一種用于檢測惡性瘧原蟲的雙環(huán)引物環(huán)介導等溫擴增方法

呂沁風，姜侃，楊永耀，何蕾，羅鵬，吳忠華

1.浙江國際旅行衛(wèi)生保健中心，浙江 杭州 310003；2.浙江省質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，浙江 杭州 310003

惡性瘧是由惡性瘧原蟲感染引起的瘧疾，目前高發(fā)于非洲和東南亞熱帶地區(qū)。根據(jù)WHO的報道，每年約有65 萬人死于惡性瘧，57%的非洲人口仍然生活在惡性瘧流行的高發(fā)地區(qū)，在非洲南部惡性瘧仍是住院的主要原因，同時給這些地區(qū)帶來了沉重的經(jīng)濟負擔[1-2]。惡性瘧潛伏期為9～14 d，平均12 d；常見發(fā)冷、發(fā)熱、出汗等癥狀，與重癥流行性感冒相似；發(fā)作周期一般為36～48 h。免疫力低下人群，如未及時治療或治療不當易發(fā)展為重癥瘧疾，甚至腦型瘧而死亡。國內(nèi)目前惡性瘧主要來源于輸入性感染，且存在瘧疾的傳播媒介按蚊，開發(fā)快速檢測方法，對惡性瘧的防治具有重要的意義。

環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型核酸擴增技術，該方法針對靶基因的6 個區(qū)域設計4 種引物，在等溫條件60℃～65℃下利用Bst聚合酶即可進行109～1010倍的核酸擴增[3-4]。LAMP 產(chǎn)物通過濁度或熒光變化可用肉眼觀察，具有操作簡便、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點[5-6]。自2000 年問世以來，LAMP 技術在病原體檢測、疾病診斷等領域得到廣泛應用[7-10]。目前，如何在現(xiàn)有LAMP 技術的基礎上發(fā)掘更高效快速的等溫擴增方法，成為重要的研究方向。最快速的LAMP反應方法就是加入環(huán)引物[11-12]。本研究的目的在于縮短等溫擴增的反應時間，達到比加入環(huán)引物更快的擴增效率：把LAMP 的環(huán)引物由1 對增加至2 對，在進行等溫擴增反應時，2 對環(huán)引物能同時和反應回環(huán)的產(chǎn)物進行貼合，亦即在退火的同時啟動了再回環(huán)的擴增，從而增加了反應進程，縮短反應時間，達到快速檢測的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

2011～2014 年口岸截獲的瘧疾感染者全血標本為本室保存。

DNA 提取試劑盒和膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；BstDNA 聚合酶購自NEB 公司；ExTaq酶、dNTP、DL2000 DNA marker、瓊脂糖凝膠購自TaKa-Ra 公司；MgSO4和甜菜堿為Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品；EvaGreen 購自Biotium 公司；2720 型PCR 儀購自ABI公司；Chromo 4型熒光定量PCR儀、電泳儀購自BIO-RAD公司。

1.2 引物設計

常規(guī)LAMP 技術含有1 對外引物、1 對內(nèi)引物，選擇加入1 對環(huán)引物，可在等溫條件下進行核酸擴增。本研究根據(jù)惡性瘧原蟲18S rRNA 基因保守區(qū)設計了 一組引 物[13-14]，分別為F3、B3、FIP、BIP、fLoop1、fLoop2、bLoop1 和bLoop2，第2 對環(huán)引物的加入，使等溫擴增回環(huán)的速率增加，從而縮短反應的時間。引物序列見表1。

1.3 惡性瘧原蟲DNA的提取

嚴格按QIAGEN DNA 抽提試劑盒說明書提取DNA，-20℃保存。

1.4 反應體系及反應條件

快速LAMP 反應體系：10×緩沖液2.5 μL，引物混合 物1 μL（F3、B3 各1 μmol/L，F(xiàn)IP、BIP 各15 μmol/L，fLoop1、fLoop2 各5 μmol/L，bLoop1、bLoop2各15 μmol/L），模板DNA 1 μL，8 UBstDNA 聚合酶1 μL，甜菜堿（8 mol/L）2 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，MgSO4（100 mmol/L）1.2 μL，1.25 μL 20×的EvaGreen，加入滅菌雙蒸水補足25 μL。

加入環(huán)引物的LAMP 引物混合物為F3、B3 各1 μmol/L，F(xiàn)IP、BIP 各15 μmol/L，fLoop1、fLoop2 各5 μmol/L，其他成分與雙環(huán)引物LAMP一致。

反應條件：63℃ 55 s，熒光采集5 s，100 個循環(huán)。反應在熒光定量PCR儀中進行。

1.5 靈敏度試驗

以DNA 為模板，用PCR 混合引物進行擴增，將PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒進行純化回收，對純化后的PCR產(chǎn)物測定D260nm值，根據(jù)產(chǎn)物長度和D260nm值計算拷貝數(shù)，將產(chǎn)物以1/10 梯度稀釋，最終稀釋到1×100拷貝/μL。分別取1 μL 作為模板加入反應體系中，在63℃恒溫條件下反應60 min。在熒光定量PCR 儀上觀察實時熒光反應曲線，反應結(jié)束后進行65℃到95℃溶解曲線試驗，每增加1℃保溫30 s，檢測熒光強度，試驗結(jié)束后取2 μL 反應產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，同時用外引物進行PCR反應檢測靈敏度。

表1 惡性瘧原蟲快速LAMP擴增引物

1.6 特異性試驗

同時提取間日瘧、卵形瘧和三日瘧等感染者全血核酸，同時用雙環(huán)LAMP方法進行檢測。

1.7 重復性試驗

根據(jù)靈敏度試驗結(jié)果，選擇陰性、1×100拷貝/μL和1×106拷貝/μL 濃度的cDNA 模板分別進行快速LAMP，每份樣本各取1 μL 重復3 次，采用實時熒光定量PCR 儀進行檢測，觀察反應的Ct 值，根據(jù)Ct 值計算變異系數(shù)，對該方法的重復性進行考核。

1.8 樣本檢測

采用該方法對全省口岸送檢的29 例全血標本及30例健康體檢者全血標本進行檢測，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 靈敏度試驗結(jié)果

在熒光定量PCR 儀上觀察實時熒光反應，結(jié)果見圖1；取2 μL 反應產(chǎn)物進行10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2，1～5 泳道均出現(xiàn)細密的階梯狀條帶，表示有陽性擴增反應?？梢耘卸ū痉椒ǖ臋z測極限約為1×101拷貝/μL。PCR 靈敏度試驗結(jié)果見圖3，可見檢測限為1×102拷貝/μL。經(jīng)比較雙環(huán)引物LAMP 檢測方法的靈敏度比PCR 法高一個數(shù)量級。溶解曲線試驗結(jié)果見圖4，可見每個不同濃度的產(chǎn)物溶解曲線溫度都在同一點上。

2.2 特異性試驗結(jié)果

采用惡性瘧快速LAMP 方法進行檢測，電泳反應結(jié)果見圖5，惡性瘧出現(xiàn)與普通LAMP 反應相同的的階梯狀條帶。此外，陰性對照、間日瘧、卵形瘧、三日瘧核酸的檢測結(jié)果均為陰性，由此顯示了該方法具有很好的特異性。

2.3 重復性試驗結(jié)果

根據(jù)實時熒光LAMP 的結(jié)果，記錄各次試驗的Ct 值。根據(jù)Ct 值計算SD值及變異系數(shù)（CV），結(jié)果見表2，強陽性及臨界值樣本的CV值均小于5%，重復性良好。

2.4 2種擴增方法的反應時間比較

根據(jù)實時熒光檢測結(jié)果可見，快速LAMP 的反應時間最快可達15 min 左右，加入環(huán)引物的LAMP反應時間為25 min左右。實時熒光檢測見圖6。

2.5 臨床樣本檢測

采用快速LAMP 技術進行檢測，發(fā)現(xiàn)29 例口岸送檢本實驗室的樣本中有8 例惡性瘧陽性，與熒光定量PCR 檢測結(jié)果相符。30 例健康體檢者檢測結(jié)果全部為陰性。

3 討論

環(huán)介導等溫擴增技術由于操作簡單、不需要昂貴的專用實驗儀器、反應在1～1.5 h 內(nèi)完成、靈敏度高，而吸引了大量研究力量投入該領域的研究。我們改進的方法縮短了檢測時間，在實際檢測應用中和定量PCR 檢測結(jié)果相符，證明本檢測方法具有應用價值。但2對環(huán)引物設計比1對引物設計要困難，對于擴增片段太短和能設計引物的位置太少的核酸檢測并不適合。對能設計雙環(huán)引物的LAMP 擴增來說，能不能真正提高擴增效率需要通過大量實驗進行驗證。

圖1 惡性瘧原蟲雙環(huán)引物LAMP靈敏度檢測實時熒光結(jié)果

圖2 惡性瘧原蟲雙環(huán)引物LAMP產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖3 惡性瘧原蟲PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

表2 惡性瘧原蟲雙環(huán)引物LAMP重復性實驗結(jié)果

圖4 惡性瘧原蟲雙環(huán)引物LAMP產(chǎn)物溶解曲線試驗

圖5 雙環(huán)引物LAMP特異性試驗結(jié)果

圖6 雙環(huán)引物和環(huán)引物擴增速度比較

[1]Maitland K.Management of severe paediatric malaria in resource-limited settings[J].BMC Med,2015,13:42.

[2]Cox-Singh J,Davis T M,Lee K S,et al.Plasmodium knowlesi malaria in humans is widely distributed and potentially life threatening[J].Clin Infect Dis,2008,46(2):165-171.

[3]Notom T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acid Res,2000,28(12):e63.

[4]Nagamine K,Watanabe K,Ohtsuka K,et al.Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template[J].Clin Chem,2001,47:1742-1743.

[5]Goto M,Honda E,Ogura A,et al.Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxyl naphthol blue[J].Biotechniques,2009,46(3):167-172.

[6]Mori Y,Nagamine K,Tomita N,et al.Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,289(1):150-154.

[7]Lyu Q F,Chen Y,Zheng W,et al.Establishment of a reserve transcription loop-mediated isothermal amplification method for Yellow fever virus[J].Microbiol China,2014,41(1):184-190.

[8]Zhao Z,Fan B,Wu G,Yan X,et al.Development of loop-mediated isothermal amplification assay for specific and rapid detection of differential goat pox virus and sheep pox virus[J].BMC Microbiol,2014,14:10.

[9]Su J,Liu X,Cui H,et al.Rapid and simple detection of methicillinresistance staphylococcus aureus by orfX loop-mediated isothermal amplification assay[J].BMC Biotechnol,2014,14:8.

[10]Tomita N,Mori Y,Kanda H,et al.Loop-mediated isothermal amplification(LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products[J].Nat Protoc,2008,3(5):877-882.

[11]Nagamine K,Hase T,Notomi T.Accelerated reaction by loopmediated isothermal amplification using loop primers[J].Mol Cell Probes,2002,16(3):223-229.

[12]Ihira M,Yoshikawa T,Enomoto Y,et al.Rapid diagnosis of human herpesvirus 6 infection by a novel DNA amplification method,loop-mediated isothermal amplification[J].J Clin Microbiol,2004,42(1):140-145.

[13]Oriero C E,van Geertuyden J P,Jacobs J,et al.Validation of an apicoplast genome target for the detection of Plasmodium species using polymerase chain reaction (PCR) and loop mediated isothermal amplification(LAMP)[J].Clin Microbiol Infect,2015,21(7):686.e1-686.e7.

[14]Pakalapati D,Garg S,Middha S,et al Comparative evaluation of microscopy,OptiMAL and 18S rRNA gene based multiplex PCR for detection of Plasmodium falciparum &Plasmodium vivax from field isolates of Bikaner,India[J].Asian Pac J Trop Med,2013,6(5):346-351.