重癥監(jiān)護病房鮑曼不動桿菌耐藥性與分子流行病學研究

李永麗，陳藝升，汪雅萍，應(yīng)春妹

鮑曼不動桿菌是廣泛存在于自然界、醫(yī)院環(huán)境和人體皮膚的一類條件致病菌。近年來，隨著廣譜抗菌藥物的大量使用及各種侵襲性診療技術(shù)的應(yīng)用，該菌分離率逐年增加，且誘導大量耐藥菌株產(chǎn)生，已成為僅次于銅綠假單胞菌的另一個重要不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌，重癥監(jiān)護病房（ICU）是最容易定植、感染的科室之一［1］。此外，醫(yī)院環(huán)境污染在鮑曼不動桿菌播散流行中亦占很重要位置，對醫(yī)院環(huán)境采樣并對分離菌株進行同源性分析，能夠評估環(huán)境污染情況，快速準確地查找傳染源和傳播途徑［2］。本研究目的為探討神經(jīng)外科ICU 中分離鮑曼不動桿菌的耐藥特征，并分析其流行特征和可能的感染途徑，為治療和預防鮑曼不動桿菌醫(yī)院感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2012年7—10月上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院神經(jīng)外科ICU 鮑曼不動桿菌臨床分離株27株，剔除重復菌株。標本種類包括痰液、咽拭子、尿液、引流液。同期采用無菌棉拭子對ICU 醫(yī)護人員手，患者病床、桌面，呼吸機表面，房間門把手等部位進行環(huán)境污染調(diào)查采樣共214份，分離鮑曼不動桿菌28 株，其中包括分離于患者桌面17株，病床7株，呼吸機表面3株，門把手1株。所有菌株經(jīng)VITEK-2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定，并通過16SrRNA 測序證實。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.1.2 主要試劑 阿米卡星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、米諾環(huán)素、甲氧芐啶-磺胺甲口惡唑、美羅培南、哌拉西林、他唑巴坦、舒巴坦、亞胺培南等抗菌藥物（上海科佳藥檢器材公司），黏菌素和替加環(huán)素（上海雅鑒生物科技有限公司）；dNTP、Taq DNA 酶和蛋白酶K（大連TaKaRa公 司）；ApaI 限制性 內(nèi)切酶（Fermentas 公 司）；pulsed field certified agarose（美國Bio-Rad公司）；Tris、EDTA 等生化試劑（上海生工生物工程公司）。

1.1.3 主要儀器 全自動微生物分析系統(tǒng)（型號：VITEK-2 Compact，法國生物梅里埃公司）；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增儀（型號為：ABI 2700，美國生物公司）；瓊脂糖凝膠電泳儀（上海天能科技有限公司）、凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。脈沖場凝膠電泳儀（型號：CHEFMapperTM，美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細菌體外藥敏試驗 瓊脂稀釋法檢測55株鮑曼不動桿菌對16 種抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC），結(jié)果判定參照2011年美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）公布的標準［3］。

1.2.2 多位點序列分型（MLST）引物參照鮑曼不動桿菌的MIST 數(shù)據(jù)庫（http：／／pubmlst.org／abaumannii／），針對gltA，gyrB，gdhB，recA，cpn60，gpi和rpoD7個管家基因進行測序比對分析。PCR總反應(yīng)體系為25μL，其中10×緩沖液（含MgCl2）2.5μL，dNTPs（各2.5 mmol／L）混懸液2μL，DNA模板1μL，引物（10μmol／L）1μL，Taq 酶0.125μL，使用雙蒸餾水補足于25μL。反應(yīng)條件：94℃預變性5 min，然后94℃變性30 s，54℃復性30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物在含0.25 mg／L的溴化乙錠（EB）的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由上海生工生物工程技術(shù)公司進行雙向測序。

1.2.3 脈沖場凝膠電泳（PFGE）分型 將已培養(yǎng)過夜的純菌落，配成細菌懸浮液，采用瓊脂糖凝膠進行包被，在含有25μL蛋白酶K 的細胞裂解液中54℃水浴搖床4 h。充分洗滌，用限制性內(nèi)切酶ApaI 37℃酶切3 h。用0.5×TBE 緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠加熱溶解后冷卻至60℃，緩緩注入模具中，放置30 min。電泳條件設(shè)置：核酸片段30～600 kb，6 V／cm，脈沖時間5～20 s，14℃，電場角度120°，電泳時間為19 h。電泳結(jié)束后用0.25 mg／L 的EB 染色45 min，蒸餾水沖洗30 min后觀察結(jié)果。PFGE 結(jié)果判讀按Tenover等［4］推薦的方法判讀，酶切后圖譜完全一致定為同一型，有1～3條帶不同者為同一型的不同亞型，差異3個條帶以上者為另一型。

1.2.4 統(tǒng)計學處理 藥敏結(jié)果采用世界衛(wèi)生組織（WHO）提供的微生物統(tǒng)計軟件WHONET5.4進行統(tǒng)計分析。組內(nèi)比較采用SAS（9.0版）統(tǒng)計軟件卡方檢驗進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果

臨床分離27株鮑曼不動桿菌除對黏菌素和替加環(huán)素全部敏感外，對其余14 種抗菌藥物耐藥率高。其中，對米諾環(huán)素耐藥率稍低，其次為頭孢哌酮-舒巴坦和亞胺培南，對其他抗菌藥物的耐藥率均超過70%，對甲氧芐啶-磺胺甲口惡唑全部耐藥。環(huán)境分離28株鮑曼不動桿菌對抗菌藥物較敏感，見表1。

表1 55株鮑曼不動桿菌藥敏結(jié)果分析Table 1 Susceptibility testing results of 55 strains of Acinetobacter baumannii

2.2 MLST 基因分型結(jié)果

27株臨床分離鮑曼不動桿菌主要可分為5 個ST 型（ST208，1-3-3-2-2-97-3；ST368，1-3-3-2-2-140-3；ST191，1-3-3-2-2-94-3；ST195，1-3-3-2-2-96-3；ST540，1-3-3-2-2-160-3）與4個新ST 型。其中ST208是在神經(jīng)外科ICU 中分布最為廣泛的基因型，占到了菌株數(shù)的66.7%（18／27），其次是ST 540型有2 株，ST368、ST191、ST195 基因型 各1株。根據(jù)PubMLST 數(shù)據(jù)庫中已有的鮑曼不動桿菌序列型進行eBRUST 分析，發(fā)現(xiàn)ST208、ST368、ST191、ST195和ST540只有g(shù)pI等位基因位點不同，均屬于克隆復合體92（CC92）［5］，占所有臨床菌株的85.2%（24／27）。環(huán)境菌株中 有2 個ST 型（ST208 和ST229），其 中ST208 9 株，ST229 4 株，53.6%（15／28）的菌株至少有1個等位基因序列在數(shù)據(jù)庫中沒有對應(yīng)的基因序列，是新的ST型。

2.3 PFGE基因分型結(jié)果

27株臨床分離鮑曼不動桿菌PFGE 基因分型可分為5型，其中A 型23株（包括A1型15株，A2型7株，A3型1株），B型1株，D 型2株，E型1株。28株ICU 環(huán)境分離鮑曼不動桿菌主要分為9型，其中A 型15株（包括A1型7株，A2型2株，A3型6株），B型2株，C型1株，D 型2株，E型3株，F(xiàn)型2株，G、H、I型各1株（圖1、2）。臨床菌株與環(huán)境菌株不同基因分型結(jié)果比較見表2。

圖1 部分臨床菌株P(guān)FGE圖譜Figure 1 Pulsotypes identified by pulsed-field gel electrophoresis from clinical isolates of Acinetobacter baumannii

圖2 部分環(huán)境菌株P(guān)FGE圖譜Figure 2 Pulsotypes identified by pulsed-field gel electrophoresis from enviromental isolates of Acinetobacter baumannii

表2 臨床菌株和環(huán)境菌株不同方法基因分型結(jié)果Table 2 Molecular typing results of clinical and environmental isolates of Acinetobacter baumannii

3 討論

鮑曼不動桿菌為不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌，系條件致病菌，生存能力強，定植率高，可在醫(yī)院環(huán)境中長期生存，極易造成暴發(fā)流行［6］。鮑曼不動桿菌臨床分離率逐漸增高，已成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一。ICU 患者往往患有多種基礎(chǔ)疾病，免疫力低下，加上臨床各種侵襲性操作等危險因素，更易于鮑曼不動桿菌定植感染。有研究顯示，ICU 中該菌的感染暴發(fā)與其環(huán)境傳播密切相關(guān)［7］。因此，對ICU環(huán)境中鮑曼不動桿菌進行分子流行病學監(jiān)測，對于控制醫(yī)院感染暴發(fā)，及時準確查找傳染源和傳播途徑具有重要意義。

隨著抗菌藥物的大量應(yīng)用，抗菌藥物選擇性壓力導致鮑曼不動桿菌耐藥株逐年遞增。本研究臨床分離鮑曼不動桿菌除對黏菌素和替加環(huán)素敏感外，對常用抗菌藥物耐藥率高，對氨基糖苷類，第三、四代頭孢菌素耐藥率高達80%以上，對頭孢哌酮-舒巴坦和亞胺培南的耐藥率分別為51.9%、59.3%，對米諾環(huán)素的耐藥率為25.9%。環(huán)境分離28株鮑曼不動桿菌對頭孢哌酮-舒巴坦、亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為3.6%、7.1%、3.6%，對米諾環(huán)素、哌拉西林-他唑巴坦耐藥率均為10.7%，對其他抗菌藥物耐藥率也在20%～50%。

細菌播散分布具有時間和地區(qū)間的差異，對一定時間內(nèi)同一病區(qū)分離的鮑曼不動桿菌進行基因分型，分析其同源性關(guān)系，對醫(yī)院感染預防與控制具有重要意義［8］。目前對病原菌同源性分析方法有PCR 指紋圖譜分型、核糖體分型、PFGE 分型及MLST 分型等［9］。

本實驗采用MLST 技術(shù)對臨床和環(huán)境分離鮑曼不動桿菌進行型別分析。研究結(jié)果顯示，27株臨床分離菌株中ST208型18株（66.7%），是我院神經(jīng)外科ICU 病區(qū)的主要流行型別，其次是ST540型2株，ST368、ST191、ST195基因型各1株。另有4株基因型與MLST 數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有基因型不符，是新的基因型別。eBURST 分析顯示ST208、ST368、ST191、ST195 和ST540 型均屬 于CC92 克隆群。28株環(huán)境分離株中，ST208有9株，ST229有4株。綜上，神經(jīng)外科ICU 存在鮑曼不動桿菌感染傳播，環(huán)境中病床、桌面，呼吸機表面，門把手等部位均有鮑曼不動桿菌污染，且具有相同型別。醫(yī)院應(yīng)加強醫(yī)護人員的消毒意識，對環(huán)境中物體表面嚴格消毒，以防止醫(yī)院感染暴發(fā)流行。

PFGE分型法重復性好、分辨率高、結(jié)果穩(wěn)定、易于標準化，是細菌分子生物學分型技術(shù)“金標準”［10］，能在細菌基因組龐大的情況下，盡可能反映更多的變異信息［11］。臨床分離27株鮑曼不動桿菌可分為A、B、D、E 型，其中A 型23株，占85.2%；而同期收集28株環(huán)境分離鮑曼不動桿菌分為9型，A 型15株，占53.6%，A 型為主要克隆株。A 型克隆株的高檢出率進一步說明臨床分離株與環(huán)境分離株有密切相關(guān)性。不同基因分型技術(shù)結(jié)果顯示，PFGE分型A 型菌株對應(yīng)了MLST 的CC92 克隆群，同時環(huán)境物體表面也分布有鮑曼不動桿菌，說明此型克隆株存在科室內(nèi)傳播可能性。

綜上所述，本研究中鮑曼不動桿菌對臨床常用抗菌藥物耐藥率高，對米諾環(huán)素耐藥率稍低，其次為頭孢哌酮-舒巴坦和亞胺培南，臨床應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果選擇合適抗菌藥物。在PFGE 分型中，A 型克隆株為臨床菌株和環(huán)境菌株的主要流行株，對應(yīng)了MLST 的CC92克隆群，菌株間具有較高同源性，科室內(nèi)存在交叉感染的可能性，需采取切實、有效措施及時進行干預。

［1］Pendleton JN，Gorman SP，Gilmore BF.Clinical relevance of the ESKAPE pathogens［J］.Expert Rev Anti Infect Ther，2013，11（3）：297-308.

［2］Durante-Mangoni E，Zarrilli R.Global spread of drugresistant Acinetobacter baumanii：molecular epidemiology and management of antimicrobial resistance ［J］.Future Microbiol，2011，6（4）：407-422.

［3］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial Susceptibility testing［S］.19th informational supplement，2011，M100-S21.

［4］Tenover FC，Arbeit RD，Geering RV，et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsedfield gel electrophoresis：criteria for bacterial strain typing［J］.J Clin Microbiol，1995，33（9）：2233-2239.

［5］Fu Y，Zhou J，Zhou H，et al.Wide dissemination of OXA-23-producing carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clonal complex22in multiple cities of China［J］.J Antimicrob Chemother，2010，65（4）：644-650.

［6］Torres HA，Vazqueez EG，Yague G，et al.Multidrug resistant Acinetobacter baumanii：clinical update and new highlights［J］.Rev Esp Quimioter，2010，23（1）：12-19.

［7］Thom KA，Johnsn JK，Lee MS，et al.Environmental contamination because of multidrug-resistant Acinetobacter baumanii surrounding colonized or infected patients［J］.Am J Infect Control，2011，39（9）：711-715.

［8］Karah N，Sundsfjord A，Towner K，et al.Insights into the global molecular epidemiology of carbapenem non-susceptible clones of Acinetobacter baumanii［J］.Drug Resist Updat，2012，15（4）：237-247.

［9］王璐，任微，褚美玲，等.耐碳青霉烯的多重耐藥鮑曼不動桿菌分子流行病學研究［J］.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2010，25（1）：87-89.

［10］Singh A，Goering RV，Simjee S，et al.Application of molecular techniques to the study of hospital infection［J］.Clin Microbiol Rev，2006，19（3）：512-530.

［11］Durmaz R，Otlu B，Koksal F，et al.The optimization of a rapid pulsed-field gel electrophoresis protocol for the typing of Acinetobacter baumanii，Escherichia coli and Klebsiellaspp.［J］.Jpn J Infect Dis，2009，62（5）：372-377.