一類原生動物,毛滴蟲科的各屬包括致病和共生兩大類,寄生于人的毛滴蟲包括陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis)、人五毛滴蟲(Pentatrichomonashominis)、口腔毛滴蟲(Trichomonastenax)和脆弱雙核阿米巴(Dientamoebafragilis),其中陰道毛滴蟲是寄生于人的毛滴蟲中致病性最強、危害性最大的一類毛滴蟲[1]。人感染毛滴蟲后會出現(xiàn)腹痛腹瀉、尿頻尿急、生殖功能障礙等癥狀。寄生于動物的毛滴蟲包括禽毛滴蟲(Trichomonasgallinae) 、胎兒三毛滴蟲(Tritrichomonasfoetus)、豬三毛滴蟲(Tritrichomonassuis)、巴特里四毛滴蟲(Tetratrichomonasbuttreyi)和人五毛滴蟲(P.hominis)等[2-3]。動物感染毛滴蟲后會出現(xiàn)腹瀉、生長發(fā)育遲緩、流產(chǎn)不孕等癥狀,給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展。其中人五毛滴蟲作為人獸共患毛滴蟲存在公共衛(wèi)生傳播風(fēng)險,因此對于毛滴蟲病的準(zhǔn)確診斷尤為重要,快速準(zhǔn)確地診斷對該病的早期防治也起到關(guān)鍵作用。目前對于毛滴蟲病的診斷方法有鏡檢法、培養(yǎng)法、染色法及分子生物學(xué)方法等,但各種方法存在較大差異。本文綜述不同毛滴蟲病診斷方法的原理、優(yōu)勢和不足,為該病的診斷提供參考。

1 臨床診斷

毛滴蟲感染后宿主常出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀(表1),根據(jù)不同臨床癥狀和病理變化可初步做出診斷,鴿感染毛滴蟲后出現(xiàn)羽毛松亂、精神沉郁、食欲減退、呼吸困難、腹瀉等癥狀,剖檢發(fā)現(xiàn)口腔、咽部、食道上段及嗉囊黏膜表面局灶性或彌漫性潰瘍,小腸腫大,腸黏膜充血出血[4]。臨床上鴿毛滴蟲病容易與鴿痘、鴿念珠菌病、鴿維生素缺乏癥等混淆,因此想要做到準(zhǔn)確診斷鴿毛滴蟲病必須結(jié)合實驗室診斷。暹羅貓被毛粗亂、腹瀉、糞便中偶見血液,超聲檢查其大腸皺褶局部淋巴結(jié)腫大[5],在結(jié)腸病灶部位分離到胎兒三毛滴蟲,實驗室確診為胎兒三毛滴蟲感染。一名68歲的法國高加索人患有發(fā)熱、黏液性腹瀉、關(guān)節(jié)疼痛等臨床癥狀,后經(jīng)實驗室檢查確診為人五毛滴蟲陽性感染[6]。因此臨床診斷與實驗室診斷相結(jié)合能夠更準(zhǔn)確地診斷毛滴蟲病。

表1 部分毛滴蟲感染的主要臨床癥狀及病理變化

2 實驗室診斷

2.1 壓滴標(biāo)本鏡檢法

壓滴標(biāo)本鏡檢法主要是將采集的糞便、腸內(nèi)容物或鼻咽、陰道分泌物等檢測樣品均勻涂抹在載玻片上,然后滴加1～2滴生理鹽水,加蓋玻片后在不同倍數(shù)的物鏡下觀察。在100×鏡下可觀察到梨形或者卵圓形快速游動的蟲體,而在400×鏡下可觀察到毛滴蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)。但是由于不同種的毛滴蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)相似,單一利用鏡檢法并不能區(qū)分毛滴蟲的種類,無法做到精確地鑒別毛滴蟲,且在宿主早期感染時蟲體數(shù)量較少容易存在漏檢現(xiàn)象。因此,需要其他檢測方法進一步鑒定。

2.2 體外培養(yǎng)法

通過對毛滴蟲進行體外培養(yǎng)后使蟲體數(shù)量增加從而準(zhǔn)確地檢測毛滴蟲,該方法可在感染早期蟲體數(shù)量較少時提高檢測的準(zhǔn)確率。用肝浸湯培養(yǎng)結(jié)合顯微鏡檢法對廣東省各地共296份鴿口腔黏液樣品進行毛滴蟲感染調(diào)查,鴿毛滴蟲平均感染率為38.9%[7],其中乳鴿感染率最高為51.3%,青年鴿為48.7%,而種鴿感染率為18.1%,證明該方法比傳統(tǒng)的鏡檢法檢測準(zhǔn)確率高且成本低。已報道的適合毛滴蟲培養(yǎng)的培養(yǎng)基有很多,如肝浸湯培養(yǎng)基、克勞森培養(yǎng)基、Diamond培養(yǎng)基、蛋黃浸液、TY1-S-33培養(yǎng)基、雞蛋白檸檬酸鈉培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基等[8]。不同的培養(yǎng)基對毛滴蟲的培養(yǎng)存在一定的差異,因此可以利用體外培養(yǎng)來區(qū)分不同的毛滴蟲。用DMEM培養(yǎng)基和肝浸湯培養(yǎng)基分別培養(yǎng)陰道毛滴蟲,存活時間遠(yuǎn)高于肝浸湯培養(yǎng)基,但增殖率低于肝浸湯培養(yǎng)基[9]。毛滴蟲比較脆弱,生長條件苛刻,且蟲體死亡后迅速降解,因此選擇合適的培養(yǎng)是診斷毛滴蟲病的關(guān)鍵。體外培養(yǎng)法的準(zhǔn)確率高于鏡檢法且成本較低,該方法也為后續(xù)毛滴蟲的研究提供了寶貴的蟲種資源。但是因為體外培養(yǎng)周期較長,不能達到快速診斷的目的,因此體外培養(yǎng)法也存在一定的局限性。

2.3 染色鏡檢法

染色鏡檢法可用不同染液對毛滴蟲進行染色進而更清晰地觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu),達到準(zhǔn)確診斷的目的。目前可用于毛滴蟲的染色方法有很多(表2)。不同染色方法對毛滴蟲的染色效果不一樣,所以選擇正確合適的染色方法更有利于觀察毛滴蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)。但因部分毛滴蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)差異不大,染色鏡檢法也很難達到種屬鑒定,因此該方法主要作為不同毛滴蟲病診斷的輔助手段,想要做到更精確的診斷毛滴蟲病還需要進一步借助分子生物學(xué)方法。

表2 不同毛滴蟲染色方法比較

2.4 分子生物學(xué)方法

2.4.1 普通PCR檢測法 PCR技術(shù)具有特異性強和靈敏度高的優(yōu)點,該方法也常用于毛滴蟲病的診斷(表3)。PCR檢測方法主要通過擴增毛滴蟲的特異性或具有遺傳分型特性的核酸序列(18S rRNA基因、5.8S rRNA基因和EF-1α基因等[13])后進行遺傳分析進而達到種水平鑒定。PCR檢測技術(shù)的高靈敏性,使毛滴蟲感染早期便能準(zhǔn)確檢測。根據(jù)毛滴蟲TV-E650-1基因設(shè)計了1對引物,并建立了一種檢測陰道毛滴蟲的方法,PCR擴增出438 bp的目的片段,對模板稀釋1 000倍后仍能明顯擴增,表明此方法特異性強,靈敏度高,可作為體外診斷陰道毛滴蟲病及進行流行病學(xué)調(diào)查的候選方法[14]。套式PCR(nested-PCR)是一種特殊的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),其原理是利用2對引物進行目的片段擴增,第2對套式引物結(jié)合在第1次PCR產(chǎn)物內(nèi)部,降低PCR反應(yīng)過程中的錯誤擴增,因此其具有比普通PCR更特異的優(yōu)點?；谌宋迕蜗xEF-1α和18S rRNA基因分別建立兩種套式PCR方法,對139份鹿糞便樣品進行檢測,結(jié)果顯示其適合臨床上人五毛滴蟲感染檢測,而基于18S rRNA基因的套式PCR方法則更適合用人五毛滴蟲基因亞型的鑒定[15]。但是套氏PCR需進行兩輪擴增,過程比普通PCR繁瑣,但其靈敏性高于普通PCR,因此兩種方法都是近年診斷毛滴蟲病的主要方法。

表3 毛滴蟲PCR檢測及陽性率統(tǒng)計

2.4.2 實時熒光定量PCR檢測法 實時熒光定量PCR(qPCR)是在DNA擴增反應(yīng)過程中,用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。該方法與傳統(tǒng)PCR方法相比具有更加靈敏、快速等優(yōu)點,已作為獸醫(yī)寄生蟲學(xué)中一種診斷、定量分析和標(biāo)準(zhǔn)化基因表達的有效工具[16]?；赟YBR green染料建立一種通過擴增18S rRNA基因的113 bp區(qū)域來檢測禽毛滴蟲的實時熒光PCR方法,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析其擴增效率,該方法可用于臨床上禽毛滴蟲感染的檢測[17]。實時熒光定量PCR檢測方法具有更加靈敏特異的優(yōu)點,但其作為一種診斷方法所需儀器設(shè)備和試劑要比普通PCR更加昂貴,因此該方法也很少用于毛滴蟲病的診斷。

2.4.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測法 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isot hermal amplification,LAMP)是一種新的核酸擴增基因的檢測方法,該方法也被用于多種毛滴蟲病的診斷,用檢測陰道毛滴蟲的LAMP方法對121名女性進行陰道毛滴蟲流行病學(xué)調(diào)查,檢出率(42.06%)高于培養(yǎng)法(8.26%)和PCR方法(7.44%)[30]。對比PCR方法和LAMP方法,兩種方法都可用于陰道毛滴蟲病的診斷,且特異性都很高。但LAMP方法的靈敏度優(yōu)于PCR方法[31]。根據(jù)口腔毛滴蟲的ITS和5.8S rRNA基因設(shè)計特異性引物,建立一種用于檢測口腔毛滴蟲的LAMP方法,該方法特異性和靈敏度均高于普通PCR方法[32]。LAMP方法也被用于檢測胎兒三毛滴蟲。LAMP方法與常規(guī)PCR相比減少了模板熱變性、溫度循環(huán)以及電泳過程,且檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR,具有簡單、快速、特異性強、靈敏度高等特點。

2.4.4 原位雜交檢測法 用核酸堿基對的互補配對原則將標(biāo)記好的外源性核酸與細(xì)胞、組織的待測目的序列進行堿基配對互補,結(jié)合成帶有標(biāo)記的目的基因的雜交核酸分子,再利用特定的方法進行檢測。顯色原位雜交方法可直接從寄生組織中檢測到毛滴蟲,并對其寡核苷酸探針進行設(shè)計和評估,理論上可以檢測到滴蟲目的所有已知成員。有研究設(shè)計3種探針,用顯色原位雜交技術(shù)對102只貓的腸組織切片進行毛滴蟲檢測,結(jié)果在102只貓中檢測到3只貓的胎兒三毛滴蟲呈陽性,1只貓的人五毛滴蟲呈陽性,在對陽性貓的腸組織剖檢時發(fā)現(xiàn)腸腔內(nèi)有大量毛滴蟲,并侵入腸黏膜。但是原位雜交檢測法操作較為繁瑣且靈敏度低于PCR檢測法,不經(jīng)常用于臨床上毛滴蟲病的診斷。

2.5 其他檢測方法

對于毛滴蟲病的診斷方法還有血清學(xué)方法。商品化的ELISA檢測試劑盒通常采用直接免疫測定的方法,通過過氧化氫酶標(biāo)記的單克隆抗體與多種陰道毛滴蟲的蛋白進行抗原抗體反應(yīng),其檢出率與培養(yǎng)法相同。建立一種鴿毛滴蟲感染Dot-ELISA檢測方法,對70個臨床樣品進行檢測,結(jié)果48個鏡檢陽性的樣品用Dot-ELISA檢測有44個呈陽性,陽性符合率91.7%,22個鏡檢陰性的樣品檢測出12個呈陰性,陰性符合率54.5%,Dot-ELISA檢測與鏡檢結(jié)果的總符合率為80%。用牛源T.foetus的TF1.17抗原的1.15和1.17表位產(chǎn)生的單克隆抗體,評估TF1.17在貓源T.foetus的存在和作用,用免疫印記、免疫熒光分析和流式細(xì)胞術(shù)分析證實貓源T.foetus中TF1.17抗原的存在,表明TF1.17抗原也可能作為診斷和預(yù)防貓源T.foetus感染的靶點。美國唯一獲得FDA批準(zhǔn)的用于檢測陰道毛滴蟲的方法OSOM滴蟲免疫檢測法,該方法可在10 min內(nèi)達到有效診斷,使其成為比鏡檢法,培養(yǎng)法和ELISA法更靈敏和快速,但其特異性低于PCR檢測法。

3 展望

毛滴蟲的感染范圍廣,人源毛滴蟲對人類健康造成極大的威脅,動物源的毛滴蟲對我國的養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失,嚴(yán)重阻礙我國畜牧業(yè)的發(fā)展。人獸共患毛滴蟲形成了一條人畜傳播鏈,造成一定的公共衛(wèi)生傳播風(fēng)險。因此快速準(zhǔn)確地診斷毛滴蟲病就顯得尤為重要,而單一的濕片鏡檢已經(jīng)不能滿足毛滴蟲病的準(zhǔn)確診斷,體外培養(yǎng)法和濕片鏡檢法相結(jié)合能夠提高檢測的準(zhǔn)確率,也為毛滴蟲后續(xù)研究提供了寶貴的蟲種資源,但其培養(yǎng)周期較長不能快速做出診斷,PCR方法靈敏性高、特異性強的優(yōu)點使其成為診斷毛滴蟲病的首選方法,該方法可以快速準(zhǔn)確地診斷毛滴蟲病,為毛滴蟲病的早期防治起到了關(guān)鍵作用,也為毛滴蟲的后續(xù)研究提供了技術(shù)支持,是普遍選擇的檢測毛滴蟲的方法。目前對于毛滴蟲病的診斷方法已經(jīng)有了很大的發(fā)展,但部分診斷方法仍存在不足,未來有望開發(fā)出更加快速準(zhǔn)確地診斷毛滴蟲病的新方法。