lpxA／lpxC／lpxD 基因突變致鮑曼不動桿菌耐多黏菌素作用機(jī)制

張文利，Joan-Miquel Balada-Llasat，Vijay Pancholi ，Bhowmik Aurosree，Bhavani Gopalakrishnan，Preeti Pancholi

鮑曼不動桿菌是醫(yī)院獲得性菌血癥、重癥肺炎、腦膜炎、尿路感染、血流和身體其他部位感染的主要病原菌［1］。近年來，多重耐藥鮑曼不動桿菌（MDRAB）感染的急劇增加是一個非常棘手的問題［2-4］。由于抗生素選擇性壓力導(dǎo)致MDR-AB的出現(xiàn)［5］，抗菌藥物普遍耐藥致使MDR-AB 的治療面臨極大挑戰(zhàn)。

多黏菌素往往是最后可以選擇用于治療MDR銅綠假單胞菌和不動桿菌屬的抗生素［6-7］。多黏菌素是環(huán)狀多肽的多聚陽離子抗生素，依靠與細(xì)菌外膜脂多糖上陰離子相互作用，使膜溶解［8］。

耐多黏菌素現(xiàn)象罕見，但鮑曼不動桿菌耐多黏菌素已被報道［9-11］。而多黏菌素耐藥鮑曼不動桿菌的出現(xiàn)［12］已成為一個令人越來越擔(dān)憂的問題。

腸道沙門菌和銅綠假單胞菌對多黏菌素的耐藥機(jī)制主要包括細(xì)菌外膜脂多糖（LPS）上脂質(zhì)A 的修飾、缺失或完全喪失，從而減少或去除與多黏菌素相互作用的負(fù)電荷［13-14］。此外，負(fù)責(zé)脂質(zhì)A 生物合成的lpxA／lpxD／lpxC 的基因突變［15-16］會導(dǎo)致耐多黏菌素。鮑曼不動桿菌對多黏菌素耐藥的機(jī)制不斷 有文獻(xiàn)報道［17-18］。我們的 研究表明，lpxA、lpxC和lpxD 基因的突變會導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)A 生物合成的成分改變，使得MDR-AB對多黏菌素耐藥性增強(qiáng)。了解多黏菌素耐藥機(jī)制可以提供研發(fā)治療MDR-AB感染新藥的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 分離自俄亥俄州立大學(xué)Wexner醫(yī)學(xué)中心臨床患者的25 株鮑曼不動桿菌用Micro Scan（Siemens Healthcare Diagnostics，IL，USA）鑒定，藥敏試驗采用Micro Scan和（或）E試驗法（bioMérieux，Marcy l′Etoile，F(xiàn)rance）。其中18株是耐多黏菌素株（Col-R）（R1、R2、R4、R5、R6、R7、R9、R10、R11、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R22、R23），3株是多黏菌素依賴株（Col-D）（R3D、R12D、R13D）［19］，4株是多黏菌素敏感株（Col-S）（S1、S2、S3、S5）。這些初選的Col-R 和Col-D 菌株是基于E 試驗測試結(jié)果最低抑菌濃度（MIC）≥4 mg／L 被選出的。質(zhì)控菌株為鮑曼不動桿菌ATCC19606。

1.1.2 培養(yǎng)基和抗菌藥物 藥敏試驗用MH 瓊脂培養(yǎng)基?？咕幬锒囵ぞ谽 試驗藥敏條為AB Biodisk公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 抗生素的MIC測定 根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）指南［20］，用Micro Scan和E試驗法檢測抗生素的MIC 值。用E 試驗法檢測25株臨床分離鮑曼不動桿菌對多黏菌素的MIC值，多黏菌素耐藥被定義為MIC≥4 mg／L。銅綠假單胞菌ATCC27853和鮑曼不動桿菌ATCC19606（多黏菌素MIC為0.125 mg／L）作為對照。

1.2.2 薄層透射電子顯微鏡（TEM）觀察細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu) 6 株鮑曼不動桿菌（S1、S2、R5、R9、R3D、R13D）接種在新鮮的5 mL 無任何抗菌藥物TSB培養(yǎng)基和含有10 mg／L 多黏菌素TSB中生長（Teknova，F(xiàn)isher Scientific，USA），直到光密度在600 nm（A600）時為1.0。隨后細(xì)菌在室溫下3 100 轉(zhuǎn)／min離心10 min。菌液用1×PBS緩沖液洗2次后混懸在1 mL含4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的緩沖液中?；鞈乙涸儆铆傊前裰瞥杀忧衅笥枚砗ザ碇萘⒋髮W(xué)Wexner醫(yī)學(xué)中心的FEI Tecnai TEM（The FEI TecnaiTM，OR，USA）和成像設(shè)備（CMIF）觀察細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜儀（GC-MS）對細(xì)胞脂肪酸進(jìn)行分析 對數(shù)生長期的鮑曼不動桿菌用1 mL PBS洗后離心去除上清液，細(xì)菌沉淀稱重后提交到俄亥俄州立大學(xué) Wexner 醫(yī)學(xué)中心化學(xué)儀器中心（CCIC）用GC-MS（Finnigan Trace，TX，USA）的質(zhì)譜及蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析細(xì)胞脂肪酸。樣品脂肪酸各組分含量與Sherlock模式識別軟件的存儲數(shù)據(jù)庫對比后得到。

1.2.4 脂質(zhì)A 生物合成基因突變的檢測 用基因組DNA 提取試劑盒（UltraClean Mcrobial DNA Isolation Kit，MO BIO Laboratories，Inc.）提取鮑曼不動桿菌基因組DNA，通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增脂質(zhì)A 的生物合成基因lpxA、lpxC 和lpxD，3種引物序列見表1。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物由西雅圖生物研究所進(jìn)行基因測序并由序列分析儀進(jìn)行分析（Seattle Biomedical Research Institute，USA）。用美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／）中BLASTN 程序比對同源序列。

表1 檢測基因突變所用的PCR 引物Table 1 Primers used in PCR detection of gene mutations

2 結(jié)果

2.1 多黏菌素MIC值

用E 試驗檢 測25 株MDR-AB 臨床分 離株對多黏菌素的MIC 值。18 株Col-R 菌和3株Col-D菌對多黏菌素MIC的范圍為8～256 mg／L（圖1、表2）。

2.2 Col-R 和Col-D 株的細(xì)胞膜改變

應(yīng)用TEM 觀察了2株Col-S，2 株Col-R 和2株Col-D 共6株鮑曼不動桿菌的內(nèi)、外膜結(jié)構(gòu)，比較Col-S株、Col-R 株和Col-D 株細(xì)胞膜之間的成像差異。TEM 顯示2株Col-S菌株具有完整、厚和均勻的內(nèi)、外膜。2 株Col-R 菌株的外側(cè)和內(nèi)側(cè)膜的完整性破壞，失去了膜的均勻性，多數(shù)似串珠樣，甚至有些膜還失去了一些外周胞質(zhì)空間。2株Col-D 菌株的外膜和內(nèi)膜出現(xiàn)分叉，喪失完整性，外周胞質(zhì)空間缺乏均一性（圖2）。

圖1 Col-R和Col-D鮑曼不動桿菌Figure 1 Col-R and Col-D A.baumannii strains

表2 鮑曼不動桿菌不同臨床株對多黏菌素的MIC值Table 2 Minimum inhibitory concentrations of colistin against different strains of Acinetobacter baumannii

2.3 脂質(zhì)A 的脂肪酸成分分析

我們用GC-MS 法定量分析脂肪酸組成，發(fā)現(xiàn)Col-R 菌株和Col-D 菌株的脂肪酸組成成分改變與鮑曼不動桿菌脂質(zhì)A 合成缺乏或喪失相關(guān)（圖3）。與Col-S組相比，Col-R 組和Col-D 組菌株脂質(zhì)正常成分的合成降低并有錯誤成分合成，特別是在低碳鏈上總脂質(zhì)組分中的脂肪酸里缺少了乙醇成分，還有許多未確定的脂肪酸峰也出現(xiàn)在Col-R 組和Col-D 組菌株的脂質(zhì)合成中。

圖2 鮑曼不動桿菌細(xì)胞膜TEM 觀察結(jié)果Figure 2 Images obtained by transmission electron microscopy of A.baumannii

圖3 GC-MS數(shù)據(jù)分析Figure 3 Gas chromatography-mass spectrometry data analysis

2.4 Col-R 和Col-D 菌株基因突變分析

對2株Col-S、18 株Col-R 和3 株Col-D 鮑 曼不動桿菌lpxA、lpxC 和lpxD 基因序列分析發(fā)現(xiàn)，與標(biāo)準(zhǔn)株ATCC19606相比，Col-R 和Col-D 菌株中都有部分基因發(fā)生了突變，突變范圍從單點(diǎn)突變直至大片段缺失（表3）。在lpxA 基因，R3D 有11bp核苷酸缺失導(dǎo)致23位點(diǎn)纈氨酸（V）之后的氨基酸移碼。R12D 有一個核苷酸的插入突變導(dǎo)致242位點(diǎn)后氨基酸錯譯。Col-S、ATCC19606 與其他Col-R 菌株之間無差異。在lpxC 基因，分別有2 個核苷酸的替換導(dǎo)致氨基酸的改變和1個插入突變導(dǎo)致氨基酸錯譯。同樣，lpxD 基因分別在14 株Col-R中和3株Col-D 中有3個核苷酸的替換和1株Col-R 中1個堿基刪除導(dǎo)致氨基酸移碼。

表3 多黏菌素耐藥鮑曼不動桿菌脂質(zhì)A 生物合成基因突變Table 3 Mutations identified in the lipid A biosynthesis genes of colistin-resistant A.baumannii

3 討論

本研究收集的所有多黏菌素耐藥鮑曼不動桿菌株均來自臨床感染患者M(jìn)DR分離株，其中還發(fā)現(xiàn)了3株多黏菌素依賴株（Col-D）［19］。作為一種老藥，多黏菌素重新用于臨床治療MDR-AB的感染。在治療過程中多黏菌素耐藥性以及體外黏菌素或多黏菌素依賴性已被發(fā)現(xiàn)和報道［19，21］。多黏菌素E試驗測試顯示，所有這3株Col-D菌株產(chǎn)生的MIC均超過256 mg／L，其他Col-R 菌株的MIC 范圍分別從8～256 mg／L不等。

為了評價鮑曼不動桿菌對黏菌素耐藥機(jī)制，我們將25株臨床感染鮑曼不動桿菌菌株分為3組：4株Col-S為一組，18株Col-R 為一組，3株Col-D 為一組。幾種多黏菌素耐藥機(jī)制的研究數(shù)據(jù)顯示，Col-S與Col-R、Col-D 之間均存在明顯差異。

多黏菌素耐藥最常見的機(jī)制就是多黏菌素作用的第一個位點(diǎn)——細(xì)胞膜構(gòu)成成分LPS 的修改［22-24］。我們通 過TEM 觀察了2 株Col-S，2 株Col-R 和2 株Col-D 菌 株，發(fā)現(xiàn)在Col-S 和Col-R、Col-D 之間有一些令人關(guān)注的差異。例如，我們發(fā)現(xiàn)2株Col-S菌株有著完整、厚和均勻的內(nèi)膜與外膜，然而，2株Col-R 菌株和2株Col-D 內(nèi)外膜的完整性均被破壞，失去了均勻性、出現(xiàn)分叉的膜、甚至大多數(shù)還出現(xiàn)串珠 狀膜，所有Col-R 和Col-D 菌體細(xì)胞內(nèi)外膜間都失去了部分間隙。這些Col-R 和Col-D 株內(nèi)外細(xì)胞膜合成被干擾和再加工，改變了細(xì)胞膜通透性和抗生素結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果對多黏菌素耐藥性增強(qiáng)［22，25］。

鮑曼不動桿菌脂肪酸成分顯示3-羥基十四烷酸（3-hydroxytetradecanoic acid，3-C14OH）、3-羥基月桂酸（3-hydroxydodecanoic acid，3-C12OH）、2-羥基十四烷酸（2-hydroxytetradecanoic acid，2-C14OH）和月桂酸（dodecanoic acid，C12）、棕櫚酸（hexadecanoic acid，C16）、硬脂酸（octadecanoic acid，C18）是脂質(zhì)A 的重要化學(xué)成分［24］。為了判析臨床Col-R和Col-D 菌株不完整的細(xì)胞膜是否是源于脂肪酸成分的定量改變，我們通過GC-MS比較了Col-S株與Col-R、Col-D 菌株全部脂肪酸的組成，確切的數(shù)據(jù)顯示，長碳鏈飽和脂肪酸關(guān)鍵成分，包括C12、C16、C18有明顯的數(shù)量改變。從Col-S株的平均值分別與Col-R株和Col-D株的值比較，C12所占比重依次降低，但C16、C18所占比重依次增高；在乙醇側(cè)鏈和不飽和脂肪酸成分的生物合成上也有明顯區(qū)別，多種成分生物合成減少，但其他成分增加，如一些多黏菌素耐藥和依賴的菌株顯示低碳鏈脂肪酸上幾乎沒有乙醇側(cè)鏈，未知脂肪酸的生物合成有降低趨勢。GC-MS檢測證實這些多黏菌素耐藥和依賴的菌株增加了對長鏈脂肪酸、不飽和脂肪酸的修改以及丟失了許多不明脂肪酸成分。在3組鮑曼不動桿菌詳細(xì)的脂肪酸組成比較中，認(rèn)識到Col-R和Col-D菌株組成成分可隨多黏菌素暴露濃度改變而有巨大改變這一點(diǎn)是非常重要的。

在細(xì)菌脂質(zhì)A 生物合成途徑中，lpxA、lpxC 和lpxD 基因參與了關(guān)鍵的前三步——LPS的疏水性錨合成［22-23］，而多黏菌素發(fā)揮作用的靶位是細(xì)菌外膜的脂質(zhì)雙分子層，即抗菌藥物帶正電的肽與細(xì)菌帶負(fù)電的LPS內(nèi)毒素成分脂質(zhì)A 間的靜電相互作用。對于耐藥菌株來說，脂質(zhì)A 發(fā)生的各種修飾可以減少或消除負(fù)電荷從而影響與抗菌藥物的靜電相互作用。脂質(zhì)A 的修飾也許并不影響細(xì)菌基礎(chǔ)生長，但卻可以加強(qiáng)病原體的滲透屏障和影響毒力［22，25］。為了觀 察lpxA、lpxC 和lpxD 基因突 變對脂質(zhì)A 生物合成的影響，用Col-S 和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606做對照，我們運(yùn)用測序方法分析了Col-R 和Col-D 臨床鮑曼株中這3種基因的突變情況。在18株Col-R 和3株Col-D 的3種基因里發(fā)現(xiàn)了一定數(shù)量的不同基因突變，范圍從單點(diǎn)突變到大片段核苷酸缺失。本研究中，3株多黏菌素依賴株中的1株——R3D的lpxA 基因從位點(diǎn)68開始有11個核苷酸被刪除導(dǎo)致lpxA 翻譯成氨基酸過程中位點(diǎn)23的纈氨酸之后翻譯過早終止，結(jié)果，脂質(zhì)A 不能生成從而使LPS缺損，不僅使臨床菌株對多黏菌素產(chǎn)生了耐藥而且還產(chǎn)生了依賴，這一證據(jù)已通過TEM 試驗圖像和GC-MS脂肪酸數(shù)值得到確認(rèn)。這一發(fā)現(xiàn)表明，對多黏菌素產(chǎn)生耐藥性的鮑曼不動桿菌臨床株存在lpxA 的突變和LPS 的缺失。另一株Col-D（R12D）在lpxC 基因上有3個核苷酸的插入導(dǎo)致脂質(zhì)A 生物合成第二步的氨基酸錯譯從而不能產(chǎn)生完整的脂質(zhì)A；其他的突變是屬于單點(diǎn)突變導(dǎo)致單個氨基酸的改變。這些基因突變中，發(fā)生數(shù)量最多的是多黏菌素耐藥株和依賴株（10株Col-R和2株Col-D）在lpxD 基因上發(fā)生堿基A 替代G 導(dǎo)致谷氨酸變成賴氨酸（E138K）。序列分析表明，幾乎所有被分析的Col-R和Col-D菌株都有l(wèi)pxA、lpxC 或lpxD 基因的1個或多個突變。

總之，本研究數(shù)據(jù)清晰地顯示，臨床Col-R 和Col-D鮑曼不動桿菌對多黏菌素耐藥的主要機(jī)制是由于脂質(zhì)A 生物合成涉及的前3個關(guān)鍵合成基因——脂質(zhì)A 生物合成基因突變導(dǎo)致LPS合成缺失所致。隨著多黏菌素在臨床上的應(yīng)用越來越多，我們擔(dān)心對多黏菌素的耐藥性會由于多黏菌素的使用增加而被廣泛傳播。因此，需要對臨床鮑曼不動桿菌的多黏菌素耐藥機(jī)制進(jìn)一步研究，為臨床有效控制耐藥菌克隆株傳播及治療新藥的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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