紀(jì)貝貝 ,趙暉,徐小潔,梁迎春,黃蓉,范忠義,李玲,郭靖,洪甜,冀全博,葉棋濃,杜楠
1.解放軍總醫(yī)院 第一附屬醫(yī)院,北京 100048;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100850
自噬是指胞漿內(nèi)大分子物質(zhì)和細(xì)胞器在膜包囊泡中大量降解的生物學(xué)過程,具有維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞生存的作用,然而過度自噬則可引起細(xì)胞死亡,即“自噬性細(xì)胞死亡”,也稱為Ⅱ型程序化細(xì)胞死亡[1]。迄今,已有31 個自噬相關(guān)基因(autophagy related gene,ATG)相繼被發(fā)現(xiàn)[2],其中的自噬相關(guān)基因5(autophagy related gene 5,ATG5)是形成自噬體的重要基因[3]。自噬體的形成主要通過2 個泛素樣連接系統(tǒng)介導(dǎo),即ATG12-ATG5 和ATG8-PE,同時它們之間也互相影響[4],ATG5通過酶促級聯(lián),這一過程需要E1(ATG7)E2(ATG10)酶催化形成ATG5 和ATG12 結(jié)合復(fù)合物,而這一復(fù)合物對自噬的形成具有重要調(diào)控作用[5]。
有研究表明,敲除ATG5 基因后可明顯抑制自噬的形成[6-7],由此可見ATG5 在自噬的形成及發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本實驗擬構(gòu)建ATG5 的真核表達(dá)載體,并驗證其與Myc-ATG12 的相互作用,為進(jìn)一步探討ATG5與自噬的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
人胚腎293T 細(xì)胞由本室傳代培養(yǎng);pcDNA3-Flag載體為本實驗室保存;VigoFect為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶、PCR 試劑均購自TaKaRa 公司;上、下游引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成;質(zhì)粒提取、膠回收、PCR 回收試劑盒購自Promega 公司;HRP 標(biāo)記的抗Flag 標(biāo)簽鼠單克隆抗體(Flag-HRP)購自Sigma 公司;DMEM 及小牛血清均購自Gibco 公司;測序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。
以人乳腺文庫為模板,根據(jù)文獻(xiàn)報道[8]的ATG5的編碼序列合成上游引物(5'-CGGGATCCATGAC AGATGACAAAGATGTGC-3')和下游引物(5'-CCG CTCGAGTCAATCTGTTGGCTGTGGGATG-3'),PCR擴(kuò)增人ATG5的編碼序列(95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,30 個循環(huán);72℃延長7 min),用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。
將PCR 片段回收后用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切,形成帶有粘端的雙鏈,用T4DNA連接酶與經(jīng)同樣雙酶切的pcDNA3-Flag 載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑選克隆,振蕩培養(yǎng)并提質(zhì)粒,用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定,酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。
按常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用不含雙抗、含100 mL/L 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將人胚腎293T 細(xì)胞接種于6 cm 皿中,接種量以轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到80%為宜,培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染前1 h 換液。將4 μL VigoFect與200 μL NaCl混合,再將總量為10 μg 的重組質(zhì)粒與200 μL NaCl 混合,然后將上述2 種溶液輕輕混合,室溫放置15 min,加入6 cm皿中(以同樣方法轉(zhuǎn)染空pcDNA3-Flag 載體作為對照),37℃、50 mL/L CO2常規(guī)培養(yǎng),4~6 h 換液,轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞蛋白,加入2×SDS 加樣緩沖液煮沸10 min,高速離心2 min,取上清液行SDS-PAGE后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜,加入用5%脫脂奶粉以1∶5000 稀釋的用HRP 標(biāo)記的抗Flag 標(biāo)簽鼠單克隆抗體,室溫輕搖1 h,TBST 洗膜3 次,每次5 min,化學(xué)發(fā)光法顯色5 min,壓片顯影。
將人胚腎293T 細(xì)胞接種于6 cm 皿中,用重組Flag-ATG5 與Myc-ATG12 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后4~6 h換液,常規(guī)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞,加入IP裂解緩沖液[0.02 mol/L Tris(pH8.0),0.05 mol/L NaCl,0.005 mol/L NP-40,0.01 mol/L EDTA)]后與Flag-Beads在4℃結(jié)合4~6 h,3000 r/min離心5 min,經(jīng)IP緩沖液再次漂洗后,加入與Flag-Beads 等量的2×SDS 加樣緩沖液,煮沸10 min,12 000 r/min 離心2 min,取上清液行SDS-PAGE 后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h,加入用5%脫脂奶粉以1∶5000 稀釋的用HRP 標(biāo)記的抗Flag 標(biāo)簽鼠單克隆抗體,室溫輕搖1 h,TBST 洗膜3 次,每次5 min,化學(xué)發(fā)光法顯色,5 min后壓片顯影。
以實驗室保存的人乳腺文庫為模板,PCR 擴(kuò)增人ATG5 的編碼序列,獲得約820 bp 的DNA 片段,與預(yù)期片段一致(圖1A);將PCR 產(chǎn)物用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的pcDNA3-Flag 載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑選克隆,經(jīng)菌液PCR鑒定得到陽性重組克?。粚⑺藐栃钥寺√豳|(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定,可切出2 條長度分別約為5000 和820 bp的條帶,而相應(yīng)的空載體酶切只見大片段,符合預(yù)期結(jié)果(圖1B);測序結(jié)果表明,插入片段的DNA 序列與人ATG5基因的編碼序列完全一致(數(shù)據(jù)略)。
將構(gòu)建的Flag-ATG5重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞系,24 h 后提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,Western 印跡檢測Flag-ATG5 蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后,用Flag-HRP 抗體能夠在相對分子質(zhì)量約33×103處檢測到明顯的特異性條帶,空載體無條帶(圖2)。說明Flag-ATG5 重組蛋白在293T細(xì)胞中能夠正確表達(dá)。
圖1 PCR擴(kuò)增人ATG5的編碼序列(A)及重組質(zhì)粒Flag-ATG5的BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳圖譜(B)
根據(jù)文獻(xiàn)報道,ATG5 可與ATG12 相互作用。為進(jìn)一步證實所構(gòu)建的Flag-ATG5 重組質(zhì)粒正確,且能夠表達(dá)正確的融合蛋白,我們將重組Flag-ATG5 質(zhì)粒與Myc-ATG12 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞,24 h 常規(guī)培養(yǎng)后收集蛋白,免疫共沉淀分析顯示Flag-ATG5 融合蛋白與Myc-ATG12 蛋白具有相互作用,而Flag 空載體在同一位置無此條帶,表明ATG5 與ATG12 蛋白能夠在體內(nèi)特異地相互作用,而Flag 標(biāo)簽不影響ATG5 的結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能(圖3)。進(jìn)一步證明構(gòu)建的重組Flag-ATG5 質(zhì)粒正確,且能夠正常表達(dá)。
圖2 Western印跡檢測Flag-ATG5的表達(dá)
圖3 免疫共沉淀分析驗證重組ATG5與ATG12在蛋白水平上具有相互作用
自噬是真核生物所特有的生命現(xiàn)象,是細(xì)胞通過溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì),并以此保持細(xì)胞代謝的平衡和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。這一過程可以促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖,自噬的整個過程受自噬相關(guān)基因的調(diào)控[9]。細(xì)胞自噬既能在細(xì)胞應(yīng)對不良環(huán)境刺激時作為一種防御機(jī)制實現(xiàn)自我保護(hù),同時在腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、病原體感染、衰老等多種疾病的發(fā)生過程中起到重要作用[10]。近年來的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)自噬與腫瘤存在密切關(guān)聯(lián),針對二者關(guān)系的研究已受到腫瘤學(xué)者的廣泛關(guān)注[11]。
細(xì)胞自噬大致分為3 個階段[12-13]:第一階段為起始階段(細(xì)胞接受刺激信號);第二階段為自噬體形成(ATG12-ATG5 和ATG8-PE 復(fù)合體2 種泛素樣結(jié)合系統(tǒng));第三階段為自噬溶酶體的形成及內(nèi)容物的降解,而自噬體膜脫落再循環(huán)利用。由此可知,ATG5在自噬體的形成中占有重要地位,同時研究發(fā)現(xiàn)ATG5 作為細(xì)胞自噬和凋亡的轉(zhuǎn)換開關(guān),在自噬的發(fā)生和發(fā)展中起重要的調(diào)控功能[14],在自噬泡形成的早期階段有ATG12-ATG5-ATG16L復(fù)合物與其外膜結(jié)合[7,15],這種結(jié)合促進(jìn)了自噬泡的伸展擴(kuò)張,使之由開始的小囊泡發(fā)展為半環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
Chen 等[16]發(fā)現(xiàn),TECPR1 在ATG5-ATG12 復(fù)合體的形成中發(fā)揮重要作用,進(jìn)而在很大程度上影響自噬體的形成。這也提示我們ATG5 在整個自噬過程中的重要作用。本實驗構(gòu)建的Flag-ATG5在真核細(xì)胞中獲得了表達(dá),表達(dá)的融合蛋白的功能得到初步驗證。ATG5在真核細(xì)胞中的成功表達(dá),是繼續(xù)深入研究其在自噬中的作用機(jī)制,以及探討其利用價值的基礎(chǔ)。
[1]Mizushima N.Autophagy:process and function[J].Genes Dev,2007,21(22):2861-2873.
[2]Levine B,Yuan J.Autophagy in cell death:an innocent convict[J]? J Clin Invest,2005,115(10):2679-2688.
[3]Ravikumar B,Vacher C,Berger Z,et al.Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity oF polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease[J].Nat Genet,2004,36(6):585-595.
[4]Yang Y P,Liang Z Q,Gu Z L,et al.Molecular mechanism and regulation of autophagy[J].Acta Pharmacol Sin,2005,26(12):1421-1434.
[5]Hurley J H,Schulman B A.Atomistic autophagy:the structures of cellular selF-digestion[J].Cell,2014,157(2):300-311.
[6]Matsushita M,Suzuki N N,Obara K,et al.Structure of Atg5.Atg16,a complex essential for autophagy[J].J Biol Chem,2007,282(9):6763-6772.
[7]Williams R A,Smith T K,Cull B,et al.ATG5 is essential for ATG8-dependent autophagy and mitochondrial homeostasis in Leishmania major[J].PLoS Pathog,2012,8(5):e1002695.
[8]趙勇,栗文彬,師長宏,等.自噬相關(guān)基因Atg5 的原核表達(dá)及多克隆抗體制備[J].生物技術(shù)通訊,2009,20(4):482-484.
[9]Zou M,Lu N,Hu C,et al.Beclin 1-mediated autophagy in hepatocellular carcinoma cells:implication in anticancer efficiency of oroxylin A via inhibition of mTOR signaling[J].Cell Signal,2012,24(8):1722-1732.
[10]Mijaljica D,Prescott M,Devenish R J.Autophagy in disease[J].Methods Mol Biol,2010,648:79-92.
[11]Wirawan E,Vanden Berghe T,Lippens S,et al.Autophagy:for better or for worse[J].Cell Res,2012,22(1):43-61.
[12]Tooze S A.Current views on the source of the autophagosome membrane[J].Essays Biochem,2013,55:29-38.
[13]Hamacher-Brady A.Autophagy regulation and integration with cell signaling[J].Antioxid Redox Signal,2012,17(5):756-765.
[14]Yousefi S,Perozzo R,Schmid I,et al.Calpain-mediated cleavage of Atg5 switches autophagy to apoptosis[J].Nat Cell Biol,2006,8(10):1124-1132.
[15]Noda N N,Fujioka Y,Hanada T,Structure of the Atg12-Atg5 conjugate reveals a platform for stimulating Atg8-PE conjugation[J].EMBO Rep,2013,14(2):206-211.
[16]Chen D,Fan W,Lu Y,et al.A mammalian autophagosome maturation mechanism mediated by TECPR1 and the Atg12-Atg5 conjugate[J].Mol Cell,2012,45(5):629-641.