豬NLRP3基因Real-time PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

劉 博,張 倩,莫 玲,林盼盼,谷英華,劉海隆,蔡青云,張 艷*,王文秀,2*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600; 2.山東省院士工作站,山東濱州 256600; 3.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州 256600; 4.濱州市沾化區(qū)科技創(chuàng)新發(fā)展研究中心,山東濱州 256600; 5.濱州市濱城區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心,山東濱州 256600; 6.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,海南?？?571100)

炎癥反應(yīng)是機(jī)體對感染和組織損傷的急性反應(yīng),可以抑制感染和組織損傷對機(jī)體造成的傷害,也可能導(dǎo)致繼發(fā)性損傷和宿主免疫病。炎癥小體是細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生的一種復(fù)合物,是天然免疫系統(tǒng)重要的組成部分[1-3]。它由胞漿內(nèi)的模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)參與并招募其他蛋白組裝而成的。迄今為止發(fā)現(xiàn)的炎癥小體中,NLRP3炎癥小體研究最廣泛。NLRP3屬于NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs)家族成員,可以被多種病原體如細(xì)菌、病毒、真菌、原蟲感染所激活,也能夠被各種不同結(jié)構(gòu)的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)、宿主內(nèi)源危險(xiǎn)信號(danger associated molecular patterns,DAMPs)和環(huán)境因素所刺激[4-6]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬鏈球菌2型(Streptococcussuis)、經(jīng)典豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)等豬流行性病原體均能激活NLRP3的轉(zhuǎn)錄[7-9]。

豬支原體肺炎(Mycoplasmalpneumoniaof swine,Mps)是由豬肺炎支原體((Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp))引起的一類慢性呼吸道傳染病,該病對各個(gè)年齡階段的豬均易感且具有較高的感染率[10-11],給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。Mps的發(fā)病機(jī)理主要是Mhp先通過黏附素p97、p102和p159與呼吸道黏膜纖毛上皮細(xì)胞黏附引起病變[12],誘導(dǎo)炎性細(xì)胞聚集、細(xì)支氣管擴(kuò)張、單核細(xì)胞浸潤等炎癥反應(yīng),造成纖毛脫落以及對呼吸道上皮損害,引起繼發(fā)性呼吸道感染。探究Mhp激活炎癥反應(yīng)的機(jī)制,找到有效抑制炎癥反應(yīng)的方法是降低豬支原體肺炎等呼吸道疾病的重要手段。豬是Mhp的唯一宿主,引起的豬呼吸道系統(tǒng)疾病及免疫能力下降已嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。本研究根據(jù)NCBI中豬NLRP3基因序列設(shè)計(jì)了一對特異性引物,建立了豬肺臟組織中NLRP3基因的SYBR GreenⅠ real-time PCR檢測方法,并用該方法對Mhp感染后不同天數(shù)的豬肺組織中NLRP3轉(zhuǎn)錄水平變化進(jìn)行分析,為進(jìn)一步研究Mhp感染豬后NLRP3等炎癥因子的作用機(jī)理提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒種與實(shí)驗(yàn)動物 豬肺炎支原體強(qiáng)毒JN-1株(滴度 1×109CCU/mL)由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院保存,5～15 日齡巴馬香豬仔豬由山東綠都生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 Roche FastStart Universal SYBR Green Master(Rox),豬肺炎支原體ELISA檢測試劑盒,濟(jì)南承森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;Total RNA KitⅡ、Gel Extraction Kit、Plasmid Mini KitⅠ,OMEGA bio-tek公司產(chǎn)品;RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit,Thermo公司產(chǎn)品;Light Cycler?480型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,Roche 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 對GenBank數(shù)據(jù)庫中豬NLRP3 cds序列進(jìn)行分析,在其高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對特異性引物,引物序列為YG-NLRP3-F:5′-AGCCTTGAAGAGGAATGGATGG-3′;YG-NLRP3-R:5′-GCCTGGTGAAGCGTTTGTTGAG-3′,預(yù)擴(kuò)增片段長度為189 bp,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.6 Mhp感染豬肺臟組織樣品轉(zhuǎn)錄水平分析 選取30頭5～15日齡健康仔豬,利用PCR或RT-PCR檢測幾種病原體,包括Mhp、PRRSV、圓環(huán)病毒-2、豬傳染性胸膜炎病毒均為陰性。選擇其中15頭感染Mhp,氣管注射,5 mL/頭。感染后7 d采集鼻拭子樣品,豬肺炎支原體ELISA檢測試劑盒進(jìn)行鑒定。根據(jù)豬肺炎支原體感染后發(fā)病的潛伏期、發(fā)病時(shí)間的長短及參考前期豬肺炎支原體攻毒試驗(yàn),分別在感染后7、14、21、28、35、42 d各處死感染豬3頭,并同時(shí)剖殺相應(yīng)階段的健康仔豬,取新鮮肺組織0.1 g在液氮中研磨后按OMEGA total RNA kitⅡ說明書提取總RNA,按建立的SYBR GreenⅠreal-time RT-PCR方法進(jìn)行檢測。

（2）以目標(biāo)管理為導(dǎo)向，建立綜合的指標(biāo)考核體系。綜合的指標(biāo)體系至少應(yīng)包含：利潤總額、國有資產(chǎn)保值增值率和上繳學(xué)校利潤、對學(xué)校教學(xué)科研的服務(wù)和支持力度、重大決策合規(guī)性、承擔(dān)重大專項(xiàng)任務(wù)完成度、對國有資產(chǎn)的維護(hù)和保護(hù)程度、財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)、安全生產(chǎn)、廉政建設(shè)等因素。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取等量的8.4×107、8.4×106、8.4×105copies/μL的重組質(zhì)粒,按上述方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,每份樣品設(shè)3個(gè)重復(fù),進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn);同取以上3份樣品,在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行3次獨(dú)立的檢測,進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)。

RT-PCR擴(kuò)增獲得豬NLP3 cds基因片段(圖1),克隆至pMD18-T載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒,對其進(jìn)行PCR檢測得到1條大小為189 bp的特異片段,與預(yù)期目的片段大小相符,表明克隆載體pMD18T-NLRP3-189構(gòu)建成功。取1 μL測定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的濃度為261 ng/μL,經(jīng)計(jì)算重組陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的DNA分子數(shù)為 8.4×1010copies/μL。

結(jié)果顯示,20 μL反應(yīng)體系中加入引物終濃度為0.15 μmol/L 時(shí)目的條帶最亮且沒有引物二聚體可確定為最佳引物濃度。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性試驗(yàn) 將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒做10倍梯度稀釋,獲得8.4×108、8.4×107、8.4×106、8.4×105、8.4×104、8.4×103、8.4×102、8.4×101copies/μL的系列標(biāo)準(zhǔn)模板,采用優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR,得到各自的Ct 值,以Ct值為橫坐標(biāo),以起始模板濃度的對數(shù)為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定最低檢測量。

“這些純正糧食酒絕無勾兌，案上各樽不僅酒精度不同，而且釀造年份也不同，按烈度由低到高、年份由短到長依次排列。想必您已品出差別，先是淡雅清香，漸次沁脾芬芳，繼而濃郁醇厚，終于回甘無窮?！?/p>

1.2.2 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備 從巴馬香豬體內(nèi)剖取豬肺組織0.1 g研磨后提取總RNA ,方法按OMEGA Total RNA KitⅡ說明書進(jìn)行,得到的RNA測定濃度后利用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成的cDNA置于-80℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增目的片段,反應(yīng)體系為MixTaq25 μL,YG-NLRP3-F和YG-NLRP3-R(10 μmol/L)各1 μL,cDNA 2 μL,用無菌水補(bǔ)足至50 μL;反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果?；厥占兓康钠?將其連接至pMD18-T載體,構(gòu)建陽性質(zhì)粒并測序。測定陽性標(biāo)準(zhǔn)品濃度,計(jì)算拷貝數(shù)。

2.形象診斷式教學(xué)。形象診斷式教學(xué)是指在教學(xué)過程中，對著裝、儀容、表情、體態(tài)、舉止等內(nèi)容學(xué)習(xí)后，教師現(xiàn)場組織形象診斷活動，包括自我診斷、相互診斷、集體診斷。其中相互診斷、集體診斷后，教師要對學(xué)生進(jìn)行點(diǎn)評，通過學(xué)生對所學(xué)禮儀規(guī)范的掌握，進(jìn)行診查判斷。最終達(dá)到學(xué)生對警察禮儀理論知識的掌握。這種方法適合在一個(gè)完整章節(jié)完成之后進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

拷貝數(shù)換算公式:拷貝數(shù)(copies/μL)=

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1.NLRP3目的片段; 2.空白對照

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1～10.不同引物濃度PCR擴(kuò)增的NLRP3目的片段

1～8.8.4×108～8.4×101 copies/μL 1-8.8.4×108-8.4×101 copies/μL

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 PCR引物濃度的優(yōu)化

1.2.3 PCR反應(yīng)體系優(yōu)化 以10倍稀釋得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板,反應(yīng)體系為20 μL,一對引物分別按0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 、0.8、0.9、1.0 μL的量加入體系中進(jìn)行PCR反應(yīng),10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果,獲得最佳引物濃度。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及敏感性試驗(yàn)

經(jīng)反應(yīng)條件的優(yōu)化,確定熒光定量PCR 最佳反應(yīng)體系為20 μL,包括2×SYBR Green Ⅰ Mixture 10 μL,上、下游引物(10 μmoL/L)各0.3 μL,模板(質(zhì)?；騝DNA)2 μL,無菌水7.4 μL。反應(yīng)條件為:95℃ 2 min;95℃ 10 s,60℃ 20 s,72℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)。將陽性重組質(zhì)粒經(jīng)10倍系列稀釋為8.4×108～8.4×101copies/μL共8個(gè)濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),結(jié)果各濃度之間均具有良好的線性關(guān)系,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.5196x+36.968;Efficiency:0.96,R2為0.9996,最低檢出量為84個(gè)拷貝。

2.4 熔解曲線

根據(jù)參數(shù)95℃ 15 s、65℃ 1 min、95℃ 30 s繪制熔解曲線。結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)樣品均出現(xiàn)了窄且尖的單峰,而陰性對照沒有出現(xiàn)熔點(diǎn)峰,熔解溫度為(82±0.5)℃(圖5),表明該反應(yīng)為特異性擴(kuò)增。

圖5 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR熔解曲線

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

本研究建立的real-time PCR批內(nèi)變異系數(shù)為0.067%～0.184%,批間變異系數(shù)為0.221%～0.594%(表1),表明該方法的檢測穩(wěn)定性良好。

表1 豬NLRP3基因SYBR GreenⅠreal-time PCR 檢測方法穩(wěn)定性

2.6 Mhp感染豬肺臟組織樣品轉(zhuǎn)錄水平分析

感染組仔豬在人工感染Mhp強(qiáng)毒后7 d內(nèi),肺組織中NLRP3基因表達(dá)量明顯增加;在感染后14 d可達(dá)到高峰,平均NLRP3拷貝數(shù)達(dá)18 000左右;在感染21 d后,NLRP3拷貝數(shù)緩慢下降,到本試驗(yàn)監(jiān)測周期末(感染后42 d),NLRP3的平均拷貝數(shù)依然保持較高的水平,且感染組和健康組間整體差異顯著(P<0.01)(圖6)。

石灰活性對硬硅鈣石纖維合成的影響規(guī)律可由溶解-吸附理論進(jìn)行闡釋。在初始階段，隨著環(huán)境的升高，石英粉和石灰開始溶解，由于石英粉的溶解度較低，石英粉顆粒表面會吸附溶液中的Ca2+形成一層CaSiO3水化膜，而后由于擴(kuò)散和遷移作用，水化膜內(nèi)部顆粒的逐漸溶解，同時(shí)硬硅鈣石纖維開始形成。因此，在硅質(zhì)原料活性不變的條件下，硬硅鈣石纖維的合成速率和反應(yīng)程度主要取決于石灰的活性。石灰活性越高，Ca(OH)2的溶解速率越快，溶液中Ca2+濃度越高，硬硅鈣石纖維的合成速率也越快。因此，石灰活性越高，合成的硬硅鈣石纖維晶型越好。

鎂對作物養(yǎng)分效率的提高具有重要作用。作物養(yǎng)分效率可分為吸收效率和利用效率：吸收效率取決于植物根系對養(yǎng)分的選擇性吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力、根際養(yǎng)分供應(yīng)能力和土壤養(yǎng)分有效性；利用效率一般以植物組織內(nèi)單位養(yǎng)分所生產(chǎn)的干物質(zhì)重量來衡量。

圖6 Mhp感染后豬肺組織NLRP3表達(dá)水平變化

3 討論

肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae,Mp)是一種非典型的細(xì)菌性呼吸道病原體,可引起一系列氣道炎癥、肺及肺外病變[13]。肺炎支原體能夠觸發(fā)NLRP3炎癥體激活和白細(xì)胞介素-1β在巨噬細(xì)胞內(nèi)的分泌[14]。正常RAW264.7細(xì)胞是可以表達(dá)NLRP3、ASC和caspase-1基因,而不同感染復(fù)數(shù)的Mp感染RAW264.7細(xì)胞4 h后,NLRP3、ASC和caspase-1表達(dá)均顯著增加,說明NLRP3炎癥體與Mp早期感染過程有關(guān)。在對綿羊肺炎支原體體外感染綿羊巨噬細(xì)胞分子機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn),綿羊肺炎支原體及其脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白可引起綿羊肺泡巨噬細(xì)胞表面TLR2及胞內(nèi)NLRP3受體基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平升高[15]。對于Mhp是否能激活豬體內(nèi)NLRP3炎癥小體的表達(dá)還未見報(bào)道。因此,建立一種快速、準(zhǔn)確的豬NLRP3檢測方法,對豬肺炎支原體致病機(jī)理進(jìn)行深入研究非常必要。

本研究通過優(yōu)化反應(yīng)條件和特異性、敏感性、重復(fù)性試驗(yàn),建立了豬NLRP3基因SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法。建立的檢測方法特異性強(qiáng),熔解曲線有單一峰;靈敏度高,最小檢出量可達(dá)84 copies/μL,比常規(guī)PCR檢測方法敏感100倍;穩(wěn)定性好,批內(nèi)變異系數(shù)小于0.2%,批間變異系數(shù)小于0.6%,具有良好的重復(fù)性。用該方法對健康仔豬和Mhp感染仔豬的肺臟中NLRP3進(jìn)行檢測,與健康仔豬相比Mhp感染7～42 d豬肺臟中的NLRP3表達(dá)水平明顯提升,在14 d時(shí)達(dá)到峰值,表明Mhp感染可誘導(dǎo)NLRP3的激活,NLRP3的過量表達(dá)和釋放與Mhp的感染引起豬肺組織的炎癥反應(yīng)存在密切的關(guān)系。本研究建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法?？梢杂糜跈z測NLRP3的轉(zhuǎn)錄水平的變化,為研究NLRP3在天然免疫細(xì)胞應(yīng)答和豬支原體肺炎發(fā)病機(jī)理研究及抗炎藥物的篩選提供了技術(shù)支持。