• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    人表皮生長因子的原核優(yōu)勢表達與復(fù)性

    2015-11-29 08:31:44孫衛(wèi)國楊栗坤熊志紅楊秉芬劉艷華張靈霞
    生物技術(shù)通訊 2015年5期
    關(guān)鍵詞:復(fù)性原核密碼子

    孫衛(wèi)國,楊栗坤,熊志紅,楊秉芬,劉艷華,張靈霞

    解放軍第309醫(yī)院 結(jié)核病研究所,全軍結(jié)核病防治重點實驗室,北京 100091

    人表皮生長因子(human epidermal growth factor,hEGF)是由53 個氨基酸殘基組成的單鏈多肽,廣泛存在于人體各種組織內(nèi)。人體內(nèi)EGF含量不足易導(dǎo)致一系列的病理變化,如胃腸道潰瘍病,而補充外源性EGF 能大大縮短慢性胃潰瘍的療程[1]。EGF表達過量增加鳥氨酸脫羧酶的活性及多胺水平,也與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[2]。hEGF能促進燒傷、創(chuàng)傷及外科傷口的愈合,在燒傷、創(chuàng)傷、皮膚和角膜移植、外傷性皮膚潰瘍等治療中有重要作用。EGF也是某些化妝品的添加劑,具有較大的市場價值。目前利用原核系統(tǒng)表達重組hEGF(rhEGF)的主要弊端是表達量較低,生物活性不高,很難規(guī)?;a(chǎn)。我們根據(jù)原核表達系統(tǒng)特點,優(yōu)化影響rhEGF表達量的諸多因素,對基因核酸序列的mRNA 結(jié)構(gòu)、密碼子偏愛性,表達宿主菌的生長狀態(tài)進行綜合考慮,通過同義密碼子置換合成hEGF 全基因序列,構(gòu)建原核表達載體pET-24b-hEGF,獲得hEGF 在原核系統(tǒng)內(nèi)的高表達,其表達量占菌體總蛋白的15%左右。經(jīng)過復(fù)性條件的優(yōu)化,包涵體的復(fù)性率達90%以上,為原核系統(tǒng)規(guī)?;a(chǎn)rhEGF打下了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    BALB/c3T3 細胞,大腸桿菌BL21(DE3)和載體pET24b 由本室保存;EGF 標準品由中國藥品生物制品檢定所提供;優(yōu)化后的hEGF編碼序列和測序由北京華大基因生物工程公司合成;酵母提取物、胰蛋白胨購自O(shè)xoid 公司;hEGF 抗體購自ABcam 公司;酶標羊抗兔IgG(HRP 標記)購自中杉生物工程技術(shù)公司;MTT 購自Sigma 公司;親和色譜填料購自GE 公司;其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 hEGF全基因序列優(yōu)化與合成

    根據(jù)生物軟件對hEGF可能表達量的預(yù)測,對其編碼序列按同義密碼子進行全合成,使mRNA 的二級結(jié)構(gòu)自由能滿足最優(yōu)表達需要,同時3′端加入大腸桿菌偏好終止密碼子TAA。合成的全序列為:AACAGCGACTCTGAATGCCCGCTGTCCCACGATGGTTACTGCCT GCATGATGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTATG CATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGTGAGCGTTGCCAGTAC CGTGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGC。

    1.3 hEGF基因克隆與表達

    對合成的含有hEGF 全序列載體pUC-hEGF 以限制性內(nèi)切酶NdeⅠ/XhoⅠ于37℃酶切10 h,瓊脂糖膠回收酶切后小片段,與經(jīng)同樣雙酶切的表達載體pET-24b 在T4DNA 連接酶的作用下于16℃連接4 h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)后,挑選陽性克隆測序,取測序結(jié)果同預(yù)期結(jié)果完全一致的菌落保存。將攜帶有hEGF 序列的原核表達載體命名為pET-24b-hEGF。

    將陽性菌落接種含卡那霉素的LB 培養(yǎng)基,37℃振搖過夜活化后,按1∶100 的比例重新接種LB 培養(yǎng)基,檢測細菌的生長密度,當菌液D600nm達0.4 時,加入IPTG 使其終濃度為0.3 mmol/L,37℃誘導(dǎo)表達7 h,離心收集沉淀菌體,加入PBS緩沖液混勻,冰浴超聲波破碎,表達菌液加入5×上樣緩沖液,煮沸后取20 μL 進行20% SDS-PAGE,分析目的蛋白在原核系統(tǒng)內(nèi)的表達量和表達形式。

    1.4 rhEGF包涵體的復(fù)性與純化

    電泳鑒定rhEGF 在原核系統(tǒng)中以包涵體的形式生成,對包涵體進行初步純化。收集rhEGF 沉淀包涵體,用1%的Triton X-100 洗滌3 次,4℃、5000 r/min 離心10 min;室溫條件下取rhEGF 包涵體,以含8 mol/L 尿素的Tris 緩沖液(50 mmol/L,pH8.8)溶解,高速離心后取溶液上清過Q Sepharose Fastflow陰離子交換柱,并用含8 mol/L 尿素的Tris 緩沖液(50 mmol/L,pH8.8)+NaCl 進行梯度洗脫,分別收集穿過峰和各洗脫峰蛋白;采用透析復(fù)性的方法對rhEGF 包涵體進行復(fù)性,將純化的包涵體尿素溶液以含5 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSG 的Tris 緩沖液(50 mmol/L,pH8.8)在4℃條件下以1∶20 的體積進行透析,12 h 更換透析液一次,透析5 次后以50 mmol/L Tris 緩沖液(pH8.8)透析,整個透析過程均沒有沉淀產(chǎn)生;取透析后復(fù)性的rhEGF進行SDS-PAGE分析。

    1.5 rhEGF的Western印跡與活性檢測

    取純化的rhEGF 行20%的SDS-PAGE,電轉(zhuǎn)移后將硝酸纖維素膜(NC 膜)置于含5%脫脂奶粉的PBS 緩沖液中,室溫封閉1 h,用TBST 漂洗3 次;將NC 膜與兔抗hEGF 抗體(1∶3000 稀釋)于4℃孵育過夜,用TBST 洗滌3 次,再與適當稀釋的酶標記的羊抗兔二抗于37℃反應(yīng)1 h,用TBST 洗滌4 次;ECL 暗室中自動曝光顯影,驗證重組蛋白的抗原性。

    BALB/c3T3 細胞用RPM1640 培養(yǎng)基培養(yǎng),將對數(shù)生長期的細胞按7×103/孔加入96 孔細胞培養(yǎng)板,24 h 后更換成含0.5%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,依次加入用維持培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的EGF,每濃度梯度做3 個平行孔,37℃、5% CO2培養(yǎng)48~72 h,MTT 法檢測各孔的D490nm值,繪制D490nm-EGF濃度關(guān)系圖[3]。

    2 結(jié)果

    2.1 hEGF原核表達載體構(gòu)建

    對含有hEGF 全序列的載體pUC-hEGF 進行擴增后用NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切,回收酶切后的小片段,通過連接酶克隆到表達載體pET-24b 中,篩選陽性克隆,提取質(zhì)粒pET-24b-hEGF,經(jīng)NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定,10 g/L 瓊脂糖電泳結(jié)果顯示,酶切后生成的條帶位于目標大小160 bp處(圖1)。

    2.2 rhEGF的原核表達

    取測序正確的含有質(zhì)粒pET-24b-hEGF 的重組大腸桿菌BL21(DE3)接種含卡那霉素的LB培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng),在菌液D600nm值約為0.4 時加入IPTG誘導(dǎo)表達7 h,離心收集沉淀,超聲波破碎,20%SDS-PAGE 分析目的蛋白的表達量和表達形式。結(jié)果如圖2,在相對分子質(zhì)量6×103處,誘導(dǎo)后有rhEGF明顯表達,其表達量占總蛋白的15%以上,且基本以包涵體的形式存在于超聲波后的沉淀中。

    2.3 rhEGF包涵體的復(fù)性與純化

    圖1 pET-24b-hEGF雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳

    對表達的rhEGF 包涵體用Triton X-100 洗滌,除去脂類和降解的核酸,然后分別用2、4、6、8 mol/L的尿素溶解。SDS-PAGE 檢測發(fā)現(xiàn),在6 mol/L 的尿素溶液里rhEGF 包涵體得到部分溶解,而在8 mol/L的尿素溶液里全部溶解。取變性后的上清液過Q Sepharose Fastflow 陰離子交換柱,用含8 mol/L 尿素的Tris緩沖液(50 mmol/L,pH8.8)+NaCl進行梯度洗脫。當鹽濃度為0.4 mol/L 時洗脫目的蛋白,一步純化的純度達90%以上。對洗脫上清透析復(fù)性,整個透析過程均沒有沉淀產(chǎn)生,復(fù)性率達90%以上。取復(fù)性的rhEGF 經(jīng)SDS-PAGE 分析純度,結(jié)果如圖3,純化復(fù)性后rhEGF的Image軟件掃描純度可達93%。

    2.4 rhEGF的Western印跡與活性分析

    取純化的rhEGF,經(jīng)SDS-PAGE 后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,分別和相應(yīng)的一抗和二抗孵育、洗滌。與ECL 結(jié)合1 min,暗室曝光顯影,結(jié)果如圖4,純化的rhEGF能與其抗體結(jié)合,具有強的抗原性。

    用BALB/c3T3 細胞通過MTT 增殖法測定rhEGF的活性,以生物制品檢定所提供的EGF為陽性對照,陰性對照為培養(yǎng)液,細胞接種數(shù)為7×103/孔。結(jié)果如圖5,rhEGF 活性約為2.5×106U/mL。20~160 ng/mL 的rhEGF 對成纖維細胞具有明顯的促增殖作用,與標準品表現(xiàn)一致,兩者在統(tǒng)計學(xué)分析上無差異。

    3 討論

    圖2 hEGF原核表達形式的SDS-PAGE分析

    圖3 rhEGF純化后的SDS-PAGE分析

    圖4 rhEGF的Western印跡

    圖5 rhEGF對BALB/c3T3細胞的促增殖作用

    諸多因素影響外源基因在原核系統(tǒng)中的表達效率,如外源基因結(jié)構(gòu)、密碼子偏性、mRNA 翻譯起始區(qū)結(jié)構(gòu),目的蛋白的毒性、氨基酸組成,表達條件的優(yōu)化等[4]。成熟hEGF 具有廣泛的生理功能,如加速受傷表皮細胞的修復(fù)和治療胃腸道潰瘍等[5]。目前用原核表達系統(tǒng)生產(chǎn)rhEGF 的表達量非常低。Ferrer-Soler等利用pET-22b載體獲得了單體rhEGF,但表達量很低[6]。為了獲得EGF 單體的高表達量,可對其氨基酸密碼子進行同義置換,改變其mRNA 序列自由能,使其適合原核表達系統(tǒng)的特點。我們采用生物信息學(xué)方法,參照生物軟件Vector NTI Suitor 7.0 對hEGF 核酸序列進行分析和合成,實現(xiàn)其在原核系統(tǒng)內(nèi)的優(yōu)勢表達,表達量約占菌體總蛋白的15%;同時,對rhEGF 包涵體的復(fù)性進行了摸索研究,使包涵體的復(fù)性率達到90%以上。本實驗為進一步研究hEGF的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ),也可為獲得重組蛋白在原核系統(tǒng)的高表達提供借鑒和參考。

    [1]路莉,吳勇杰,高明堂,等.重組人表皮生長生長因子膠囊對大鼠慢性胃潰瘍愈合質(zhì)量的影響[J].中國藥理學(xué)通報,2004,20(1):75-78.

    [2]Bloomer C W,Kenyon L,Hammond E,et al.Cyclooxygenase-2(COX-2) and epidermal growth factor receptor expression in human pituitarymacroadenomas[J].Am J Clin Oncol,2003,26(4):75-80.

    [3]鄭敏,嚴莉,黃清松.EGF 在比赤酵母中的表達及活性測定[J].解剖學(xué)研究,2013,35(1):36-38.

    [4]楊吉吉,李太華.大腸桿菌中外源基因表達的研究進展[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進展,2000,28(2):69-72.

    [5]Loot M A,Kenter S B,Au F L,et al.Fibroblasts derived from chronic diabetic ulcers differ in their response to stimulation with EGF,IGF-I,BFGF,and PDGF-AB compared to controls[J].Eur J Cell Biol,2002,81(3):153-160.

    [6]Ferrer-Soler L,Cedano J,Querol E,et al.Cloning,expression and purification of human epidermal growth factor using different expression systems[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2003,788:113-123.

    猜你喜歡
    復(fù)性原核密碼子
    密碼子與反密碼子的本質(zhì)與拓展
    10種藏藥材ccmFN基因片段密碼子偏好性分析
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:10
    結(jié)核分枝桿菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表達、純化及ELISPOT檢測方法的建立與應(yīng)用
    癌癥標記蛋白 AGR2的原核表達及純化
    牛分支桿菌HBHA基因的克隆及原核表達
    籽骨嵌頓致難復(fù)性[足母]趾趾間關(guān)節(jié)脫位的治療
    人巨細胞病毒pp150-gp52蛋白原核可溶性表達與IgM捕獲ELISA方法建立和應(yīng)用
    嗜酸熱古菌病毒STSV2密碼子偏嗜性及其對dUTPase外源表達的影響
    《復(fù)性書》性情觀再探——以“情”為中心的考察
    中藥坐浴方聯(lián)合激光燒灼療法治療易復(fù)性肛周尖銳濕疣術(shù)后47例
    久久99热这里只频精品6学生 | 床上黄色一级片| 国产精品久久久久久久电影| 国产毛片a区久久久久| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 日韩精品有码人妻一区| 欧美性感艳星| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产日韩欧美在线精品| 国产高潮美女av| 亚洲av男天堂| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日本三级黄在线观看| av在线亚洲专区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 男女边吃奶边做爰视频| 久99久视频精品免费| 日韩视频在线欧美| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲自偷自拍三级| 国产淫片久久久久久久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 精品久久久噜噜| 国产成人aa在线观看| 亚洲成人av在线免费| 特级一级黄色大片| www.av在线官网国产| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 国产一区二区亚洲精品在线观看| 一个人免费在线观看电影| 毛片一级片免费看久久久久| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久久久性生活片| 日本三级黄在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 黄色日韩在线| 日韩欧美精品v在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 51国产日韩欧美| 国产淫语在线视频| 日本五十路高清| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲人与动物交配视频| 可以在线观看毛片的网站| 身体一侧抽搐| 国产精品一区二区三区四区久久| 精品人妻熟女av久视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 国产成年人精品一区二区| 久久久久九九精品影院| 国产欧美日韩精品一区二区| 只有这里有精品99| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 特大巨黑吊av在线直播| 一个人看的www免费观看视频| 草草在线视频免费看| 久久韩国三级中文字幕| 日本一本二区三区精品| 精品熟女少妇av免费看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 日日撸夜夜添| 男人的好看免费观看在线视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 国产精品久久久久久av不卡| 观看免费一级毛片| 22中文网久久字幕| 一个人免费在线观看电影| 国产精品久久久久久久久免| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲av男天堂| 国产精品一区www在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产爱豆传媒在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 特大巨黑吊av在线直播| 天堂中文最新版在线下载 | 我的老师免费观看完整版| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产人妻一区二区三区在| a级一级毛片免费在线观看| 日日啪夜夜撸| 欧美zozozo另类| 内地一区二区视频在线| 在线天堂最新版资源| 久久精品人妻少妇| 黄色日韩在线| 亚洲经典国产精华液单| 久久欧美精品欧美久久欧美| 婷婷色综合大香蕉| 国产视频首页在线观看| videossex国产| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产淫片久久久久久久久| 国产 一区 欧美 日韩| 看免费成人av毛片| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产极品精品免费视频能看的| 国产三级中文精品| 久久久久久伊人网av| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久国产乱子免费精品| 国产成人免费观看mmmm| 高清av免费在线| 男女边吃奶边做爰视频| 免费搜索国产男女视频| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 看片在线看免费视频| 一级黄色大片毛片| 中文欧美无线码| 久久精品影院6| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久精品国产自在天天线| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲国产精品国产精品| 国产成人freesex在线| av免费观看日本| 色哟哟·www| 国产精华一区二区三区| 日韩成人伦理影院| 七月丁香在线播放| 国产精品一二三区在线看| 久久久久国产网址| 久久久久久久久久黄片| 国产单亲对白刺激| av天堂中文字幕网| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 女人被狂操c到高潮| 三级经典国产精品| 国产男人的电影天堂91| 超碰97精品在线观看| 三级经典国产精品| 国产视频首页在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 中文字幕av成人在线电影| 日本av手机在线免费观看| 国产av一区在线观看免费| 精品一区二区三区人妻视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 日韩视频在线欧美| 色噜噜av男人的天堂激情| 搡老妇女老女人老熟妇| 青春草国产在线视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 黑人高潮一二区| 日韩高清综合在线| 能在线免费观看的黄片| 韩国av在线不卡| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 婷婷色麻豆天堂久久 | 精品人妻一区二区三区麻豆| 看十八女毛片水多多多| 又粗又爽又猛毛片免费看| 五月伊人婷婷丁香| 国产av不卡久久| 日本av手机在线免费观看| 一级黄片播放器| 秋霞伦理黄片| 寂寞人妻少妇视频99o| 美女黄网站色视频| 一区二区三区免费毛片| 99热这里只有精品一区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲精品,欧美精品| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲国产色片| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲精品乱久久久久久| 日本一二三区视频观看| 可以在线观看毛片的网站| 日本午夜av视频| 免费观看的影片在线观看| 人人妻人人看人人澡| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美丝袜亚洲另类| 色综合色国产| or卡值多少钱| 亚洲人成网站高清观看| 26uuu在线亚洲综合色| 久久久久网色| 在线观看66精品国产| 国产精品三级大全| 国产大屁股一区二区在线视频| 日日啪夜夜撸| 一区二区三区免费毛片| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 欧美3d第一页| 日韩在线高清观看一区二区三区| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲av.av天堂| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产精品蜜桃在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 大香蕉久久网| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 亚洲国产最新在线播放| 国产午夜精品论理片| 亚洲美女视频黄频| 美女高潮的动态| 高清午夜精品一区二区三区| 久久99热这里只频精品6学生 | 久久久久久久久大av| 熟女人妻精品中文字幕| 国产熟女欧美一区二区| 成人午夜高清在线视频| 欧美日韩国产亚洲二区| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲图色成人| 日本午夜av视频| 成人av在线播放网站| 伦理电影大哥的女人| 国产成人福利小说| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 日韩大片免费观看网站 | 国产爱豆传媒在线观看| 春色校园在线视频观看| 国产精品一区二区在线观看99 | 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 哪个播放器可以免费观看大片| 伦理电影大哥的女人| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲三级黄色毛片| 日韩人妻高清精品专区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 久久久成人免费电影| 能在线免费看毛片的网站| 真实男女啪啪啪动态图| 国产一级毛片七仙女欲春2| 精品久久国产蜜桃| 国产乱来视频区| 欧美人与善性xxx| 色噜噜av男人的天堂激情| 午夜老司机福利剧场| 欧美一级a爱片免费观看看| 午夜福利高清视频| 日韩av在线大香蕉| 天天一区二区日本电影三级| 一级二级三级毛片免费看| 国产免费又黄又爽又色| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 人妻夜夜爽99麻豆av| 色播亚洲综合网| 久久久欧美国产精品| 亚洲av免费在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日韩欧美精品v在线| 久99久视频精品免费| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲av一区综合| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产精品人妻久久久影院| 中文字幕亚洲精品专区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产精品熟女久久久久浪| 少妇高潮的动态图| 视频中文字幕在线观看| 色5月婷婷丁香| 久久久久久久久久黄片| 中文在线观看免费www的网站| 深夜a级毛片| 午夜爱爱视频在线播放| 人妻夜夜爽99麻豆av| 97热精品久久久久久| 国产免费男女视频| 淫秽高清视频在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| av国产免费在线观看| 久久久久性生活片| 欧美又色又爽又黄视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 大话2 男鬼变身卡| 国产精品熟女久久久久浪| 在线观看66精品国产| 国产高清有码在线观看视频| 日韩国内少妇激情av| 久久久精品94久久精品| 国产在线男女| 国产精品三级大全| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩三级伦理在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲精品乱久久久久久| 国产高清三级在线| 国产精品,欧美在线| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美日韩精品成人综合77777| 一级黄片播放器| 欧美精品一区二区大全| 国产精品一区www在线观看| 日本免费在线观看一区| 久久国内精品自在自线图片| 高清午夜精品一区二区三区| 男人的好看免费观看在线视频| 国语自产精品视频在线第100页| 日本免费a在线| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久久久久国产a免费观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产成人免费观看mmmm| 国产综合懂色| 国产私拍福利视频在线观看| 久久人妻av系列| 久久这里只有精品中国| 国产在线一区二区三区精 | 国产69精品久久久久777片| 久久热精品热| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产成人精品久久久久久| 丰满少妇做爰视频| 日本免费在线观看一区| 亚洲av免费高清在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 内射极品少妇av片p| av在线天堂中文字幕| 国产又色又爽无遮挡免| 99九九线精品视频在线观看视频| 伦精品一区二区三区| 男女国产视频网站| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 成人漫画全彩无遮挡| 中文字幕av在线有码专区| 高清av免费在线| 国产色婷婷99| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 高清日韩中文字幕在线| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产一区有黄有色的免费视频 | 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 麻豆一二三区av精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 淫秽高清视频在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 青青草视频在线视频观看| 在线播放无遮挡| 色综合站精品国产| 看片在线看免费视频| 97在线视频观看| 麻豆一二三区av精品| 久久精品综合一区二区三区| 成人午夜精彩视频在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美日本视频| 观看美女的网站| 久久久久久久久久成人| 欧美激情在线99| 免费无遮挡裸体视频| 色播亚洲综合网| 看十八女毛片水多多多| 插阴视频在线观看视频| 大话2 男鬼变身卡| 51国产日韩欧美| 波多野结衣高清无吗| 人妻系列 视频| 国产精品国产三级专区第一集| a级毛色黄片| 免费看a级黄色片| 欧美丝袜亚洲另类| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品永久免费网站| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日本一本二区三区精品| 有码 亚洲区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 免费观看人在逋| 国产精品乱码一区二三区的特点| 六月丁香七月| 永久网站在线| 国产麻豆成人av免费视频| 婷婷色麻豆天堂久久 | 国产成人91sexporn| 亚洲国产精品国产精品| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 日韩欧美三级三区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 丝袜美腿在线中文| 99视频精品全部免费 在线| 国产亚洲精品久久久com| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲成人久久爱视频| 日日啪夜夜撸| 午夜福利成人在线免费观看| 国产私拍福利视频在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 免费观看在线日韩| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲精品456在线播放app| 看非洲黑人一级黄片| 在线播放国产精品三级| 欧美精品国产亚洲| 91精品一卡2卡3卡4卡| 偷拍熟女少妇极品色| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 插阴视频在线观看视频| 22中文网久久字幕| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲伊人久久精品综合 | 日韩人妻高清精品专区| 久久久色成人| 大话2 男鬼变身卡| 最近的中文字幕免费完整| 永久网站在线| 亚洲精品国产av成人精品| av在线蜜桃| 国产成人aa在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲不卡免费看| 日韩欧美三级三区| 人人妻人人看人人澡| 一夜夜www| 黄色配什么色好看| 日韩高清综合在线| 日韩人妻高清精品专区| 51国产日韩欧美| av在线蜜桃| 久久久久久久久大av| 深爱激情五月婷婷| 色尼玛亚洲综合影院| 久久精品夜色国产| 我的老师免费观看完整版| 亚洲成人久久爱视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 91精品国产九色| 国产成人91sexporn| 99热精品在线国产| 超碰av人人做人人爽久久| 大香蕉久久网| 男人和女人高潮做爰伦理| 男人舔奶头视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 日本wwww免费看| 日本一本二区三区精品| or卡值多少钱| 看十八女毛片水多多多| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲真实伦在线观看| 18禁动态无遮挡网站| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲最大成人av| 国产精品国产高清国产av| 国产精华一区二区三区| 国产亚洲5aaaaa淫片| 中文字幕免费在线视频6| 国产精品,欧美在线| 午夜视频国产福利| 日日干狠狠操夜夜爽| 熟女电影av网| 麻豆乱淫一区二区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 日本免费一区二区三区高清不卡| 婷婷色av中文字幕| 丰满人妻一区二区三区视频av| 天堂影院成人在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 成年av动漫网址| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲三级黄色毛片| 日本av手机在线免费观看| 99视频精品全部免费 在线| 乱系列少妇在线播放| 91av网一区二区| 级片在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| av天堂中文字幕网| 午夜激情欧美在线| 久久这里只有精品中国| 免费一级毛片在线播放高清视频| 欧美激情在线99| 亚洲av日韩在线播放| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品一及| 亚洲欧美成人精品一区二区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲av中文av极速乱| 中文字幕制服av| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品99久久久久久久久| 美女cb高潮喷水在线观看| 午夜日本视频在线| 在线播放国产精品三级| 日韩强制内射视频| 亚洲成人av在线免费| 少妇人妻精品综合一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 99久久精品一区二区三区| 国产黄片视频在线免费观看| 大话2 男鬼变身卡| 国产精品蜜桃在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久久色成人| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品电影一区二区三区| 成人午夜高清在线视频| 91久久精品电影网| 内地一区二区视频在线| 男女国产视频网站| 精品不卡国产一区二区三区| 国产视频内射| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲,欧美,日韩| 午夜福利视频1000在线观看| 国产一区二区三区av在线| 亚洲av成人精品一区久久| 午夜亚洲福利在线播放| 国产成人精品久久久久久| 久久草成人影院| 天堂√8在线中文| 亚洲欧美日韩东京热| 99在线视频只有这里精品首页| 五月伊人婷婷丁香| 可以在线观看毛片的网站| 卡戴珊不雅视频在线播放| 中文字幕av成人在线电影| 别揉我奶头 嗯啊视频| 淫秽高清视频在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 久久99热6这里只有精品| 在线免费观看的www视频| 欧美+日韩+精品| 老司机影院成人| 五月伊人婷婷丁香| 秋霞伦理黄片| 午夜福利在线观看吧| 欧美又色又爽又黄视频| 久久人妻av系列| 搡老妇女老女人老熟妇| 成人毛片a级毛片在线播放| 午夜福利成人在线免费观看| 久久久久久久午夜电影| 国产老妇女一区| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲av成人av| 国产精品国产高清国产av| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 丰满少妇做爰视频| 国产真实伦视频高清在线观看| 青春草视频在线免费观看| 69av精品久久久久久| av在线蜜桃| 九九爱精品视频在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 成年女人看的毛片在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 九九热线精品视视频播放| 国产熟女欧美一区二区| 极品教师在线视频| 精品久久国产蜜桃| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 特级一级黄色大片| 国产真实乱freesex| 亚洲伊人久久精品综合 | 久久久久久久午夜电影| 熟女电影av网| 特大巨黑吊av在线直播| 九九热线精品视视频播放| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产精品一及| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲欧美一区二区三区国产| 免费电影在线观看免费观看| 久久鲁丝午夜福利片| 午夜激情福利司机影院| 国产精品,欧美在线| 九草在线视频观看| 久久久久性生活片| 亚洲国产欧美在线一区| 大香蕉久久网| 国产精品一二三区在线看| 国产免费又黄又爽又色| 22中文网久久字幕| 在线播放国产精品三级| 亚洲av一区综合| 国产爱豆传媒在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 天美传媒精品一区二区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产乱人偷精品视频| 视频中文字幕在线观看| 久久热精品热| 观看免费一级毛片| 日日摸夜夜添夜夜爱|