微小RNA-146a-5p在新生隱球菌、脂多糖誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中表達(dá)的對比分析

陳 歡，陳 宏，廖寧馨，陳江漢

中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌感染中以隱球菌性腦膜炎（隱腦）最為常見，其致病菌為新生隱球菌和格特隱球菌，我國以新生隱球菌感染為主，格特隱球菌感染少見。流行病學(xué)顯示我國的大部分隱球菌病患者發(fā)生在“免疫功能正?！钡娜巳?，患有人類免疫缺陷綜合征（AIDS）／人類免疫缺陷病毒感染的患者僅占六分之一［1］，這類“免疫功能正常”隱腦患者臨床治療困難，治療不良反應(yīng)大，耗時長，病死率高，預(yù)后較差［2］。隨著高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療的應(yīng)用，艾滋病相關(guān)隱腦的發(fā)病率已顯著下降，而非艾滋病相關(guān)隱腦的發(fā)病率卻呈逐年上升趨勢［3］。探索“免疫功能正?！彪[腦患者內(nèi)在的發(fā)病機(jī)制，對這類患者的臨床治療顯得尤為重要。我們通過觀察并分析微小RNA-146a-5p（miR-146a-5p）在新生隱球菌、脂多糖（LPS）刺激THP-1細(xì)胞中表達(dá)的差異，為探討miR-146a-5p在新生隱球菌所致隱腦中的調(diào)控作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人單核細(xì)胞系THP-1購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，新生隱球菌（標(biāo)準(zhǔn)株WM148）來源于上海長征醫(yī)院皮膚真菌保藏實驗室，LPS 購自美國Sigma 公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco 公司，人腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6購于美國ebioscience；TRIzol購于美國Invitrogen；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan Universal PCR Master Mix、Taq-Man MicroRNA Assays購于大連TaKaRa公司）；氯仿、異丙醇及無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人單核細(xì)胞系THP-1培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、100 u／mL 青霉素、100 u／mL 鏈霉素，細(xì)胞置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每2～3天更換培養(yǎng)液1次，細(xì)胞密度適度時常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞處理及分組 將THP-1細(xì)胞按1×106個／mL接種于六孔板，每孔2 mL。實驗分為2組：①新生隱球菌誘導(dǎo)組，按照數(shù)量1∶1比例將滅活新生隱球菌與THP-1細(xì)胞同培養(yǎng)；②LPS刺激組：培養(yǎng)基中加入LPS（終質(zhì)量濃度1 mg／L）。分別培養(yǎng)0（空白對照）、3、6、9、12 h后，離心收集各時點培養(yǎng)上清液和沉淀細(xì)胞，于-80℃保存，用于酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測和TRIzol法提取總RNA。

1.2.3 實時熒 光定量 聚合酶 鏈反應(yīng)（Real-time PCR）測定miR-146a-5p的表達(dá) ①總RNA 抽提。采用TRIzol法提取沉淀細(xì)胞中的總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 質(zhì)量，紫外分光光度計測定總RNA 的水平；②反轉(zhuǎn)錄。采用TaKaRa公司Prime ScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）特異miRNA 的莖環(huán)引物。所有操作均在冰上完成。10μL 的反應(yīng)體系包括：2μL 5×Prime Script Buffer，0.5μL Prime Script RT Enzyme mixⅠ，0.5μL Gene specific primer，free water組成的master mix。反應(yīng)條件：42℃15 min，85℃5 s；4℃；③Real-time PCR。采用SYBR?Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）檢測試劑盒。20μL的反應(yīng)體系包括：10μL SYBR?Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×），0.8μL的PCR Forward Primer（10 μmol／L），0.8 μL 的PCR Reverse Primer（10μmol／L），2μL DNA 模板（＜100 ng），2μL dH2O（滅菌蒸餾水）。在ABI7300定量PCR儀上擴(kuò)增和檢測，反應(yīng)條件：95℃30 s，40個擴(kuò)增循環(huán)（95℃5 s，60℃30 s）。選取使用U6作為內(nèi)參照，同時進(jìn)行PCR，獲得Ct值后，應(yīng)用比較Ct法進(jìn)行相對定量，miR-146a-5p 的相對 表達(dá)量采用2-ΔΔCt計 算。PCR引物由上海生工生物有限公司合成，見表1。

1.2.4 ELISA 檢測培養(yǎng)上清液中的TNF-α、IL-6含量 分別按照美國Ebioscience公司的TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒使用說明書步驟進(jìn)行操作，于450 nm 處測量吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品光密度值，對應(yīng)相應(yīng)稀釋度，以線性回歸方程計算相應(yīng)培養(yǎng)液細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的水平。

1.2.5 統(tǒng)計方法 所有的統(tǒng)計處理均采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-146a-5p表達(dá)

新生隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞，3、6、9、12 h后，細(xì)胞中miR-146a-5p較0h組明顯升高，3 h達(dá)到最高值，隨后逐漸下降（P＜0.05）。LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞3、6、9、12 h后，細(xì)胞中表達(dá)miR-146a-5p逐漸升高，12 h達(dá)到最高值；與0h組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 TNF-a、IL-6表達(dá)

新生隱球菌誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞，3、6、9、12 h 后上清液中TNF-α 的表達(dá)逐漸升高，12 h 達(dá)到最高值，與0h比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞3、6、9、12 h上清液中TNF-α 的表達(dá)3 h后一直處于峰值，相對0h差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2-1。

新生隱球菌誘 導(dǎo)THP-1 細(xì)胞以 后，IL-6 的 表達(dá)各時間點變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在LPS誘導(dǎo)后，3、6、9、12 h上清液中IL-6的表達(dá)逐漸增加，12 h達(dá)到最高值，與0h組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2-2。

表1 Real-time PCR引物信息表Table 1 Primers used in real-time polymerase chain reaction

圖1 miR-146a-5p在新生隱球菌、LPS不同誘導(dǎo)時間THP-1細(xì)胞中表達(dá)水平Figure 1 Expression of miR-146a-5p in THP-1 cells at different time points following stimulation with Cryptococcus neoformans or lipopolysaccharide

圖2-1 TNF-a在新生隱球菌、LPS不同誘導(dǎo)時間THP-1細(xì)胞中表達(dá)水平Figure 2 -1 Expression of TNF-αin THP-1 cells at different time points following stimulation with Cryptococcus neoformans or lipopolysaccharide

圖2-2 IL-6在新生隱球菌、LPS不同誘導(dǎo)時間THP-1細(xì)胞中表達(dá)水平Figure 2 -2 Expression of IL-6 in THP-1 cells at different time points following stimulation with Cryptococcus neoformans or lipopolysaccharide

3 討論

來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞，是機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線，同時其介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)還調(diào)控后續(xù)的適應(yīng)性免疫的程度和類型，在抗感染免疫反應(yīng)中起重要作用。研究表明，巨噬細(xì)胞等吞噬細(xì)胞在抗真菌感染的過程中具有重要作用，在隱球菌免疫逃逸的過程中也發(fā)揮重要影響［4-5］。經(jīng)研究，白血病患者的單核細(xì)胞（THP-1）具有單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能和生理學(xué)特性，被廣泛用于毒理學(xué)、免疫學(xué)和動脈粥樣硬化等研究領(lǐng)域［6］，因此，本研究將其作為研究對象。

miRNA 是在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一組非編碼小RNA 分子，廣泛存在于病毒、線蟲、植物及動物體內(nèi)。miRNA 表達(dá)具有時空特異性，在生物體生長、發(fā)育和功能表達(dá)過程中發(fā)揮十分重要的作用，且能調(diào)控許多疾病相關(guān)基因的表達(dá)［7］。miR-146a作為miRNA 的一種，在調(diào)節(jié)固有免疫、炎性反應(yīng)、病毒感染以及一些人類疾病中都發(fā)揮著重要的作用。即這些疾病的發(fā)病機(jī)制可能與miR-146a表達(dá)的變化相關(guān)［8-10］。

LPS為革蘭陰性細(xì)菌外壁層中的主要成分，也是全身炎性反應(yīng)的重要觸發(fā)劑，可以與體內(nèi)多種蛋白結(jié)合，引起各種炎性效應(yīng)。它可以通過單核巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體4（TLR4）來活化核因子κB（NFκB），從而誘導(dǎo)大量包括TNF-α在內(nèi)的前炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的表達(dá)［11］。Taganov 等［12］用LPS刺激人單核細(xì)胞系THP-1 后，用芯片技術(shù)檢測了200 個成熟miRNA 的表達(dá)，發(fā) 現(xiàn)3 個miRNA（miR-132，miR-146a，miR-155）表達(dá)水平升高。進(jìn)一步研究miR-146a對其他TLR 配體和一些細(xì)胞因子刺激后的反應(yīng)，結(jié)果顯示，TLR2、TLR4 和TLR5的配體可以明顯刺激miR-146a表達(dá)上調(diào)。

我們通過研究miR-146a-5p 在新生隱球菌及LPS分別誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞炎性反應(yīng)中的表達(dá)差異，同時對比分析炎性因子的變化情況，初步探討miR-146a-5p在新生隱球菌所致隱腦中的調(diào)控作用及機(jī)制。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新生隱球菌刺激THP-1細(xì)胞后，miR-146a-5p的表達(dá)3 h達(dá)到峰值，LPS刺激后miR-146a-5p表達(dá)逐步升高，在12 h測量時間點達(dá)到高峰。我們推測可能與滅活的新生隱球菌含有多種免疫細(xì)胞識別的主要靶分子病原相關(guān)分子模式（PAMPs），被與之相對應(yīng)的受體——模式識別受體（RRPs）識別，迅速啟動免疫應(yīng)答，同時也啟動miRNA 調(diào)控基因的表達(dá)有關(guān)。

不同研究還發(fā)現(xiàn)，刺激THP-1細(xì)胞之后，新生隱球菌誘導(dǎo)組TNF-α表達(dá)逐步升高，IL-6無明顯表達(dá)（P＞0.05）；LPS誘導(dǎo)組TNF-α在3 h的測量時間點達(dá)到峰值，與Wong 等［11］的研究結(jié)果一致，IL-6的表達(dá)逐步升高，在12 h 測量時間點達(dá)到峰值，與Ren等［13］的研究結(jié)果相符。結(jié)果表明，新生隱球菌刺激THP-1細(xì)胞之后，炎性因子的表達(dá)量和表達(dá)規(guī)律與LPS誘導(dǎo)組有明顯差別。從miR-146a-5p的表達(dá)來看，新生隱球菌誘導(dǎo)后，miR-146a-5p表達(dá)迅速增高，相應(yīng)炎性因子TNF-α表達(dá)緩慢、IL-6的表達(dá)不明顯；LPS誘導(dǎo)后，miR-146a-5p表達(dá)緩慢增高，對相應(yīng)的炎性因子TNF-α、IL-6 的影響逐步表現(xiàn)出來。

綜上所述，miR-146a在新生隱球菌和LPS 誘導(dǎo)單核細(xì)胞炎性反應(yīng)中都發(fā)揮重要的作用，miR-146a的各種病原菌誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控作用得到進(jìn)一步證實。因此，本實驗表明：新生隱球菌誘導(dǎo)單核細(xì)胞的炎性反應(yīng)機(jī)制與LPS 不同，miR-146a在調(diào)控過程中具有重要作用，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

［1］Yuchong C，F(xiàn)ubin C，Jianghan C，et al.Cryptococcosis in China（1985-2010）：review of cases from Chinese database［J］.Mycopathologia，2012，173（5-6）：329-335.

［2］Chen YY，Lai CH.Nationwide population-basedepidemiologic study of cryptococcal meningitis in Taiwan［J］.Neuroepidemiology，2011，36（2）：79-84.

［3］Lui G，Lee N，Ip M，et al.Cryptococcosis in apparently immunocompetent patients［J］.QJM，2006，99（3）：143-151.

［4］Charlier C，Nielsen K，Daou S，et al.Evidence of a role for monocytes in dissemination and brain invasion by Cryptococcus neoformans［J］.Infect Immun，2009，77（1）：120-127.

［5］Balloy V，Chignard M.The innate immune response to Aspergillus fumigatus［J］.Microbes Infect，2009，11（12）：919-927.

［6］Auwerx J.The human leukemia cell line，THP-1：a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation［J］.Experientia，1991，47（1）：22-31.

［7］Lee HM，Nguyen DT，Lu LF.Progress and challenge of microRNA research in immunity［J］.Front Genet，2014，5：178.

［8］Silvestri P，Di Russo C，Rigattieri S，et al.MicroRNAs and ischemic heart disease：towards a better comprehension of pathogenesis，new diagnostic tools and new therapeutic targets［J］.Recent Pat Cardiovasc Drug Discov，2009，4（2）：109-118.

［9］Dai R，Phillips RA，Zhang Y，et al.Suppression of LPSinduced interferon-gamma and nitric oxide in splenic lymphocytes by select estrogen-regulated microRNAs：a novel mechanism of immune modulation［J］.Blood，2008，112（12）：4591-4597.

［10］El Gazzar M，Church A，Liu T，et al.MicroRNA-146a regulates both transcription silencing and translation disruption of TNF-α during TLR4-induced gene reprogramming［J］.J Leukoc Biology，2011，90（3）：509-519.

［11］Wong LY，Cheung BM，Li YY，et al.Adrenomedullin is both proinflammatory and antiinflammatory：its effects on gene expression and secretion of cytokines and macrophage migration inhibitory factor in NR8383 macrophage cell line［J］.Endocrinology，2005，146（3）：1321-1327.

［12］Taganov KD，Boldin MP，Chang KJ，et al.NF-kappaBdependent induction of microRNA miR-146，an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（33）：12481-12486.

［13］Ren W，Hu L，Hua F，et al.Myeloid differentiation protein 2 silencing decreases LPS-induced cytokine production and TLR4／MyD88 pathway activity in alveolar macrophages［J］.Immunol Lett，2011，141（1）：94-101.