吉林省豬源沙門菌毒力基因檢測及耐藥性分析

陳 龍，李茂輝，康元環(huán)，曹 亮，單曉楓，王姣姣，錢愛東

（吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林 長春 130118）

吉林省豬源沙門菌毒力基因檢測及耐藥性分析

陳 龍，李茂輝，康元環(huán)，曹 亮，單曉楓，王姣姣，錢愛東

（吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林 長春 130118）

為了解吉林省規(guī)?；i場豬群中沙門菌的攜帶、毒力基因分布及耐藥性等情況，本試驗于2013年間采集吉林省規(guī)?；i場豬直腸拭子540份，經(jīng)細菌分離、生化鑒定、分子生物學鑒定，共檢出豬源沙門菌18株，檢出率3.33%，同時對菌株進行藥敏試驗、毒力基因檢測及致病性試驗。結(jié)果顯示，18株分離株對鏈霉素耐藥率為72.22%，對四環(huán)素耐藥率為72.22%，其他藥物耐藥率普遍高于22.2%，且多重耐藥嚴重。此外，共檢測10種毒力基因，其中sse C、spv A、spv R三種基因檢出率分別為72.2%、72.2%、83.3%。小鼠致病性試驗中，有11株分離株對小鼠具有較強的致病性（61.1%）。表明分離沙門菌存在多重耐藥現(xiàn)象，且致病力的增強可能與毒力島和毒力質(zhì)粒的存在有關(guān)。

豬；沙門菌；藥敏試驗；毒力基因

沙門菌（Salmonella）是引發(fā)人和動物食物中毒、胃腸炎的重要的人畜共患病原菌，其在臨床上較為常見，治療時，常常盲目的使用抗生素，導致多重耐藥菌株的出現(xiàn)。此外，該菌還具有多種毒力基因，主要存在于質(zhì)粒和染色體上的毒力島中[1]，沙門菌粘附到宿主組織后通過毒力因子侵襲宿主細胞，導致宿主患病及死亡[2]，因此，豬源沙門菌的流行情況值得重視。目前，我國多個省市已開展了豬源沙門菌攜帶的調(diào)查與研究，但是卻未見吉林省的報道。本研究采用直腸棉拭子對吉林省部分規(guī)模化養(yǎng)豬場健康豬沙門菌進行分離，用常規(guī)理化及PCR方法對其進行鑒定，并對耐藥性以及主要毒力基因進行分析，為豬源沙門菌病的預防、診斷和治療提供科學的試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TTB增菌液、SC增菌液、BS瓊脂、H.E.瓊脂、三糖鐵（TSI）瓊脂，購自青島海博生

物技術(shù)有限公司；生化發(fā)酵管、革蘭染色液、藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；DNA Marker DL-2 000、Taq DNA聚合酶，購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒，購自北京索萊寶技術(shù)有限公司等

1.2 細菌分離純化 病料來源為2013年3月-2013年8月，選取吉林省長春、松原、四平、遼源、吉林等地區(qū)的規(guī)模化豬場，采集臨床健康豬直腸棉拭子，共計540份。按照食品安全國家標準GB 4789.4-2010進行初步分離沙門菌，將疑似沙門菌的菌落進行純培養(yǎng)，并于4℃保存。

1.3 細菌鑒定

1.3.1 細菌的理化鑒定 將純化的細菌分別進行TSI瓊脂鑒別培養(yǎng)、賴氨酸脫羧酶試驗、吲哚試驗、KCN抑制試驗、尿素酶試驗、糖發(fā)酵試驗（甘露醇、山梨醇、衛(wèi)矛醇、水楊苷）、ONPG試驗、丙二酸鹽利用試驗，具體操作過程與結(jié)果判定參見國標GB 4789.4-2010與農(nóng)業(yè)部行標NY/T 550-2002。

1.3.2 細菌的PCR鑒定 采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組，根據(jù)沙門菌invA基因設計引物：inv A-F 5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′、inv A-R 5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′，引物合成由華大基因生物工程技術(shù)服務公司合成。反應條件為：95℃5 min；94℃1 min，60℃1 min，72℃1 min，30個循環(huán)；72℃10min；4℃終止反應、保存。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司純化并測序，序列結(jié)果用NCBI-BLAST搜索比對，鑒定標準按照同源性≥97%判定。

1.3.3 細菌血清型鑒定 采用玻板凝集法，利用A～F多價O血清及單因子O血清鑒定菌株的O抗原，H因子血清鑒定其鞭毛抗原，并判定沙門菌種屬。

1.4 藥敏試驗 采用CLSI推薦的K-B法進行，根據(jù)CLSI（2009）的標準判定其耐藥性。質(zhì)控菌采用大腸埃希菌ATCC25922。

1.5 毒力基因檢測 對豬源沙門菌進行10種常見的毒力基因的PCR檢測,引物序列見表1。

沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv A、spv C、spv R檢測引物參考GenBank，沙門菌毒力島基因M gt C、org A、ssc A、sse C、sse D、sse E、ar A、bcf的檢測引物參考文獻[3-4]。采用煮沸法提取細菌總DNA模本。PCR反應體系為25μL。反應條件經(jīng)優(yōu)化：95℃5min；94℃1min、退火1min（spv C，spv R為54℃，ssc A、sse E、ar A、bcf為55℃，sse C、sse D為58℃，spv A、M gtC、o rg A為59℃），72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min；4℃終止反應。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序。

表1 PCR擴增引物序列

1.6 致病性試驗 將鑒定的豬源沙門菌腹腔注射接種健康昆明系小鼠0.2 mL（108CFU/mL），試驗前禁食、禁水24 h，每株菌設5個重復，對照組腹腔注射生理鹽水，隔籠飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，觀察并剖檢發(fā)病后死亡的小鼠，按1.3方法對其進行細菌分離鑒定，并統(tǒng)計致病率。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離鑒定 540份臨床健康豬直腸棉拭子，通過沙門菌增菌液和沙門菌鑒別培養(yǎng)基、生化發(fā)酵管、PCR特異性基因inv A擴增鑒定，證明18株細菌分離菌株為沙門菌，占采樣總數(shù)的3.33%（18/540）。18株沙門菌經(jīng)血清學鑒定，其中豬霍亂沙門菌有9株、鼠傷寒沙門菌6株、德爾卑沙門菌2株、劍橋沙門菌1株。

2.2 藥敏試驗結(jié)果 18株豬源沙門菌對14種抗生素的藥敏結(jié)果見表2。耐藥頻率顯示，豬源沙門菌分離株至少為4重耐藥、最多為12重耐藥、其余為5重耐藥至11重耐藥均有菌株分布。

2.3 毒力基因檢測結(jié)果 對18株豬源沙門菌進行10種毒力基因的PCR檢測，所有毒力基因均有檢出。其中分布于毒力島2上的毒力基因sse C（72.2%），毒力質(zhì)粒上的毒力基因spv R（83.3%）、spv A（72.2%）、spv C（72.2%），遠高于其他毒力島上的毒力基因，如org A（22.2%）、M gt C（22.2%）、bcf A（11.1%）、ara B（16.7%）、sse D（50%）、sse E（33.3%）。

表2 18株豬源沙門菌藥敏結(jié)果

2.4 致病性試驗結(jié)果 將18株豬源沙門菌分離株接種小鼠，試驗結(jié)果顯示，多數(shù)分離株對小鼠具有較強的致病性，其中11株具有致病性（61.1%）；有6株呈現(xiàn)不同程度的發(fā)病后死亡，致死率為33.3%。從致死小鼠體內(nèi)實質(zhì)器官分離出的細菌、經(jīng)理化及分子生物學鑒定、與接種細菌相同；而對照組小鼠則無異常。

3 討論

豬源沙門菌是典型的人獸共患病原菌。本試驗對吉林省部分地區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)豬場臨床健康豬群沙門菌的攜帶情況進行了調(diào)查，共分離出疑似沙門菌35株，進一步采用沙門菌種特異性引物invA進行驗證，最終鑒定出沙門菌18株，分離率為3.33%。

本試驗對18株豬源沙門菌吉林分離株進行了14種抗生素的耐藥性分析，結(jié)果顯示，這些菌株對四環(huán)素（88.89%）、鏈霉素（72.22%）、多西環(huán)素（55.56%），均超過50%。與我國其他省份相比，吉林省豬源沙門菌對不同抗生素的耐藥情況不盡相同，這與抗生素使用情況和細菌分離株地區(qū)差異有關(guān)[5]。雖然吉林省豬源沙門菌分離株對大部分抗生素表現(xiàn)出較高的敏感性，但考慮中度敏感率明顯高于其他省市，因此，在選擇藥物治療沙門菌引發(fā)的疾病時，要慎用少用這類抗生素。

致病性試驗結(jié)果證明，多數(shù)豬源沙門菌分離株對小鼠具有致病性。此外，豬源沙門菌的致病性與毒力基因關(guān)系密切。本研究對18株豬源沙門菌進行了10種毒力基因的PCR檢測。結(jié)果表明，從18株豬源沙門菌中檢測到13株具有sse C基因，且對小鼠的致病性較高。這可能與sse C基因編碼的sse C蛋白作為Ⅲ型分泌系統(tǒng)中底物蛋白的效應蛋白，且SPI2編碼與系統(tǒng)感染有關(guān)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)。在致病性的試驗中，攜帶較多毒力島2上的毒力基因其致病性顯著高于沒有此基因的菌株；此外，在只檢測出毒力質(zhì)粒的分離株中，小鼠致病率很高，表明spv的存在能增強菌株的致病力；毒力島和毒力基因同時存在時，引起的病變更為嚴重。相關(guān)文獻表明，SPI1編碼與侵襲力有關(guān)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)、SPI3參與沙門菌在巨噬細胞內(nèi)存活有關(guān)、SPI4和SPI5編碼參與細菌在靶細胞內(nèi)的相關(guān)蛋白等[6]，然而這些毒力島上的毒力基因org A、M gt C、bcf A、ara B檢出率較低，無法確切說明這些毒力基因與致病性的關(guān)系，因此，尚待進一步的研究。

[1]陳金頂，索青利，廖明，等.沙門菌的inv A基因序列分析與分子檢測[J].中國人獸共患病雜志，2004，20（10）：868-871.

[2]王效義.沙門菌毒力島及其Ⅲ型分泌系統(tǒng)[J].生物技術(shù)通訊，2004，15（2）：160-162.

[3]Bhowmick P P，Devegowda D，Ruwandeepika H A，et al.Pres?ence of Salmonella pathogenicity island 2 genes in seafood-associ?ated Salmonella serovars and the role of the sseC gene in survival of Salmonella enterica serovar Weltevreden in epithelial cells[J]. Microbiology，2011，157（Pt1）：160-168.

[4]田質(zhì)高.蛋源沙門菌毒力島的檢測及標志基因的研究[D].揚州：揚州大學，2009：28-30.

[5]楊寶偉.陜西食源性沙門菌耐藥及相關(guān)基因[J].微生物學報，2010，50（6）：788-796.

[6]Gerlach R G，Clfiudio N，Rohde M，et al.Cooperation of Salmo?nella pathogenicity islands 1 and 4 is required to breach epitheli?al barriers[J].Cell Microbiol，2008，10（11）：2364-2376.

Virulence gene detection and antibiotic sensitivity of sw ine Salmonella from Jilin province

CHEN Long，LIMao-hui，KANG Yuan-huan，CAO Liang，SHAN Xiao-feng，WANG Jiao-jiao，QIAN Ai-dong
（College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

To investigate the virulence genes and antibiotic susceptibility of swine Salmonella in Jilin Province，a total of 540 rectal swabs sampleswere collected from health pigs in scale farms in 2013 and 18 isolates of Salmonellawere isolated which were identified bymorphology，physical and chemical characteristics，susceptibility testing,virulence genes detection and pathogenicity. The results showed that the resistance rateswere 72.22%to the drugs of STR and TET，respectively.Other resistance rates were generally higher than 22.2%，and most of the Salmonella isolates weremulti-drug resistance.In addition，the positive rates of the virulence genes of sseC，spvA and spvR were 72.2%，72.2%and 83.3%，respectively.Moreover，11 isolates were proved to be pathogenic tomice（61.6%）.The Salmonella isolated showedmultiple-resistance to Antimicrobial Drugs.The increase of pathoge?nicitymay relate to the plasmid virulence and some pathogenicity island.

Swine；Salmonella；susceptibility testing；virulence genes Corresponding authors：QIAN Ai-dong；SHAN Xiao-feng

S856.65+1

A

0529-6005（2015）11-0082-03

2014-04-04

吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設-生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（201224、201324）

陳龍（1989-），男，博士生，研究方向為動物細菌學，E-mail：944515582@qq.com

錢愛東，E-mail：qianaidong0115@163.com；單曉楓，E-mail：sxf1997@163.com