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    人表皮生長因子的原核優(yōu)勢表達與復(fù)性

    2015-11-29 08:31:44孫衛(wèi)國楊栗坤熊志紅楊秉芬劉艷華張靈霞
    生物技術(shù)通訊 2015年5期
    關(guān)鍵詞:復(fù)性原核密碼子

    孫衛(wèi)國,楊栗坤,熊志紅,楊秉芬,劉艷華,張靈霞

    解放軍第309醫(yī)院 結(jié)核病研究所,全軍結(jié)核病防治重點實驗室,北京 100091

    人表皮生長因子(human epidermal growth factor,hEGF)是由53 個氨基酸殘基組成的單鏈多肽,廣泛存在于人體各種組織內(nèi)。人體內(nèi)EGF含量不足易導(dǎo)致一系列的病理變化,如胃腸道潰瘍病,而補充外源性EGF 能大大縮短慢性胃潰瘍的療程[1]。EGF表達過量增加鳥氨酸脫羧酶的活性及多胺水平,也與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[2]。hEGF能促進燒傷、創(chuàng)傷及外科傷口的愈合,在燒傷、創(chuàng)傷、皮膚和角膜移植、外傷性皮膚潰瘍等治療中有重要作用。EGF也是某些化妝品的添加劑,具有較大的市場價值。目前利用原核系統(tǒng)表達重組hEGF(rhEGF)的主要弊端是表達量較低,生物活性不高,很難規(guī)?;a(chǎn)。我們根據(jù)原核表達系統(tǒng)特點,優(yōu)化影響rhEGF表達量的諸多因素,對基因核酸序列的mRNA 結(jié)構(gòu)、密碼子偏愛性,表達宿主菌的生長狀態(tài)進行綜合考慮,通過同義密碼子置換合成hEGF 全基因序列,構(gòu)建原核表達載體pET-24b-hEGF,獲得hEGF 在原核系統(tǒng)內(nèi)的高表達,其表達量占菌體總蛋白的15%左右。經(jīng)過復(fù)性條件的優(yōu)化,包涵體的復(fù)性率達90%以上,為原核系統(tǒng)規(guī)?;a(chǎn)rhEGF打下了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    BALB/c3T3 細胞,大腸桿菌BL21(DE3)和載體pET24b 由本室保存;EGF 標準品由中國藥品生物制品檢定所提供;優(yōu)化后的hEGF編碼序列和測序由北京華大基因生物工程公司合成;酵母提取物、胰蛋白胨購自O(shè)xoid 公司;hEGF 抗體購自ABcam 公司;酶標羊抗兔IgG(HRP 標記)購自中杉生物工程技術(shù)公司;MTT 購自Sigma 公司;親和色譜填料購自GE 公司;其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 hEGF全基因序列優(yōu)化與合成

    根據(jù)生物軟件對hEGF可能表達量的預(yù)測,對其編碼序列按同義密碼子進行全合成,使mRNA 的二級結(jié)構(gòu)自由能滿足最優(yōu)表達需要,同時3′端加入大腸桿菌偏好終止密碼子TAA。合成的全序列為:AACAGCGACTCTGAATGCCCGCTGTCCCACGATGGTTACTGCCT GCATGATGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTATG CATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGTGAGCGTTGCCAGTAC CGTGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGC。

    1.3 hEGF基因克隆與表達

    對合成的含有hEGF 全序列載體pUC-hEGF 以限制性內(nèi)切酶NdeⅠ/XhoⅠ于37℃酶切10 h,瓊脂糖膠回收酶切后小片段,與經(jīng)同樣雙酶切的表達載體pET-24b 在T4DNA 連接酶的作用下于16℃連接4 h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)后,挑選陽性克隆測序,取測序結(jié)果同預(yù)期結(jié)果完全一致的菌落保存。將攜帶有hEGF 序列的原核表達載體命名為pET-24b-hEGF。

    將陽性菌落接種含卡那霉素的LB 培養(yǎng)基,37℃振搖過夜活化后,按1∶100 的比例重新接種LB 培養(yǎng)基,檢測細菌的生長密度,當菌液D600nm達0.4 時,加入IPTG 使其終濃度為0.3 mmol/L,37℃誘導(dǎo)表達7 h,離心收集沉淀菌體,加入PBS緩沖液混勻,冰浴超聲波破碎,表達菌液加入5×上樣緩沖液,煮沸后取20 μL 進行20% SDS-PAGE,分析目的蛋白在原核系統(tǒng)內(nèi)的表達量和表達形式。

    1.4 rhEGF包涵體的復(fù)性與純化

    電泳鑒定rhEGF 在原核系統(tǒng)中以包涵體的形式生成,對包涵體進行初步純化。收集rhEGF 沉淀包涵體,用1%的Triton X-100 洗滌3 次,4℃、5000 r/min 離心10 min;室溫條件下取rhEGF 包涵體,以含8 mol/L 尿素的Tris 緩沖液(50 mmol/L,pH8.8)溶解,高速離心后取溶液上清過Q Sepharose Fastflow陰離子交換柱,并用含8 mol/L 尿素的Tris 緩沖液(50 mmol/L,pH8.8)+NaCl 進行梯度洗脫,分別收集穿過峰和各洗脫峰蛋白;采用透析復(fù)性的方法對rhEGF 包涵體進行復(fù)性,將純化的包涵體尿素溶液以含5 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSG 的Tris 緩沖液(50 mmol/L,pH8.8)在4℃條件下以1∶20 的體積進行透析,12 h 更換透析液一次,透析5 次后以50 mmol/L Tris 緩沖液(pH8.8)透析,整個透析過程均沒有沉淀產(chǎn)生;取透析后復(fù)性的rhEGF進行SDS-PAGE分析。

    1.5 rhEGF的Western印跡與活性檢測

    取純化的rhEGF 行20%的SDS-PAGE,電轉(zhuǎn)移后將硝酸纖維素膜(NC 膜)置于含5%脫脂奶粉的PBS 緩沖液中,室溫封閉1 h,用TBST 漂洗3 次;將NC 膜與兔抗hEGF 抗體(1∶3000 稀釋)于4℃孵育過夜,用TBST 洗滌3 次,再與適當稀釋的酶標記的羊抗兔二抗于37℃反應(yīng)1 h,用TBST 洗滌4 次;ECL 暗室中自動曝光顯影,驗證重組蛋白的抗原性。

    BALB/c3T3 細胞用RPM1640 培養(yǎng)基培養(yǎng),將對數(shù)生長期的細胞按7×103/孔加入96 孔細胞培養(yǎng)板,24 h 后更換成含0.5%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,依次加入用維持培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的EGF,每濃度梯度做3 個平行孔,37℃、5% CO2培養(yǎng)48~72 h,MTT 法檢測各孔的D490nm值,繪制D490nm-EGF濃度關(guān)系圖[3]。

    2 結(jié)果

    2.1 hEGF原核表達載體構(gòu)建

    對含有hEGF 全序列的載體pUC-hEGF 進行擴增后用NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切,回收酶切后的小片段,通過連接酶克隆到表達載體pET-24b 中,篩選陽性克隆,提取質(zhì)粒pET-24b-hEGF,經(jīng)NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定,10 g/L 瓊脂糖電泳結(jié)果顯示,酶切后生成的條帶位于目標大小160 bp處(圖1)。

    2.2 rhEGF的原核表達

    取測序正確的含有質(zhì)粒pET-24b-hEGF 的重組大腸桿菌BL21(DE3)接種含卡那霉素的LB培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng),在菌液D600nm值約為0.4 時加入IPTG誘導(dǎo)表達7 h,離心收集沉淀,超聲波破碎,20%SDS-PAGE 分析目的蛋白的表達量和表達形式。結(jié)果如圖2,在相對分子質(zhì)量6×103處,誘導(dǎo)后有rhEGF明顯表達,其表達量占總蛋白的15%以上,且基本以包涵體的形式存在于超聲波后的沉淀中。

    2.3 rhEGF包涵體的復(fù)性與純化

    圖1 pET-24b-hEGF雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳

    對表達的rhEGF 包涵體用Triton X-100 洗滌,除去脂類和降解的核酸,然后分別用2、4、6、8 mol/L的尿素溶解。SDS-PAGE 檢測發(fā)現(xiàn),在6 mol/L 的尿素溶液里rhEGF 包涵體得到部分溶解,而在8 mol/L的尿素溶液里全部溶解。取變性后的上清液過Q Sepharose Fastflow 陰離子交換柱,用含8 mol/L 尿素的Tris緩沖液(50 mmol/L,pH8.8)+NaCl進行梯度洗脫。當鹽濃度為0.4 mol/L 時洗脫目的蛋白,一步純化的純度達90%以上。對洗脫上清透析復(fù)性,整個透析過程均沒有沉淀產(chǎn)生,復(fù)性率達90%以上。取復(fù)性的rhEGF 經(jīng)SDS-PAGE 分析純度,結(jié)果如圖3,純化復(fù)性后rhEGF的Image軟件掃描純度可達93%。

    2.4 rhEGF的Western印跡與活性分析

    取純化的rhEGF,經(jīng)SDS-PAGE 后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,分別和相應(yīng)的一抗和二抗孵育、洗滌。與ECL 結(jié)合1 min,暗室曝光顯影,結(jié)果如圖4,純化的rhEGF能與其抗體結(jié)合,具有強的抗原性。

    用BALB/c3T3 細胞通過MTT 增殖法測定rhEGF的活性,以生物制品檢定所提供的EGF為陽性對照,陰性對照為培養(yǎng)液,細胞接種數(shù)為7×103/孔。結(jié)果如圖5,rhEGF 活性約為2.5×106U/mL。20~160 ng/mL 的rhEGF 對成纖維細胞具有明顯的促增殖作用,與標準品表現(xiàn)一致,兩者在統(tǒng)計學(xué)分析上無差異。

    3 討論

    圖2 hEGF原核表達形式的SDS-PAGE分析

    圖3 rhEGF純化后的SDS-PAGE分析

    圖4 rhEGF的Western印跡

    圖5 rhEGF對BALB/c3T3細胞的促增殖作用

    諸多因素影響外源基因在原核系統(tǒng)中的表達效率,如外源基因結(jié)構(gòu)、密碼子偏性、mRNA 翻譯起始區(qū)結(jié)構(gòu),目的蛋白的毒性、氨基酸組成,表達條件的優(yōu)化等[4]。成熟hEGF 具有廣泛的生理功能,如加速受傷表皮細胞的修復(fù)和治療胃腸道潰瘍等[5]。目前用原核表達系統(tǒng)生產(chǎn)rhEGF 的表達量非常低。Ferrer-Soler等利用pET-22b載體獲得了單體rhEGF,但表達量很低[6]。為了獲得EGF 單體的高表達量,可對其氨基酸密碼子進行同義置換,改變其mRNA 序列自由能,使其適合原核表達系統(tǒng)的特點。我們采用生物信息學(xué)方法,參照生物軟件Vector NTI Suitor 7.0 對hEGF 核酸序列進行分析和合成,實現(xiàn)其在原核系統(tǒng)內(nèi)的優(yōu)勢表達,表達量約占菌體總蛋白的15%;同時,對rhEGF 包涵體的復(fù)性進行了摸索研究,使包涵體的復(fù)性率達到90%以上。本實驗為進一步研究hEGF的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ),也可為獲得重組蛋白在原核系統(tǒng)的高表達提供借鑒和參考。

    [1]路莉,吳勇杰,高明堂,等.重組人表皮生長生長因子膠囊對大鼠慢性胃潰瘍愈合質(zhì)量的影響[J].中國藥理學(xué)通報,2004,20(1):75-78.

    [2]Bloomer C W,Kenyon L,Hammond E,et al.Cyclooxygenase-2(COX-2) and epidermal growth factor receptor expression in human pituitarymacroadenomas[J].Am J Clin Oncol,2003,26(4):75-80.

    [3]鄭敏,嚴莉,黃清松.EGF 在比赤酵母中的表達及活性測定[J].解剖學(xué)研究,2013,35(1):36-38.

    [4]楊吉吉,李太華.大腸桿菌中外源基因表達的研究進展[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進展,2000,28(2):69-72.

    [5]Loot M A,Kenter S B,Au F L,et al.Fibroblasts derived from chronic diabetic ulcers differ in their response to stimulation with EGF,IGF-I,BFGF,and PDGF-AB compared to controls[J].Eur J Cell Biol,2002,81(3):153-160.

    [6]Ferrer-Soler L,Cedano J,Querol E,et al.Cloning,expression and purification of human epidermal growth factor using different expression systems[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2003,788:113-123.

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