定量檢測重組抗白介素6受體人源化單克隆抗體HS628的ELISA方法的建立及確證

張代超 ，魏峰，毛素梅，劉運(yùn)龍，任欣怡，李金龍，陳知航，程遠(yuǎn)國

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物與流行病研究所，北京 100071；3.廣西桂東靈長類開發(fā)實(shí)驗(yàn)有限公司，廣西 桂東 543000

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為慢性、對稱性、進(jìn)行性發(fā)展，關(guān)節(jié)炎癥最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)損壞[1-3]。RA作為常見的關(guān)節(jié)性炎癥，其發(fā)病率為0.3%～1.0%，其病理表現(xiàn)主要為滑膜炎，因此一般在可動(dòng)關(guān)節(jié)多表現(xiàn)為疼痛、腫脹、壓痛及關(guān)節(jié)畸形等明顯癥狀，最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能性喪失[4-6]。

RA的發(fā)病機(jī)制迄今尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)，其機(jī)制可能是由于關(guān)節(jié)組織中物質(zhì)被激活，或是激活其他一些物質(zhì)而引起相關(guān)細(xì)胞向關(guān)節(jié)腔浸潤，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。在RA 患者中可檢測到多種促炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1（IL-1）和白細(xì)胞介素6（IL-6）等。因此，在治療上抑制促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生或阻斷其信號傳遞作用，有望改善關(guān)節(jié)炎癥的癥狀[7-9]。目前針對促炎性細(xì)胞因子的藥物，如結(jié)合TNF-α的英夫利昔單抗和阿達(dá)木單抗，以及作用于IL-1 信號傳導(dǎo)系統(tǒng)中IL-1受體的受體拮抗劑（阿那白滯素），已被美國FDA 批準(zhǔn)上市，并在治療中取得了良好的效果，為廣大患者帶來了希望。而以IL-6 信號傳導(dǎo)系統(tǒng)為靶標(biāo)進(jìn)行的新藥研發(fā)正受到國內(nèi)外越來越多研究學(xué)者的關(guān)注。雅美羅（Tocilizumab，又稱MRA）是一種人源化抗IL-6 受體單克隆抗體，2005 年在日本被批準(zhǔn)用于Castleman 病的治 療，2009 年歐盟 及2010 年美國FDA 批準(zhǔn)MRA 注射液用于中、重度活動(dòng)性RA 的治療[10]。這也是目前惟一針對IL-6信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的上市藥物。MRA 可與IL-6 受體結(jié)合，阻斷IL-6 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而減輕由IL-6 所引發(fā)的RA 等相關(guān)的炎癥疾病[11-12]。

抗體藥物是生物技術(shù)藥物中的重要組成部分，抗體藥物的藥代動(dòng)力學(xué)研究是生物技術(shù)藥物開發(fā)的重要挑戰(zhàn)之一，這其中就包括生物分析法的建立和確證。生物基質(zhì)中抗體藥物的測定比化學(xué)藥物更困難，這是由于抗體藥物與內(nèi)源性蛋白或降解代謝產(chǎn)物均由氨基酸組成。建立對目標(biāo)藥物特異性強(qiáng)、靈敏度高的分析方法，是藥代動(dòng)力學(xué)研究的前提和關(guān)鍵問題之一[13]。較為常用的3種方法是免疫分析法、同位素示蹤法及生物檢定分析法。在本研究中，我們擬采用ELISA 方法對重組抗IL-6 受體人源化單克隆抗體HS628 進(jìn)行臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究，最終建立穩(wěn)定、快速檢測血清中HS628的ELISA 方法，為HS628的研發(fā)及臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

受試品為重組抗IL-6 受體人源化單克隆抗體注射液（簡稱HS628），每瓶80 mg/4 mL，2～8℃避光保存，由海正藥業(yè)（杭州）有限公司提供，批號：20 130904；對照品為羅氏公司的Tocilizumab（MRA，中文商品名：雅美羅），每瓶80 mg/4 mL，2～8℃保存，批號：B2014B10。

猴血清吸附的羊抗人IgG、猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP 購于BETHYL 公司；重組人IL-6 受體α（rhIL-6Rα）購于R&D 公司；streptavidin-HRP 購于R&D 公司；TMB 單組分顯色液購于北京索萊寶科技有限公司；Bio labeling Kit-NH2購于DOJINDO MOLECULAR 公司；阿達(dá)木（Adalimumab）購自雅培制藥公司；利妥昔（Rituximab）購自公司；耐血比（EPO）購自臺灣協(xié)和發(fā)酵麒麟股份有限公司。

試劑配制：①pH7.4 磷酸鹽緩沖液（PBS）：稱取16 g NaCl、0.4023 g KCl、2.84 g Na2HPO4、0.544 g KH2PO4，溶解于2 L ddH2O；②封閉液：用PBS 配制5%脫脂乳；③稀釋液：用PBS 配制1% BSA；④顯色液：TMB 底物液A 液與B 液等體積混合；⑤終止液：將20.8 mL 硫酸緩慢加入100 mL 蒸餾水中，邊加入邊攪拌；⑥ELISA 洗板液：將0.5 mL Tween-20加入999.5 mL PBS中。

1.2 檢測步驟

①包被：用PBS 將猴血清吸附的羊抗人IgG 稀釋至5 μg/mL，100 μL/孔包被于96 孔板中，4℃過夜；②封閉：用洗液洗板3 次，拍干酶聯(lián)板，加5%脫脂乳封閉液300 μL/孔，25℃封閉2 h；③加樣：用洗液洗板3 次，拍干酶聯(lián)板，用20%食蟹猴空白血清稀釋不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，每孔加100 μL，25℃孵育1 h；④加二抗：用洗液洗板4 次，拍干酶聯(lián)板，每孔加100 μL Bion-rhIL-6Rα（1∶20 000），25℃孵育1 h；⑤加streptavidin-HRP：用洗液洗板4次，拍干酶聯(lián)板，每孔加100 μL streptavidin-HRP（1∶200），室溫孵育20 min；⑥顯色：用洗液洗板5次，拍干酶聯(lián)板，每孔加TMB單組分顯色液100 μL，25℃避光孵育15 min；⑦終止：加100 μL 終止液，30 min 內(nèi)讀數(shù)；⑧比色：分別讀取D450nm和D560nm值。各板均設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，并帶有高、中、低3 個(gè)質(zhì)控樣品，用以計(jì)算該板未知樣品濃度。

2 結(jié)果

2.1 抗體配對

選擇猴血清吸附的羊抗人IgG、rhIL-6Rα、猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP、rhIL-6Rα-Bion 組成2 對特異性抗體，猴血清吸附的羊抗人IgG 和rhIL-6Rα-Bion 為第一組，rhIL-6Rα和猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP 為第二組，均以各自優(yōu)化好的條件進(jìn)行兩組配對抗體的對比。結(jié)果見表1、圖1。

圖1 兩組配對抗體檢測重組抗IL-6受體人源化單克隆抗體校正曲線

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

HS628 注射液在400～1.64 ng/mL 范圍內(nèi)，濃度（ng/mL）的對數(shù)值與免疫反應(yīng)光吸收值（D值）呈S形曲線，經(jīng)四參數(shù)Logistic 函數(shù)曲線模型擬合，求得曲線斜率、IC50及上下端漸進(jìn)線間的近線性范圍。其數(shù)學(xué)模型為：

其中A1 為曲線的上端漸進(jìn)線的估計(jì)值（D值），A2 為曲線的下端漸進(jìn)線的估計(jì)值（D值），P為校正曲線的斜率，X0 為IC50（即50%光吸收值所對應(yīng)的樣品濃度值）。通過擬合最優(yōu)即擬合誤差最?。é?值最?。┑那€作為校正曲線。通過同一批次試驗(yàn)的校正曲線計(jì)算未知樣品的濃度。擬合曲線見表2、圖2。

2.3 方法的靈敏度與最低檢測濃度

按照制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法制成320、20、4 ng/mL（高、中、低）3 個(gè)質(zhì)控濃度以及最低濃度點(diǎn)1.64 ng/mL 的受試品HS628 注射液樣品，同樣按上述方法測定，重復(fù)5 次，由同一板上的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出的濃度為HS628注射液的檢出量。標(biāo)準(zhǔn)品回收率試驗(yàn)批內(nèi)CV＜20%，滿足方法學(xué)要求，最低檢測下限為1.64 ng/mL。

表1 抗體配對結(jié)果

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

2.4 方法的精密度與準(zhǔn)確度

按照制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法制成320、20、4 ng/mL（高、中、低）3個(gè)濃度受試品HS628注射液的質(zhì)控樣品，按上述方法測定，重復(fù)5 次，由同一板上的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出的濃度為HS628注射液的檢出量。板內(nèi)差異（1 塊板內(nèi)重復(fù)測定5 次）見表4，板間差異（3 塊板各測定一次）見表5。在建立的曲線范圍內(nèi)，板內(nèi)精密度變異系數(shù)為4.9%～14.4%，相對誤差為-1.3%～0.6%；板間精密度變異系數(shù)為6.2%～16.5%，相對誤差為-10.8%～5.3%，均符合方法學(xué)精密度要求。

表3 ELISA檢測加入猴血清中HS628注射液的靈敏度

表4 ELISA檢測加入猴血清中HS628注射液的板內(nèi)精密度

圖2 HS628的四參數(shù)校正曲線

2.5 方法的特異性

分別做EPO、Rituximab、Adalimumab 和受試品重組抗IL-6 受體人源化單克隆抗體注射液的校正標(biāo)準(zhǔn)曲線，無交叉反應(yīng)，見圖3。

2.6 樣品穩(wěn)定性

曲線選高、中、低3 個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度5 個(gè)樣本。在-80℃冰箱中冷凍后取出，室溫融化，反復(fù)凍融循環(huán)3 次，測定其濃度（表6）、室溫4 h穩(wěn)定性（表7）。因?yàn)楸狙芯吭O(shè)計(jì)要求，部分樣品濃度不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)須稀釋后復(fù)測，每個(gè)樣品最多凍融3 次，且須在4 h 內(nèi)加樣完畢，因此須進(jìn)行凍融3次、室溫保持4 h的穩(wěn)定性研究。

曲線選高、中、低3 個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度3 個(gè)樣本，在-80°C 冰箱中冷凍90 d 后取出，室溫融化，測定其濃度（表8）。

表5 ELISA檢測加入猴血清中HS628注射液的板間精密度

圖3 受試品HS628與EPO、Rituximab、Adalimumab的校正曲線

結(jié)果表明，本方法的室溫穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果CV、RE均在±20%之內(nèi)，滿足藥代動(dòng)力學(xué)研究。

2.7 樣品稀釋率的影響

將HS628 用20%猴血清配制成80 μg/mL 和400 ng/mL 的樣品，將80 μg/mL 樣品分別進(jìn)行1/50000、1/5000、1/500 稀釋，稀釋后濃度分別為1.6、16、160 ng/mL；將400 ng/mL 樣品分別進(jìn)行1/50、1/10、1/2 稀釋，稀釋后濃度分別為8、40、200 ng/mL。每個(gè)稀釋率取7 個(gè)樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表9，表明用20%猴血清對HS628進(jìn)行稀釋后對樣品檢測無影響，不存在稀釋效應(yīng)。

2.8 受試品與陽性對照品Tocilizumab的比較

表6 凍融穩(wěn)定性

表7 室溫4℃穩(wěn)定性

表8 凍存90 d穩(wěn)定性

表9 稀釋率的影響

將受試品和Tocilizumab 分別制成400、160、64、25.6、10.24、4.096 和1.6384 ng/mL 的樣品，經(jīng)四參數(shù)Logistic 函數(shù)曲線模型擬合，可以看出受試品和陽性對照品的免疫原性相似，因此在測定對照組樣品濃度時(shí)也可使用受試品標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸濃度計(jì)算。見表10、11和圖4。

3 討論

由表1 和圖1 可以看出第一組的靈敏度比第二組高，線性范圍比第二組要寬。這是由于，第一組采用了生物素-親和素系統(tǒng)，免疫反應(yīng)條件溫和，免疫信號進(jìn)一步放大。生物素-親和素系統(tǒng)是上世紀(jì)70年代末發(fā)展起來的一種生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。隨著各種生物衍生物的問世，BA-ELISA 法很快被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。在此次實(shí)驗(yàn)中我們采用了生物素標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記，其操作簡單，標(biāo)記率和回收率高。另外，在整個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)研究過程中，生物樣本數(shù)量多，而rhIL-6Rα價(jià)格昂貴，在采用了生物素-親和素系統(tǒng)后，使成本降低為原來的1/3～1/5。

近年來，生物技術(shù)藥物在國內(nèi)外發(fā)展迅速，各種種類的生物技術(shù)新藥不斷誕生，如何更好地評價(jià)這類新藥在各領(lǐng)域都存在不同程度的困難?？贵w藥物是生物技術(shù)藥物的重要組成部分，抗體藥物的藥代動(dòng)力學(xué)研究是對生物技術(shù)藥物開發(fā)的重要挑戰(zhàn)之一，其中就包括生物分析法的建立和確證。生物體液中生物制品的測定比化學(xué)藥物更難，因?yàn)樯镏破放c內(nèi)源性蛋白或降解代謝產(chǎn)物均由氨基酸組成。建立對目標(biāo)生物制品特異性強(qiáng)、靈敏度高的分析方法是藥代動(dòng)力學(xué)研究的前提和關(guān)鍵問題之一。重組抗IL-6 受體人源化單克隆抗體作為抗體類藥物，在方法建立的初期，我們曾尋找其特異性抗體未果。最后只有用其抗原rhIL-6Rα，經(jīng)Biacore T200檢測，與HS628 的親和常數(shù)為5.993E-10M。但由于rhIL-6Rα市售規(guī)格均為小包裝且價(jià)格昂貴，所以最終我們采用了生物素-親和素系統(tǒng)，即將市售的rhIL-6Rα進(jìn)行生物素標(biāo)記，經(jīng)streptavidin-HRP 放大，加底物顯色。方法學(xué)確證結(jié)果表明，本研究建立的方法的特異性、板內(nèi)和板間精密度、定量下限、回收率、穩(wěn)定性及樣品稀釋率的影響均滿足生物樣品分析要求。另外通過與對照品比較，二者校正曲線重合，說明二者在體外免疫反應(yīng)一致。

表10 HS628注射液校正曲線D值

表11 對照品Tocilizumab校正曲線D值

圖4 受試品HS628注射液與對照品Tocilizumab的校正曲線

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