山羊支原體山羊肺炎亞種重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的建立

豆 玲,周 峰,張 莉,王志宇,康文彪*

(1.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,甘肅蘭州 730046;2.英科新創(chuàng)(蘇州)生物科技有限公司,江蘇蘇州 215000)

山羊傳染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)[1-3]的病原體為山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp)[4-6],其區(qū)別于綿羊支原體(Mycoplasmaovipneumoniae,Mo)與絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.capri,Mmc)[2-3]。Mccp只感染山羊[1,7],感染羊主要臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽和呼吸困難,剖檢變化以纖維素性肺炎和胸膜炎為特征[8]。山羊傳染性胸膜肺炎是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)規(guī)定需要報(bào)告的疫病[1,4,9-10]。該病在我國(guó)流行比較嚴(yán)重,給山羊養(yǎng)殖業(yè)造成較大損失[11]。因此,建立一種檢測(cè)時(shí)間較短、操作簡(jiǎn)便快捷、結(jié)果準(zhǔn)確可靠且適合臨床應(yīng)用的檢測(cè)方法對(duì)山羊傳染性胸膜肺炎防控具有重要意義。重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)是2006年英國(guó)公司Twist DxInc研發(fā)的一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[12],其運(yùn)用生物酶的作用,模擬體內(nèi)DNA復(fù)制,在25～42℃恒溫下30 min左右即可完成對(duì)目的片段的擴(kuò)增,操作簡(jiǎn)單[12-14]。目前RPA技術(shù)已被用于如絲狀支原體山羊亞種[15]、動(dòng)物衣原體[16]、非洲豬瘟病毒[17]等的檢測(cè),但未見報(bào)道用于Mccp的檢測(cè)。2007年我國(guó)首次分離出山羊支原體山羊肺炎亞種[18]。有研究選擇Mccp的arcA基因作為靶基因[19],經(jīng)基因序列分析發(fā)現(xiàn)Mo不含arcA基因,與Mmc種間有較大的差異,且種間特異性高,所以本研究選擇arcA假基因序列作為Mccp的檢測(cè)靶基因,建立一種適用于檢測(cè)山羊支原體山羊肺炎亞種的RPA方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 模擬樣本和臨床樣本 Mccp-arcA假基因片段克隆至重組大腸埃希氏菌pUC57載體后制作成重組質(zhì)粒,作為模擬樣本。8份臨床樣品采自甘肅省慶城縣和景泰縣,臨床上疑似山羊傳染性胸膜肺炎,發(fā)病羊臨床癥狀表現(xiàn)為流鼻涕、呼吸困難。2株羊傳染性胸膜肺炎疫苗,Mo、Mmc細(xì)胞培養(yǎng)物。

1.1.2 試劑和儀器 核酸提取試劑盒(磁珠法)、核酸檢測(cè)試紙條,英科新創(chuàng)(蘇州)生物科技有限公司產(chǎn)品;TwistAmp?Basic試劑盒、TwistAmp?nfo RPA恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒,英國(guó)Twist Dx公司產(chǎn)品;Auto-Pure 32A全自動(dòng)核酸提取儀,杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品;Qubit熒光定量?jī)x,Thermo Fisher公司產(chǎn)品;電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;生物安全柜,力康精密科技(上海)有限公司產(chǎn)品;超低溫冰柜,日本SANYO公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 靶基因選擇 經(jīng)文獻(xiàn)檢索與基因分析,選擇Mccp-arcA假基因作為靶基因。從NCBI上下載綿羊支原體(Mo)與山羊支原體山羊亞種(Mmc)基因組序列,用SnapGene軟件進(jìn)行種內(nèi)保守性比對(duì),用NCBI Blast進(jìn)行種間特異性比對(duì)。用于種間比較的Mccp登錄號(hào):AY529462.1、CP041701.1、CP041712.1、CP041711.1、CP041707.1、CP041706.1、LN515398.1、CP041710.1、CP041709.1、CP017125.1、LM995445.1、CP041703.1、CP041702.1、CP041705.1、CP041708.1、CP041700.1、CP040917.1、CP101367.1、CP041704.1、CP030266.1、CP031288.1、CP031287.1、CP019061.1、LN515399.1、CP006959.1、CP000123.1。用于種間比較的Mmc登錄號(hào):CP065581.1、CP065580.1、CP065579.1、CP068010.1、CP065576.1、CP065574.1、CP065577.1、CP065588.1、CP065575.1、CP065586.1、CP065583.1、CP065582.1。

1.2.2 篩選引物及探針

基于CIM/G的電網(wǎng)調(diào)度控制系統(tǒng)Web圖形展示技術(shù)//王民昆,韓曉,伍凌云,孫云楓,汪燕,翟明玉//(6):81

為了減少生活污水懸浮雜質(zhì)進(jìn)入處理系統(tǒng)，避免水泵及管線堵塞，同時(shí)使中水系統(tǒng)運(yùn)行處理流量平穩(wěn)，對(duì)沉淀池的出水口及厭氧池的轉(zhuǎn)水進(jìn)行了改造[4-5]。

張廣才嶺屬于長(zhǎng)白山支脈，位于中國(guó)東北地區(qū)東部山地北段的中軸部位（孫紅陽等，2015），近年來，該區(qū)域大面積成熟林被砍伐，隨后建立了落葉松（Larix gmelinii）人工林，同時(shí)部分裸地形成次生林。盡管如此，張廣才嶺地區(qū)仍然殘余部分成熟森林，此區(qū)域的成熟林至少達(dá) 400 a，自禁止商業(yè)性采伐政策執(zhí)行后，次生林和人工林林齡也約達(dá)50 a。目前，此區(qū)域由人工林、次生林和成熟林形成的森林景觀為研究不同森林類型中生物多樣性模式提供了理想的環(huán)境。

1.2.5 準(zhǔn)確性與特異性試驗(yàn) 用2株羊傳染性胸膜肺炎疫苗、陽性樣本、陰性樣本及Mo、Mmc細(xì)胞培養(yǎng)物標(biāo)準(zhǔn)株作為樣本,用建立的RPA方法進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證RPA方法的準(zhǔn)確性和特異性。

隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，我國(guó)比較穩(wěn)定系統(tǒng)的發(fā)展格局也逐漸形成，這樣不僅僅為我國(guó)企業(yè)發(fā)展帶來了較大的機(jī)遇，也帶來了較大的挑戰(zhàn)，這樣不僅提高了企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力，也促進(jìn)了企業(yè)進(jìn)一步發(fā)展創(chuàng)新。因此企業(yè)要不斷加強(qiáng)自身的發(fā)展。在一個(gè)企業(yè)中，財(cái)政部門管理是最重要的工作，這也是企業(yè)工作的核心，有利于避免財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)的產(chǎn)生。財(cái)政管理貫穿在企業(yè)發(fā)展的始終，其發(fā)現(xiàn)程度也決定了其他部門的順利發(fā)展。以下為企業(yè)發(fā)展過程中出現(xiàn)的相關(guān)問題和解決措施。

1.2.2.2 引物探針篩選 用TwistAmp?Basic 試劑盒進(jìn)行RPA擴(kuò)增,用英科新創(chuàng)核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行LFA技術(shù)(側(cè)向?qū)恿骷夹g(shù))檢測(cè),對(duì)3對(duì)引物探針進(jìn)行檢測(cè)效果篩選。將合成的含有arcA基因的質(zhì)粒作為模擬樣本,用TE(Tris-EDTA)分別稀釋至100 copies/μL、10 copies/μL作為陽性樣本,用TE作為陰性樣本。取1.5 mL離心管,分別加入上、下游引物各2.1 μL,探針0.6 μL,復(fù)溶緩沖液29.5 μL,ddH2O 12.2 μL,配制成復(fù)溶液。吸取復(fù)溶液45.5 μL,加入含有凍干組分的PCR反應(yīng)管中,混勻復(fù)溶。再在加入復(fù)溶后的PCR反應(yīng)管中加入2 μL模擬陽性及陰性樣本,隨后加入2.5 μL醋酸鎂溶液?；靹蚝蠓湃?7℃金屬浴中,反應(yīng)20 min。

2.1.1 種內(nèi)保守性 從NCBI上下載綿羊支原體(Mo)與山羊支原體山羊亞種(Mmc)基因組序列,發(fā)現(xiàn)Mo不含arcA假基因。

1.2.3.2 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化 用模擬樣本以及確定的引物探針組及擴(kuò)增檢測(cè)方法,測(cè)試37℃分別反應(yīng)10、15、20、25、30 min后的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,選擇最優(yōu)化的時(shí)間。

解讀材料，提煉出一個(gè)觀點(diǎn)，并結(jié)合中國(guó)古代史的其他相關(guān)史實(shí)，加以論述。（要求：寫出觀點(diǎn)，觀點(diǎn)合理、明確，史論結(jié)合。12分）

1.2.3.3 靈敏性試驗(yàn) 用Thermo Fisher公司Qubit熒光定量?jī)x測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)陽性羊傳染性胸膜肺炎DNA的濃度,通過質(zhì)粒分子質(zhì)量,換算得到為10 000 copies/μL,再將其分別進(jìn)行10倍稀釋至1 copies/μL,以10 000、1 000、100、10、1 copies/μL等5個(gè)濃度來檢驗(yàn)建立的RPA方法的敏感性。

1.2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化

1.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 將模擬樣本稀釋至10 copies/μL,重復(fù)檢測(cè)10次以確認(rèn)該方法重復(fù)性。

LFA檢測(cè):待反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物,放到1.5 mL離心管中,然后加入95 μL稀釋液(PBST),將核酸檢測(cè)試紙條插入1.5 mL離心管中,看到膠體金移動(dòng)時(shí)開始計(jì)時(shí),5 min后看試紙條上的結(jié)果。

1.2.2.1 引物探針設(shè)計(jì) 針對(duì)arcA假基因Mccp與Mmc差異區(qū)域,用Primer 3 plus軟件設(shè)計(jì)并調(diào)整引物、探針長(zhǎng)度,對(duì)上、下游引物Tm值評(píng)分、分析差異等參數(shù),使符合RPA引物探針設(shè)計(jì)最優(yōu)化的原則,設(shè)計(jì)合成了3對(duì)RPA引物見表1。

1.2.6 臨床樣品檢測(cè)

1.2.6.1 對(duì)8份臨床疑似山羊傳染性胸膜肺炎疑似樣本進(jìn)行病原DNA提取 用一步式核酸提取試劑盒提取。對(duì)提取好的DNA模板,加入配制好的反應(yīng)液中,加入醋酸鎂放置于37℃水浴鍋或金屬浴上,開始進(jìn)行RPA檢測(cè)。

發(fā) 行： 國(guó)內(nèi)郵發(fā)代號(hào)：8-276 國(guó)際郵發(fā)代號(hào)：BM 4887 每期10.00元，全年120.00元

1.2.6.2 臨床樣品常規(guī)PCR檢測(cè) 依照文獻(xiàn)[20]4.4中規(guī)定的PCR方法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 靶基因的選擇

1.2.3.1 反應(yīng)溫度優(yōu)化 由于RPA反應(yīng)在25～42℃均能反應(yīng),所以選擇25℃與37℃作為典型反應(yīng)溫度,進(jìn)行反應(yīng)溫度的測(cè)試,選擇最優(yōu)化的溫度。

2.1.2 種間特異性 將arcA基因進(jìn)行Mccp與Mmc種間特異性比對(duì)(圖1)。在arcA基因區(qū)域,Mccp與Mmc種間有較大的差異,且種間特異性高,所以,選擇arcA假基因序列作為Mccp的檢測(cè)靶基因。

圖1 arcA基因種間特異性比較

2.2 Mccp-arcA假基因引物探針篩選

引物探針篩選結(jié)果見圖2。3對(duì)引物探針均能順利擴(kuò)增100 copies/μL的模擬樣本,而在擴(kuò)增10 copies/μL的模擬樣本時(shí),第2對(duì)引物探針出線最早,且亮度與均勻性最好,后續(xù)試驗(yàn)選擇第2對(duì)引物探針進(jìn)行。

1～2.第1對(duì)引物探針100拷貝/μL;3～4.第1對(duì)引物探針10拷貝/μL;5～6.陰性;7～8.第2對(duì)引物探針100拷貝/μL;9～10.第2對(duì)引物探針10拷貝/μL;11～12.陰性;13～14.第3對(duì)引物探針100拷貝/μL;15～16.第3對(duì)引物探針10拷貝/μL;17～18.陰性。

2.3 反應(yīng)溫度優(yōu)化

37℃反應(yīng)30 min能夠滿足要求,而25℃條件下,可能需要繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。因此,選擇37℃作為反應(yīng)溫度(圖3)。

大學(xué)英語四六級(jí)考試作為全國(guó)大型標(biāo)準(zhǔn)化英語等級(jí)考試之一，每年都有數(shù)額龐大的高?？忌鷧⒓硬⑶彝ㄟ^考試。然而，在真正的學(xué)習(xí)、生活，甚至工作場(chǎng)合中，遇到外賓，能夠開口用英語與之進(jìn)行流利交談的同學(xué)，實(shí)在是寥寥無幾。中國(guó)學(xué)生耗費(fèi)十余載學(xué)習(xí)英語，最后學(xué)成了聽不懂、說不出的“聾啞英語”。眾多國(guó)人在英語學(xué)習(xí)上高付出，低產(chǎn)出的現(xiàn)象，其根源值得探究。

1～2.37℃ 100拷貝/μL;3～4.37℃ 10拷貝/μL;5.陰性;6～7.25℃ 100拷貝/μL;8～9.25℃10拷貝/μL;10.陰性

2.4 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),T線逐漸加深,25 min與30 min已沒有差異。所以,選擇25 min作為反應(yīng)時(shí)間(圖4)。

1～2.30 min;3～4.25 min;5～6.20 min;7～8.15 min;9～10.10 min

2.5 靈敏度試驗(yàn)

能夠順利檢測(cè)到10 copies/μL的模擬樣本,說明建立的RPA方法靈敏度良好(圖5)。

1.10 000 copies/μL;2.1 000 copies/μL;3.100 copies/μL;4.10 copies/μL;5.1 copies/μL;6.Negative control

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

將模擬樣本稀釋至10 copies/μL,重復(fù)檢測(cè)10次以確認(rèn)該方法重復(fù)性(圖6),試驗(yàn)證明重復(fù)性好。

1～10.重復(fù)檢測(cè)10次1-10.Repeat for 10 times

2.7 準(zhǔn)確性與特異性

建立的方法對(duì)疫苗、陽性樣本有很好的檢出性,對(duì)陰性樣本及非Mccp樣本有很好的特異性。建立的RPA方法準(zhǔn)確性與特異性良好(圖7)。

1～2.疫苗1和疫苗2;3～5.陽性樣本1～3;6～8.陰性對(duì)照;9～11.Mo細(xì)胞培養(yǎng)物標(biāo)準(zhǔn)株;12～14.Mmc細(xì)胞培養(yǎng)物標(biāo)準(zhǔn)株

2.8 臨床樣本檢測(cè)

對(duì)8份臨床疑似山羊傳染性胸膜肺炎樣本同時(shí)進(jìn)行常規(guī)PCR和RPA檢測(cè)(圖8、圖9)。圖9中8

“嗯，那么背書’什么局。什么的，是什么意思？”孟導(dǎo)一邊聽老賈說單口相聲，一邊把他那堆‘乾隆通寶’按大小分好。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～5.慶城縣5份臨床疑似樣本;6～8.景泰縣的3份臨床疑似樣本;9.陽性對(duì)照;10.陰性對(duì)照

1～5.慶城縣5份臨床疑似樣本;6～8.景泰縣的3份臨床疑似樣本;9.陽性對(duì)照;10.陰性對(duì)照

份臨床疑似山羊傳染性胸膜肺炎樣本檢出3份陽性,5份陰性,與圖8常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致,說明本研究建立的RPA技術(shù)對(duì)山羊傳染性胸膜肺炎有很好的檢出率。

3 討論

山羊傳染性胸膜肺炎(CCPP)在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道,Mccp已被公認(rèn)為山羊傳染性胸膜肺炎的唯一病原[1]。2006年第1次分離鑒定出Mccp存在[21]。CCPP所有年齡階段羊均可發(fā)病,懷孕羊易流產(chǎn),高熱、劇烈咳嗽和呼吸困難,剖檢可見肺部大面積肝樣變和纖維胸膜炎[1,8]。該病的診斷以支原體的分離鑒定和常規(guī)PCR為主,支原體生長(zhǎng)緩慢,培養(yǎng)困難[18],PCR方法需要特定的試驗(yàn)環(huán)境和儀器。RPA技術(shù)只需要簡(jiǎn)單的水浴鍋或金屬浴即可一步式完成檢測(cè),使用設(shè)備簡(jiǎn)單,檢測(cè)時(shí)間更短,適合臨床快速檢測(cè)[22]。

由于RPA技術(shù)較其他核酸擴(kuò)增技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作快速便捷等優(yōu)點(diǎn)[12,22],在細(xì)菌、病毒等各種病原體的診斷方面已取得良好的效果[23]。本試驗(yàn)建立的RPA檢測(cè)濃度為10 copies/μL,檢測(cè)靈敏度有較大提升,對(duì)臨床疑似山羊傳染性胸膜肺炎8份樣本檢測(cè)與常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果一致,為山羊傳染性胸膜肺炎的有效防控提供了技術(shù)支撐。

我國(guó)《山羊接觸傳染性胸膜肺炎診斷技術(shù)》(GB/T 34720-2017)規(guī)定的山羊傳染性胸膜肺炎的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有常規(guī)PCR和支原體分離鑒定,尚無用于臨床檢測(cè)的商品化試劑盒。本研究建立的山羊傳染性胸膜炎R(shí)PA檢測(cè)方法,反應(yīng)時(shí)間短(僅為25 min),特異性好(僅檢測(cè)Mccp)。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定通過優(yōu)化反應(yīng)條件適配于核酸檢測(cè)試紙條,操作更加簡(jiǎn)單快捷,降低了檢測(cè)成本,適合基層疫病防控工作。