一種丙肝病毒滴度測(cè)定方法

李亞?wèn)|，李智華，畢研偉，陳晨，寸韡

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118；2.云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118

1989年Choo等[1]通過(guò)克隆方法鑒定了丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）基因組，加速了HCV 研究進(jìn)程；2005 年，HCV 2a 型JFH1 分離株在少數(shù)細(xì)胞系內(nèi)獲得體外培養(yǎng)[2-3]。病毒研究過(guò)程中常須對(duì)其滴度進(jìn)行測(cè)定，但HCV 感染細(xì)胞后產(chǎn)生的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）不明顯，這為HCV 滴度測(cè)定帶來(lái)了一定難度。2005 年，免疫熒光法（IFA）被用于HCV 滴度的測(cè)定[4]，至今仍是測(cè)定HCV 滴度的主要方法。由于塑料細(xì)胞培養(yǎng)板在熒光顯微鏡下會(huì)產(chǎn)生衍射，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而玻璃細(xì)胞培養(yǎng)板較為昂貴，因此一般都采用細(xì)胞爬片進(jìn)行IFA 實(shí)驗(yàn)，但取出細(xì)胞爬片時(shí)易導(dǎo)致部分被感染的細(xì)胞損失，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性。另一方面，由于顯微鏡下一個(gè)視野不能觀察到整塊細(xì)胞爬片，因此計(jì)數(shù)誤差較大。該方法也難以避免病毒二次感染的產(chǎn)生，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不精確。

2009 年，免疫組化技術(shù)（IHC）被用于HCV 滴度的測(cè)定，該方法無(wú)須制備細(xì)胞爬片，可直接在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)感染并進(jìn)行后續(xù)免疫組化實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)96 孔板中被感染孔計(jì)算TCID50，得到HCV 滴度[5]。這相比IFA 測(cè)定滴度方法更加精確，但成本依然相對(duì)較高。我們對(duì)IHC 技術(shù)測(cè)定HCV 滴度的方法加以改進(jìn)，建立了一種更加簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、安全的測(cè)定HCV 滴度的方法，為HCV 的基礎(chǔ)研究及臨床藥物評(píng)估提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料

Huh7 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所；HCV JFH1 病毒株為本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM 培養(yǎng)基、非必需氨基酸購(gòu)于Hyclone 公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)于Gibco 公司；抗HCV 核心蛋白單克隆抗體購(gòu)于Viro-Stat 公司；羊抗鼠二抗-HRP 購(gòu)于Thermo Pierce 公司；ImmPress羊抗鼠二抗-HRP及ImmPACT DAB 顯色試劑購(gòu)于Vector 公司；瓊脂糖購(gòu)于Invitrogen 公司；甲基纖維素購(gòu)于Sigma 公司；96 孔板購(gòu)于Costar公司。

1.2 病毒感染

Huh7 細(xì)胞按8×103/孔于96 孔板中采用含10%FBS 的DMEM 完全培 養(yǎng)基培 養(yǎng)16 h，取10 μL HCV，用DMEM 完全培養(yǎng)基按1/10 梯度稀釋為10-1～10-5，吸棄96 孔板中的培養(yǎng)基，將病毒稀釋液按50 μL/孔輕輕加入96孔板，每個(gè)稀釋度設(shè)定3個(gè)復(fù)孔以驗(yàn)證此方法的可重復(fù)性，搖勻后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行感染，每隔1 h輕輕搖晃96孔板，使病毒均勻感染細(xì)胞，10 h 后吸棄病毒稀釋液，按100 μL/孔加入甲基纖維素-DMEM（含2%FBS）半固體培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。

1.3 HCV滴度測(cè)定

感染HCV 的Huh7細(xì)胞培養(yǎng)4 d后，輕輕吸棄甲基纖維素-DMEM 培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 于-20℃預(yù)冷的甲醇，-20℃固定10 min，吸棄甲醇，PBS 輕洗2次，用100 μL含3% H2O2的PBS室溫處理5 min[5]；PBS洗2次，加入50 μL含1% BSA和0.2%脫脂奶粉的PBS，4℃封閉過(guò)夜；吸棄封閉液，每孔加入30 μL用PBST（含0.5‰吐溫-20的PBS）以1∶500稀釋的抗HCV 核心蛋白單克隆抗體，室溫輕輕搖動(dòng)1 h；吸棄一抗，PBS 洗2 次，PBST 洗1 次；每孔加入30 μL 用PBST以1∶1稀釋的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠聚合二抗，室溫輕輕搖動(dòng)30 min；吸棄二抗，PBS 洗2 次，PBST 洗1 次；每孔加入50 μL 新鮮配制的DAB顯色試劑，室溫作用1～10 min至看到棕色病毒斑；吸棄DAB 染液，PBS 洗2 次，加100 μL PBS，在低倍倒置顯微鏡下觀察感染病毒的細(xì)胞斑塊并計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 聚合二抗聯(lián)合DAB 能夠使被HCV 感染的細(xì)胞清晰顯色

目前測(cè)定HCV 滴度的主要方法是IFA 法，鑒于IFA 法測(cè)定HCV 滴度存在的一些不足，我們擬通過(guò)免疫組化技術(shù)在96 孔板內(nèi)使被感染細(xì)胞顯色，減少I(mǎi)FA 法制備細(xì)胞爬片過(guò)程中造成的細(xì)胞損失，在一定程度上提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為了能夠完好地保存細(xì)胞內(nèi)病毒的抗原性進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。常用的固定劑有95%酒精、4%多聚甲醛、10%福爾馬林溶液、0.5%戊二醛、冷丙酮、冷甲醇等[6]。本實(shí)驗(yàn)比較了冷甲醇、4%多聚甲醛、10%福爾馬林溶液3種常用的固定劑，均能起到很好的固定效果（圖1）。由于冷甲醇相對(duì)較易獲得，固定細(xì)胞的同時(shí)能夠滅活病毒，對(duì)人體的危害相對(duì)較小，因此本研究后續(xù)試驗(yàn)采用甲醇進(jìn)行細(xì)胞固定。

固定后的細(xì)胞保持了蛋白的抗原性，可以進(jìn)行后續(xù)免疫組化實(shí)驗(yàn)。然而，我們采用常規(guī)免疫組化技術(shù)進(jìn)行后續(xù)操作，即封閉后用抗HCV 核心蛋白單克隆抗體進(jìn)行孵育，利用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠二抗識(shí)別鼠源一抗并采用DAB 顯色時(shí)，未觀察到細(xì)胞顯色；換用了HRP 標(biāo)記的羊抗鼠聚合二抗及DAB 顯色試劑，結(jié)果能觀察到明顯的棕色病毒感染斑（圖1）。

2.2 采用0.8%～1%的甲基纖維素能夠限制病毒在胞間感染形成肉眼可見(jiàn)斑塊

測(cè)定HCV 滴度時(shí)，細(xì)胞被病毒感染會(huì)形成二次感染，通過(guò)免疫組化技術(shù)將被感染細(xì)胞顯色，通過(guò)TCID50方法可計(jì)算病毒滴度，但較浪費(fèi)抗體，成本較高。因此，我們擬采用噬斑法計(jì)數(shù)病毒滴度。病毒感染細(xì)胞后，通過(guò)在細(xì)胞表面添加覆蓋物，可以限制病毒在細(xì)胞間感染。常用于病毒滴度測(cè)定的覆蓋物為瓊脂糖，但HCV 感染細(xì)胞不能形成可見(jiàn)的噬斑，因此在病毒感染細(xì)胞后，需要將覆蓋物移除以便于后續(xù)進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，而瓊脂糖覆蓋后凝固成塊狀，不易除去，因此需要選用一種既不完全凝固又能在病毒顆粒中自由流動(dòng)的覆蓋物。甲基纖維素呈半固體狀，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，易吸除，且不會(huì)同時(shí)吸走細(xì)胞，可以作為被實(shí)驗(yàn)的覆蓋物。我們選用粘度為4000 cP 的甲基纖維素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比較了0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、2%共8 個(gè)不同終濃度的甲基纖維素進(jìn)行覆蓋，綜合考慮其對(duì)病毒自由流動(dòng)的限制以及移除的難易，發(fā)現(xiàn)終濃度為0.8%～1.0%的甲基纖維素既容易移除同時(shí)也能很好地限制病毒于細(xì)胞間感染，形成明顯斑塊（圖2）。

圖1 不同固定液及酶標(biāo)二抗使被感染細(xì)胞顯色結(jié)果

2.3 建立的滴度測(cè)定方法具有可重復(fù)性

為了驗(yàn)證所建立的滴度測(cè)定方法的穩(wěn)定性與可重復(fù)性，測(cè)滴度時(shí)樣品設(shè)立3 個(gè)復(fù)孔，低倍顯微鏡下對(duì)感染斑計(jì)數(shù)。為了提高計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，將96 孔板每個(gè)孔呈“十”字劃線，-3 稀釋度的感染斑分布較均勻，感染斑個(gè)數(shù)為30±5（3 個(gè)復(fù)孔感染斑個(gè)數(shù)分別為32、26、35），各復(fù)孔之間感染斑個(gè)數(shù)無(wú)顯著性差異，說(shuō)明該滴度測(cè)定方法具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性（圖3）。以此稀釋度計(jì)算，此批HCV 的滴度為6.2×105FFU/mL。

圖2 顯微鏡下HCV形成的感染斑

圖3 96孔板HCV滴度計(jì)算

3 討論

HCV 實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)后，免疫學(xué)技術(shù)被運(yùn)用到HCV 滴度測(cè)定中，發(fā)展出IFA 測(cè)定方法[4,7-8]，成為HCV 滴度測(cè)定的主要方法，但仍然存在取出細(xì)胞爬片過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致被感染細(xì)胞的損失，以及熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)誤差等不足。2009 年，IHC 技術(shù)被用于HCV 滴度測(cè)定[5]，將HCV 感染Huh7 細(xì)胞后，采用特異性的一抗識(shí)別HCV 蛋白，再采用HRP標(biāo)記的二抗與一抗特異性結(jié)合，最后用DAB 顯色，通過(guò)統(tǒng)計(jì)HCV 感染細(xì)胞情況計(jì)算出HCV 的TCID50，從而得到病毒滴度。TCID50法測(cè)定HCV 滴度要浪費(fèi)大量抗體，成本較高。本研究建立的測(cè)定HCV 滴度的方法，通過(guò)加入甲基纖維素限制病毒于胞間感染，利用聚合二抗及DAB 顯色形成肉眼可見(jiàn)的病毒斑塊，僅需一塊96 孔板就可測(cè)定4～6 個(gè)HCV 滴度，在保證結(jié)果精確的同時(shí)較為節(jié)約抗體。

本研究采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗識(shí)別鼠源抗HCV 核心蛋白的單克隆抗體，再用DAB顯色劑顯色，結(jié)果常規(guī)Western印跡所用的酶標(biāo)二抗未使DAB 顯色；換用了高靈敏度的聚合型酶標(biāo)二抗后，能夠使DAB 底物較好地顯色，使HCV 感染斑清晰呈現(xiàn)出來(lái)。在感染斑計(jì)數(shù)時(shí)，稀釋度較低，感染斑個(gè)數(shù)較多，導(dǎo)致各個(gè)感染斑之間有相連的情況，計(jì)數(shù)誤差較大；而稀釋度較高時(shí)，各孔之間感染斑個(gè)數(shù)差異較大，若以此計(jì)算滴度，則會(huì)導(dǎo)致大的誤差。本實(shí)驗(yàn)中，10-3稀釋度在96 孔板各孔中出現(xiàn)約30 個(gè)感染斑，各感染斑之間分布較均勻，且復(fù)孔之間感染斑數(shù)無(wú)顯著性差異，因此以此感染斑數(shù)計(jì)算病毒的滴度。由于顯微鏡下計(jì)數(shù)易導(dǎo)致漏計(jì)或重復(fù)計(jì)數(shù)，可將每個(gè)孔劃線分成數(shù)個(gè)區(qū)域，以提高計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度。同時(shí)，該方法形成的感染斑達(dá)到了肉眼可見(jiàn)的程度，可以直接計(jì)數(shù)或拍成照片后計(jì)數(shù)，若以更大的24孔板測(cè)定HCV 滴度，直接通過(guò)肉眼計(jì)數(shù)感染斑會(huì)更加容易。

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