中心復(fù)合設(shè)計法優(yōu)化制備丹參酮ⅡA魚精蛋白納米粒

馮 博， 承 偉

（遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧錦州121000）

中心復(fù)合設(shè)計法優(yōu)化制備丹參酮ⅡA魚精蛋白納米粒

馮 博， 承 偉*

（遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧錦州121000）

目的 采用中心復(fù)合設(shè)計法優(yōu)化制備丹參酮ⅡA魚精蛋白納米粒。方法 以魚精蛋白為載體材料，應(yīng)用去溶劑法制備丹參酮ⅡA魚精蛋白納米粒。再以丹參酮ⅡA與魚精蛋白比例、藥物在乙醇中質(zhì)量濃度、乙醇與水體積比為考察因素，以包封率為考察指標(biāo)，根據(jù)中心復(fù)合設(shè)計原理安排實驗，篩選最佳工藝，并對所得納米粒進(jìn)行形態(tài)、粒徑及釋放度等體外表征。結(jié)果 最優(yōu)工藝條件為丹參酮ⅡA與魚精蛋白比例 （m/m）0.25，藥物在乙醇中質(zhì)量濃度10 mg/m L，乙醇與水體積比1：1。在此條件下，納米粒包封率為86.05%，模型預(yù)測值和實測值接近。所得納米粒外觀呈球形，平均粒徑為 （112.3±20.4）nm，體外釋放行為呈良好的緩釋特性。結(jié)論 該工藝條件準(zhǔn)確可靠，具有實用價值，所建立模型的預(yù)測性良好。

丹參酮ⅡA；魚精蛋白；納米粒；中心復(fù)合設(shè)計法

中心復(fù)合設(shè)計（central composite design，CCD）是近年來國外常采用的實驗優(yōu)化方法，具有試驗次數(shù)少、精度高等特點(diǎn)，相較于國內(nèi)普遍應(yīng)用的正交設(shè)計和均勻設(shè)計，該設(shè)計在試驗安排及結(jié)果預(yù)測上更接近真實值，因而在處方設(shè)計和工藝篩選中的優(yōu)勢更為顯著［1］。丹參酮，亦稱總丹參酮，是從中藥丹參Salviamiltiorrhiza Bunge根部提取出的具有抑菌作用的脂溶性化合物，包括丹參酮I、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮、異隱丹參酮等多個單體，其中丹參酮ⅡA為主要的脂溶性成分。研究表明，丹參酮ⅡA能有效改善冠狀動脈循環(huán)及微循環(huán)障礙，促進(jìn)心肌再生，抑制細(xì)胞損傷等，同時還具有抗感染、抗氧化、抗腫瘤、改善肝功能、改善微循環(huán)等藥理作用，其抗腫瘤活性，尤其在胃部腫瘤等臨床治療上的療效確切［2-4］。研究表明，丹參酮ⅡA能降低RNAPⅡ的蛋白水平，同時激活P53，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，依賴于這種DNA分子構(gòu)象損傷的RNAP II響應(yīng)是決定丹參酮IIA發(fā)揮抗腫瘤活性的分子基礎(chǔ)［5］，因此可認(rèn)為它是一種極有應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物。但是，由于丹參酮ⅡA水溶性較差，口服生物利用度較低，體內(nèi)消除半衰期短，臨床上常采用其磺酸鈉鹽注射液，但它穩(wěn)定性較差，刺激性較強(qiáng)，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，主要為皮膚及其附件損害、全身性反應(yīng)，嚴(yán)重者可出現(xiàn)過敏性休克［6］。本實驗針對丹參酮ⅡA的理化性質(zhì)，采用去溶劑化交聯(lián)法制備丹參酮ⅡA魚精

蛋白納米粒，然后應(yīng)用中心復(fù)合設(shè)計法對其優(yōu)化制備，并進(jìn)行形態(tài)、粒徑及釋放度等體外表征，以期降低藥物刺激性，提高制劑穩(wěn)定性，并最終達(dá)到提高丹參酮ⅡA體內(nèi)生物利用度及滯留時間的目的，進(jìn)而提高其抗腫瘤效果。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 RC-6溶出度測試儀 （天津市新天光儀器分析技術(shù)有限公司）；UV-2450紫外可見分光光度計 （日本島津公司）；KQ-300E型超聲波清洗器 （上海生析超聲儀器有限公司）；JEM-1200EX透射電子顯微鏡 （日本電子株式會社）；Nano ZS90粒度電位分析儀（英國Malvern公司）。

1.2 試藥 FractionV魚精蛋白（美國Sigma公司）；丹參酮ⅡA對照品 （中國食品藥品檢定研究院，編號110766-200918，純度＞98%）；丹參酮ⅡA（批號20090723，陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞95%）。所用試劑均為分析純 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA魚精蛋白納米粒的制備 稱取魚精蛋白適量，分散于去離子水中，渦旋震蕩至全部溶解，形成溶液（A），將丹參酮ⅡA溶解于適量乙醇中，形成溶液 （B）。然后，在一定轉(zhuǎn)速的攪拌下將溶液 （B）緩慢滴至溶液（A）中至有乳光產(chǎn)生，形成初始納米粒，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮除去乙醇，出現(xiàn)有明顯乳光的分散體系，即得。

2.2 檢測波長的確立及方法學(xué)試驗

2.2.1 檢測波長的選擇 精密稱取丹參酮ⅡA對照品適量，加乙醇溶解，定容至50 mL，作為對照品溶液。然后，分別將對照品和輔料溶液稀釋至一定質(zhì)量濃度后，在波長200～400 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA在270 nm處有最大吸收，而且輔料在此波長下無干擾，故選擇270 nm作為檢測波長。

2.2.2 方法學(xué)試驗 精密吸取對照品貯備液適量，配制成質(zhì)量濃度分別為3.0、6.0、9.0、12.0、15.0、21.0、30.0 μg/m L的對照品溶液。以270 nm波長處的吸光度 （A）為縱坐標(biāo) （Y），藥物質(zhì)量濃度 （μg/mL，G）為橫坐標(biāo) （X）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程Y=0.013 7X+0.148（r=0.999 7，n=6），表明丹參酮ⅡA在3.0～30.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。然后，精密量取6.0、12.0和24.0 μg/m L三個質(zhì)量濃度的丹參酮ⅡA對照品溶液，進(jìn)行精密度實驗，各質(zhì)量濃度樣品連續(xù)測定5次，測得RSD分別為0.018%、0.007%和0.011%。另取空白納米粒溶液適量，進(jìn)行加樣回收試驗，測得平均回收率為99.26%，RSD為0.016%，符合體外分析方法要求。

2.3 包封率測定［7-9］精密稱取丹參酮ⅡA魚精蛋白納米粒適量，分散于10 mL乙醇溶液中，在20 000 r/min下冷凍離心30min，取上清液5 mL，0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液于270 nm波長處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算上清液中丹參酮ⅡA（即體系中游離藥物）的含有量，再按下式計算納米粒包封率（encapsulation efficiency，EE），公式為EE=［（W0-W1）/W0］×100%。其中，W0為原始投藥量 （mg），W1為體系中游離藥物量 （mg）。

2.4 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果

2.4.1 模型建立與分析 在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，最終選擇影響納米粒形成的三個主要影響因素，即丹參酮ⅡA與魚精蛋白質(zhì)量比 （X1）、藥物在乙醇中質(zhì)量濃度 （g/mL，X2），乙醇與水體積比 （X3），以包封率 （Y）為考察指標(biāo)，中心復(fù)合設(shè)計法安排試驗，方案及結(jié)果見表1、表2。

表1 因素水平表

表2 中心復(fù)合設(shè)計試驗與結(jié)果

根據(jù)試驗結(jié)果，利用Design-Expert軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析及參數(shù)估計，得到二次多元回歸方程Y=-2.497+ 207.504X1+4.933X2+99.055X3-3.472X1X2-11.469X1X3-（r=0.948 0，P=0.000 7），方差分析結(jié)果見表3。由表可知，三個因素對魚精蛋白納米粒的包封率均有顯著性影響，而且藥物在乙醇中質(zhì)量濃度 （g/mL，X2）與乙醇與水體積比 （X3）的交互作用對納米粒的包封率影響也較大。

表3 方差分析

由回歸模型處理得到的三因素交互作用對納米粒包封率影響的三維曲面圖見，圖1。由圖可知，三種因素交互影響丹參酮ⅡA魚精蛋白納米粒的包封率，其中丹參酮ⅡA與魚精蛋白質(zhì)量比 （X1）越大，藥物在納米粒中的包封率越小，但當(dāng)X1極小時，藥物的包封率也隨之下降，納米粒的包封率受藥物在乙醇中質(zhì)量濃度 （g/mL，X2）和乙醇與水體積比 （X3）的交互影響較為顯著，并且存在最優(yōu)區(qū)間。

圖1 納米粒包封率與影響因素X1、X2和X3三維效應(yīng)面關(guān)系圖

2.4.2 模型預(yù)測與驗證 相同條件下，藥物包封率越高，說明制備過程中對藥物的利用率越大。由回歸方程處理得到的響應(yīng)面可知，最優(yōu)區(qū)域為曲面向心處。綜合考慮試驗操作的可行性，從該區(qū)域中預(yù)測納米粒制備的最佳處方工藝為丹參酮ⅡA與魚精蛋白質(zhì)量比0.25，藥物在乙醇中質(zhì)量濃度10 mg/mL、乙醇與水體積比1：1，模型預(yù)測包封率85.58%。采用上述條件制備丹參酮ⅡA魚精蛋白納米粒三批，測得藥物包封率分別為86.02%、85.74%、86.38%，平均包封率為86.05%，與預(yù)測值 （85.58%）接近。

2.5 納米粒的粒徑及形態(tài)表征分析 應(yīng)用粒度電位分析儀對最優(yōu)工藝下制備的丹參酮ⅡA魚精蛋白納米粒進(jìn)行粒徑、Zeta電位的測定，在覆有支持膜的銅網(wǎng)上滴加納米粒溶液2～3滴，干燥10min，透射電子顯微鏡觀察納米粒的形態(tài)和大小，結(jié)果見圖2。由圖可知，丹參酮ⅡA魚精蛋白納米粒外觀為球狀，粒徑為 （112.3±20.4）nm，多分散指數(shù)為0.023，Zeta電位為+（15±1.9）mV。

圖2 丹參酮ⅡA魚精蛋白納米粒的粒徑分布和透射電鏡圖

2.6 釋放度的測定 采用恒溫透析法測定藥物在磷酸鹽緩沖溶液 （pH為7.4）中的釋放度。分別精密稱取冷凍干燥的丹參酮IIA魚精蛋白納米粒和丹參酮IIA對照品適量，置于透析袋中，緊密封口，加到200 mL磷酸鹽緩沖液 （pH為7.4）中，（37±0.5）℃下水浴加熱，轉(zhuǎn)速為50 r/min。然后，在預(yù)設(shè)時間點(diǎn)取液2.5 mL，并立即補(bǔ)加等量同溫的釋放介質(zhì)，0.45μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液稀釋2倍，于270 nm波長處測定紫外吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算丹參酮IIA含有量，計算納米粒和藥物混懸液在不同時間的累積釋放百分率，結(jié)果見圖3。由圖可知，與丹參酮ⅡA混懸液相比，納米粒具有更好的緩釋作用，并且無明顯突釋效應(yīng)。

圖3 丹參酮ⅡA魚精蛋白納米粒在磷酸鹽緩沖溶液（pH為7.4）中的釋放度（n=3）

3 討論

魚精蛋白是一種堿性蛋白質(zhì)，主要在魚類成熟精子細(xì)胞核中作為和DNA結(jié)合的核精蛋白存在。研究報道，它可作為細(xì)胞穿膜肽攜帶比其分子量大的外源性疏水物質(zhì)，以能量依賴性的方式進(jìn)入細(xì)胞，并且無明顯細(xì)胞毒作用，因此可用于腫瘤藥物納米粒的載體材料或表面修飾［10］。本實驗設(shè)計了丹參酮ⅡA魚精蛋白納米粒，制備條件溫和、操作簡單，以期通過魚精蛋白的透膜作用來開發(fā)出一種適用于腫瘤治療的有應(yīng)用前景的納米藥物傳遞系統(tǒng)。

體外釋放試驗表明，在制備和干燥過程中，部分藥物可能吸附在納米粒表面，當(dāng)與釋放介質(zhì)接觸時，藥物迅速進(jìn)入介質(zhì)中，造成初始釋放曲線的突釋現(xiàn)象。隨著時間延長，魚精蛋白被不斷溶蝕，藥物通過擴(kuò)散，從納米粒內(nèi)部逐漸釋放，從而維持其緩慢長期釋放，而藥物粉末因不具有類似保護(hù)載體，致使藥物突釋現(xiàn)象明顯。

中心復(fù)合設(shè)計法利用多項式，近似地把交互因素與試驗結(jié)果的關(guān)系函數(shù)化，從而得到整個區(qū)域上因素的最佳組合和最優(yōu)響應(yīng)值［11-13］。選擇的三種影響因素為丹參酮ⅡA與魚精蛋白質(zhì)量比 （X1）、藥物在乙醇中質(zhì)量濃度 （g/mL，X2）、乙醇與水體積比 （X3），均是在單因素考察的基礎(chǔ)上所確立的，其影響水平主要取決于制備過程中體系藥物的濃度、藥物的成核速度以及載體魚精蛋白的包裹能力，由于影響因素X1和X3直接決定藥物的終濃度和終體積，所以具有更顯著的影響意義。本實驗中較優(yōu)處方的實測值與模型預(yù)測值接近，說明該試驗因素選擇的中心點(diǎn)符合試驗設(shè)計要求，所選取的因素為影響納米粒制劑的主要因素，盡管失擬項具有顯著性差異，模型擬合效果稍差，但模型中各因素的影響均較顯著，而影響水平不顯著，考慮到該優(yōu)化水平是基于單因素考察的結(jié)果而設(shè)定的，綜合分析各影響因素，其結(jié)果基本可信［14-15］。綜上所述，三種因素對納米粒的包封率均有顯著影響，并且具有交互作用，說明在處方和工藝篩選上應(yīng)用中心復(fù)合設(shè)計法具有良好的應(yīng)用價值。

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R944

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1001-1528（2015）11-2534-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.046

2015-02-11

馮 博（1989—），女，碩士，從事中西藥物新型給藥系統(tǒng)研究。Tel：13940536239，E-mail：lyyxfengbo@163.com

*通信作者：承 偉 （1958—），男，博士，教授，從事中西藥物新型給藥系統(tǒng)研究。Tel：13019810828，E-mail：cheng2553807@ 126.com