3-甲基-4-硝基酚對大鼠腎臟氧化損傷作用的研究

岳 卓，常玲玲，許方倩偉，佘銳萍

（1.北京天壇生物制品股份有限公司，北京 朝陽 100024；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；4.中國生物技術(shù)股份有限公司科研與國際合作部，北京 朝陽 100029）

3-甲基-4-硝基酚對大鼠腎臟氧化損傷作用的研究

岳 卓1，2，常玲玲2，3，許方倩偉4，佘銳萍2

（1.北京天壇生物制品股份有限公司，北京 朝陽 100024；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；4.中國生物技術(shù)股份有限公司科研與國際合作部，北京 朝陽 100029）

為了探討3-甲基-4-硝基酚（PNMC）對大鼠腎臟的氧化損傷作用，選擇SPF級雄性SD大鼠，隨機(jī)分為4組（每組10只），設(shè)立3個染毒組和1個對照組。染毒組采用皮下注射的途徑分別給予每天劑量為1mg/kg體重、10mg/kg體重和100mg/kg體重的PNMC，連續(xù)5 d。對照組采用同樣的途徑給予溶劑（PBS+0.05%tween80），最后一次染毒后第24小時剖檢取材。稱量體重和器官重量，觀察腎臟組織病理學(xué)變化，檢測血清中肌酐和尿素氮的含量，以及超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、總抗氧化能力及丙二醛等抗氧化指標(biāo)的含量。結(jié)果顯示，染毒組大鼠體重和日增重出現(xiàn)不同程度的下降；各劑量組大鼠腎臟均有不同程度的病理損傷；100mg/kg體重組大鼠肌酐濃度顯著升高，所有染毒組大鼠超氧化物歧化酶的含量均顯著下降，10mg/kg體重染毒組大鼠總抗氧化能力也顯著低于對照組。綜上所述，PNMC染毒后血清中超氧化物歧化酶的活性降低，同時伴有總抗氧化能力下降，提示大鼠體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，導(dǎo)致過多的過氧化物在體內(nèi)蓄積，從而對大鼠腎臟造成氧化損傷。

3-甲基-4-硝基酚；SD大鼠；腎臟；氧化損傷

3-甲基-4-硝基酚（PNMC）是柴油機(jī)尾氣的重要組織成分，也是殺蟲劑殺螟松在生物體內(nèi)的主要降解產(chǎn)物。研究表明，隨著柴油機(jī)尾氣的大量排放和農(nóng)藥的廣泛使用，PNMC不斷地在環(huán)境中蓄積，通過呼吸道、消化道、皮膚等途徑進(jìn)入人及動物體內(nèi)，嚴(yán)重威脅動植物乃至人類的健康[1-2]。

現(xiàn)有研究已經(jīng)證實，氧化應(yīng)激（OS）是外源性物質(zhì)產(chǎn)生毒性作用最基本的分子機(jī)制[3-4]。它主要是由活性氧和脂質(zhì)過氧化物介導(dǎo)生物大分子和脂膜產(chǎn)生自由基，引起氧化損傷和細(xì)胞死亡[5]。有報道表明，PNMC可以引起雞胚精原細(xì)胞產(chǎn)生OS[6]，而且當(dāng)暴露于柴油機(jī)尾氣中時可引起OS[7]，這些結(jié)果提示，OS可能是PNMC產(chǎn)生毒性作用的重要發(fā)病機(jī)制。我們前期研究證明，PNMC可損傷大鼠腎臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)[8]，本研究中，我們擬探討PNMC誘導(dǎo)腎臟損傷與OS之間的關(guān)系，為揭示PNMC誘導(dǎo)的腎臟損傷的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng) 體重160～180 g SPF級 SD雄性大鼠40只，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，分籠飼養(yǎng)（2～3只/籠），自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫21℃～24℃，相對濕度：30%～40%，每兩天更換1次墊料。大鼠對飼養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)1周后進(jìn)行染毒試驗。大鼠隨機(jī)均分為4組，3個染毒組和1個對照組。其中染毒組分別是1mg/kg體重、10mg/kg體重和100mg/kg體重劑量組,每天采用皮下注射的途徑進(jìn)行染毒，連續(xù)進(jìn)行5 d，對照組皮下注射等量的溶劑（PBS+ 0.05%tween80）。每天觀察大鼠的活動情況并稱重。最后1次染毒后第24小時，無痛處死大鼠,采血并分離血清備用，摘取兩側(cè)的腎臟，稱量器官濕重并計算其臟器系數(shù)（腎臟濕重/體重），右側(cè)腎臟液氮冷凍備用，左側(cè)腎臟用2.5%多聚甲醛-戊二醛固定液充分固定備用。

1.2 組織病理學(xué)觀察 腎臟組織塊經(jīng)固定液充分固定后，按常規(guī)方法進(jìn)行脫水、透明和石蠟包埋，制作成厚度為4μm的連續(xù)切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（H.E.）染色，OLYMPUS顯微鏡進(jìn)行觀察，拍照。

1.3 血清中肌酐和尿素氮水平的測定 為了評價腎臟功能，利用肌酐（Cre）測試盒和尿素氮（BUN）測試盒（均購自南京建成生物工程研究所）檢測血清中的Cre和BUN的水平變化。具體

方法按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 血清和組織中抗氧化水平的測定 為評價機(jī)體抗氧化能力，利用超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（TAOC）和丙二醛（MDA）等試劑盒（均購自南京建成生物工程研究所）分別檢測了血清和腎臟組織中SOD、GSH-Px、T-AOC及MDA等抗氧化指標(biāo)的活性。具體方法按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計 數(shù)據(jù)處理采用SPSS12.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性差異檢驗。數(shù)據(jù)表達(dá)方式以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示與對照組相比差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 PNMC對大鼠體重和腎臟重量的影響 由表1可知，SD大鼠經(jīng)PNMC染毒5 d后，各劑量組大鼠體重及日增重均顯著低于對照組（P＜0.05），但是腎臟的相對重量與對照組相比并無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 PNMC對大鼠體重及腎臟重量的影響

2.2 PNMC對大鼠腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 組織病理學(xué)觀察結(jié)果（見中插彩版圖1）顯示，對照組大鼠腎臟腎小管上皮細(xì)胞排列緊密、有序，刷狀緣清晰、致密（見中插彩版圖1A），而PNMC染毒組大鼠腎臟均出現(xiàn)了不同程度的損傷：經(jīng)1mg/kg體重和10mg/kg體重劑量的PNMC處理的大鼠腎臟近曲小管的刷狀緣溶解消失（見中插彩版圖1B、圖1C），經(jīng)10mg/kg體重和100mg/kg體重劑量的PNMC處理的大鼠腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)的腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的壞死，細(xì)胞核固縮凝聚，且髓質(zhì)部的壞死程度較皮質(zhì)部嚴(yán)重（見中插彩版圖1C、圖1D）。腎小管上皮細(xì)胞死亡的特點與我們以前研究所描述的壞死損傷特點基本一致[8]。

2.3 PNMC對大鼠血清中肌酐和尿素氮水平的影響 血清學(xué)分析結(jié)果（圖2）顯示，與對照組相比，經(jīng)PNMC染毒后，大鼠血清BUN水平并沒有明顯變化，大鼠血清Cre水平在1mg/kg體重和10mg/ kg體重PNMC劑量組也只是略有升高，但是在100mg/kg體重PNMC劑量組大鼠血清肌酐的濃度卻顯著升高（P＜0.05）。

2.4 PNMC對SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA活性的影響 血清中抗氧化指標(biāo)檢測結(jié)果（見表2）顯示，染毒組大鼠血清中SOD濃度與對照組比較均顯著下降（P＜0.05）；血清中T-AOC的含量在10mg/kg體重PNMC染毒組也顯著低于對照組（P＜0.05）；染毒組大鼠血清GSH-Px濃度略有降低，MDA濃度略有升高，但與對照組比較差異不顯著（P＞0.05）。

表2 PNMC對大鼠血清SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA活性的影響

圖2 PNMC對大鼠血清肌酐和尿素氮水平的影響注：大鼠經(jīng)PNMC染毒后，與對照組相比，100mg/kg體重劑量組血清中肌酐水平顯著升高，各劑量組尿毒氮水平與對照組相比未見有明顯差異P＞0.05；*：與對照組相比有顯著差異性，P＜0.05，n=10

腎臟組織中抗氧化指標(biāo)檢測結(jié)果見表3，與血清檢測結(jié)果不同，PNMC染毒后大鼠腎臟組織中的SOD、GSH-Px和T-AOC的濃度與對照組比較稍有下降，但差異不顯著；同樣，PNMC染毒后大鼠腎臟組織中MDA的含量與對照組比較稍有升高，但差異也不顯著（P＞0.05）。

表3 PNMC對大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA活性的影響

3 討論

PNMC可通過呼吸道、消化道及皮膚進(jìn)入動物機(jī)體，因此本研究選用皮下注射的方式對大鼠進(jìn)行染毒。已有研究表明，經(jīng)PNMC染毒的大鼠增重及器官重量均下降[9]。在本研究中，PNMC染毒后大鼠的體重和平均日增重也顯著下降。然而，Li等[10]采用同樣的染毒方式未發(fā)現(xiàn)PNMC對大鼠體重有明顯的影響，這可能歸因于選用了不同品系的大鼠，而本研究結(jié)果提示SD大鼠對PNMC更為敏感。

剖檢結(jié)果顯示，PNMC染毒組小鼠沒有出現(xiàn)明顯的大體病變，但是，在100 mg/kg體重PNMC組發(fā)現(xiàn)血清中Cre濃度顯著升高。血清中Cre濃度是評價腎臟功能的一個常用指標(biāo)，其濃度升高意味著腎臟功能出現(xiàn)損傷。因此，本研究結(jié)果表明，PNMC可以損傷腎臟功能。病理組織學(xué)觀察結(jié)果進(jìn)一步證明了PNMC對腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞作用。染毒組大鼠腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生壞死，主要位于腎臟的皮髓交界處和髓質(zhì)部，而且隨著染毒劑量的增加，壞死細(xì)胞數(shù)量也增加，呈現(xiàn)明顯的劑量相關(guān)性。研究表明，PNMC具有擴(kuò)張血管的作用[11-12]，可造成大鼠腎臟缺血應(yīng)激，而且腎臟髓質(zhì)血流量少于皮質(zhì)，所以髓質(zhì)區(qū)腎小管上皮細(xì)胞的病變程度高于皮質(zhì)區(qū)。以上結(jié)果表明，PNMC對大鼠腎臟具有毒性作用。

在正常情況下，機(jī)體產(chǎn)生的活性氧簇（ROS）的清除有賴于抗氧化酶系統(tǒng)（SOD、GSH-Px和/或過氧化氫酶）和非酶類抗氧化劑（如：谷胱甘肽、維生素E）[13-15]。當(dāng)這個系統(tǒng)的平衡被破壞，即自由基產(chǎn)生過多和（或）抗氧化防御能力下降，就會造成氧化損傷，自由基可以直接和脂質(zhì)、蛋白以及DNA反應(yīng)造成不可逆的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16-17]。另外，自由基還可以與存在于細(xì)胞膜上的很對不飽和脂肪酸以及膽固醇反應(yīng)，隨后引起細(xì)胞凋亡[18]。Donaldson等[19]的研究表明，DEP可以引起小鼠肺臟產(chǎn)生ROS，造成蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)氧化和DNA損傷。在本研究中，大鼠連續(xù)5 d皮下注射不同濃度的PNMC后，血清中SOD的含量顯著下降，這一結(jié)果與PNMC在雞胚精原細(xì)胞的試驗結(jié)果一致[6]；而且血清中T-AOC的含量在10mg/kg體重PNMC染毒組也顯著低于對照組，這些結(jié)果表明血清中抗氧化酶的活性降低。然而，腎臟組織中的SOD、GSH-Px和T-AOC的含量稍有下降，但與對照組比較差異不顯著，同樣，MDA的含量也沒有明顯變化，表明腎臟組織中的抗氧化酶的活性并未受到影響。綜上，PNMC染毒后血清中SOD活性降低同時伴有T-AOC的下降，提示大鼠體內(nèi)氧化系統(tǒng)遭到破壞，生成的活性氧自由基不能被及時清除，導(dǎo)致過多的過氧化物在體內(nèi)蓄積，對大鼠腎臟造成氧化損傷。

綜上所述，本研究揭示了PNMC對大鼠腎臟的損傷作用主要是通過氧化應(yīng)激引起的，即PNMC通過抑制抗氧化酶的活性引起大鼠腎臟氧化損傷，但這些過程之間的相互作用及調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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S865.1+2

B

0529-6005（2015）11-0087-03

2014-06-13

岳卓（1982-），女，博士，研究方向為動物毒理病理學(xué)和生物制品學(xué)，E-mail：w16154149@163.com

佘銳萍，E-mail：sheruiping@126.com