A型肉毒毒素輕鏈的原核表達、純化及活性鑒定

羅森，齊芬芳，宮路路，劉昊，李濤，王慧

1.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校，貴州 遵義 563002；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

肉毒毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）是由肉毒梭狀芽孢桿菌在厭氧環(huán)境中產(chǎn)生的外毒素，是目前已知毒性最強的一種生物毒素，對人的致死量約為0.1 μg。根據(jù)肉毒毒素抗原性的不同，分為7 個血清型（A～G），人類的肉毒中毒主要由A、B 和E 型引起[1]，其中以A 型肉毒毒素（BoNT/A）中毒更為常見，且相比其他型可引起更嚴重的癥狀和導(dǎo)致更高的死亡率。肉毒毒素的相對分子質(zhì)量（Mr）約150×103，由N 端的一條Mr約50×103的輕鏈（light chain，LC）和C端的一條Mr約100×103的重鏈（heavy chain，HC）通過二硫鍵聯(lián)結(jié)在一起，具有鋅離子依賴的催化活性結(jié)構(gòu)域位于毒素的LC 中[2-3]。肉毒毒素的致病機制是由HC 結(jié)合到后膽堿神經(jīng)能細胞并易位通過細胞膜進入神經(jīng)細胞釋放出LC[4-6]。作為一種鋅內(nèi)肽酶，LC 選擇性切割神經(jīng)細胞內(nèi)的底物SNARE蛋白，每個血清型的BoNT輕鏈都切割特異的底物蛋白，A 和E 型切割SNARE 蛋白中的SNAP-25[2-4]，其中BoNT/A裂解SNAP-25（裂解肽鍵Q197-R198）。這些具有神經(jīng)毒力的內(nèi)肽酶通過裂解SNAP-25 從而阻斷神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放，引起肌肉松弛麻痹、呼吸肌麻痹甚至導(dǎo)致人畜中毒死亡。在我國許多省區(qū)時有A型和B型肉毒中毒病例發(fā)生。同時，A型肉毒毒素也越來越多地被應(yīng)用于美容和一些神經(jīng)疾病的治療中[10-13]。

由于肉毒毒素的穩(wěn)定性差和具有劇毒性，若對其操作將面臨潛在的健康危害甚至生命危險，同時，目前尚無法有效地使肉毒毒素的LC和HC分離。如能經(jīng)濟高效地得到有活性的穩(wěn)定的肉毒毒素LC，則可避免上述問題，并可作為試劑應(yīng)用于肉毒毒素酶類抑制劑高通量檢測方法的研究、食品衛(wèi)生、進出口檢疫檢驗，以及對美容醫(yī)療用肉毒毒素的活性分析和檢測。我們通過基因克隆技術(shù)，從A 型肉毒梭菌中調(diào)取BoNT/A LC 基因，在大腸桿菌中重組表達，通過SDS-PAGE 對重組蛋白進行鑒定，親和純化后，利用底物SNAP-25分析了重組蛋白的催化活性。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）Rosetta 感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；A 型肉毒梭菌、pET-32a 表達質(zhì)粒由本室保存；BoNT/A、底物SNAP-25 由本室制備保存；DNA marker、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ購自New England Biolabs 公司；IPTG購自Promega 公司；引物合成及基因測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；HisTrap FF 柱（5 mL）購自GE Healthcare公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GanBank 中A 型肉毒毒素序列（GenBank：M30196.1）中的LC 片段及載體序列，設(shè)計合成上游引 物P3（5'-CCATGGCTTATAAAGATCCTGTAAAT GGTGTT-3'）和下游引物P4（5'-CTCGAGTAATCTA GTAAAATTCCTGCTGTT-3'），上、下游引物中分別引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點（下劃線部分）。

1.3 目的基因的克隆和原核表達載體pET-32a-BoNT/A LC的構(gòu)建與鑒定

將培養(yǎng)的A 型肉毒梭菌菌體離心，用50 μL 0.01 mol/L 的Tris-HCl（pH7.4）重懸菌體，加入50 μL 0.5 mol/L 的KOH，96℃加熱10 min，加入100 μL 0.5 mol/L 的Tris-HCl（pH6.5），12 000 r/min 離心10 min，取上清10 μL 作為模板進行PCR 擴增。PCR 擴增體系（25 μL）包括H2O 17.5 μL，Taq酶緩沖液2.5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，Taq酶1 μL，模板1 μL。PCR 擴增條件：95℃3 min；94℃30 s，53℃40 s，72℃1.5 min，30次循環(huán)；72℃延伸10 min。用凝膠回收試劑盒回收PCR 擴增產(chǎn)物，連接T 載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，PCR 鑒定的陽性重組質(zhì)粒用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收BoNT/A LC 片段，與經(jīng)同樣雙酶切處理的pET-32a 載體用T4DNA 連接酶連接，構(gòu)建成BoNT/A LC的原核表達載體pET-32a-BoNT/A LC，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性菌落，提取質(zhì)粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定。

1.4 BoNT/A LC重組蛋白的誘導(dǎo)表達

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）Rosetta 感受態(tài)細胞，挑選陽性菌落接種于含氨芐西林（100 mg/L）的LB 培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，以1∶100 轉(zhuǎn)接于LB 培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.6左右，加入IPTG 至1 mmol/L，20℃繼續(xù)培養(yǎng)20 h，4℃、6000 r/min 離心20 min 收集菌體。用結(jié)合緩沖液（A 液）重懸菌體，放置冰上進行超聲波破碎30 min，4℃、12 000 r/min 離心20 min，SDSPAGE分析上清和沉淀中的目的蛋白。

1.5 BoNT/A LC重組蛋白的純化

取細菌培養(yǎng)液，4℃、6000 r/min 離心收集菌體，重懸于結(jié)合緩沖液（20 mmol/L 磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，40 mmol/L 咪唑，pH7.0）中，超聲波破碎處理后取上清上樣HisTrap FF 柱，用10 個柱床體積的結(jié)合緩沖液平衡柱子，然后用洗脫緩沖液（20 mmol/L 磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪 唑，pH7.4）線性梯度洗脫；收集洗脫液洗脫的樣品行SDS-PAGE分析；采用Bradford法對純化產(chǎn)物進行定量測定；純化后的重組蛋白透析于緩沖液（50 mmol/L HEPES，pH7.5）中，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 BoNT/A LC重組蛋白的活性驗證

在反應(yīng) 液（50 mmol/L HEPES，2.5 mmol/L DTT，10 μmol/L ZnCl2，pH7.4）中，將重組蛋白BoNT/A LC 與SNAP-25 于37℃反應(yīng)30 min，同時設(shè)定一組不加BoNT/A LC 作為陰性對照。對BoNT/A LC的活性進行20% SDS-PAGE 后，考馬斯亮藍染色檢測切割情況。通過BoNT/A LC（10 nmol/L）切割2～100 μmol/L 不同濃度的SNAP-25 測定動力學(xué)參數(shù)，切割反應(yīng)時間為20 min，加入SDS-PAGE 上樣緩沖液終止反應(yīng)，將SDS-PAGE 膠用Chemi Doc XRS 成像系統(tǒng)（BIO-RAD）采用光密度分析法測定切割和未切割SNAP-25蛋白所占百分比。

2 結(jié)果

2.1 BoNT/A LC的基因克隆和表達質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR 擴增獲得BoNT/A LC 基因片段，與預(yù)期大小（1221 bp）相符（圖1），測序顯示與GenBank 中報道的基因序列一致性為99%。用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pET-32a-BoNT/A LC，產(chǎn)物大小與PCR 結(jié)果一致，提示目的基因正確插入pET-32a 表達載體中（圖1）。

2.2 重組蛋白BoNT/A LC 在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達與純化

將鑒定正確的pET-32a-BoNT/A LC 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌株大腸桿菌BL21（DE3）Rosetta 感受態(tài)細胞，在1 mmol/L IPTG 的誘導(dǎo)下進行表達。SDS-PAGE分析顯示，與未誘導(dǎo)菌相比，誘導(dǎo)菌有明顯表達條帶，相對分子質(zhì)量約為70×103，與預(yù)期相符（圖2）。SDS-PAGE 分析重組蛋白經(jīng)HisTrap FF 柱純化后的產(chǎn)物，目的條帶較為單一，純度在90%左右，表明得到較高純度的目的蛋白（圖3）。

2.3 重組蛋白BoNT/A LC的活性檢測

BoNT/A LC 可特異性識別、裂解其底物SNAP-25 蛋白的Q197-R198，將10 nmol/L 重組蛋白BoNT/A LC 與SNAP-25 在反應(yīng)液（50 mmol/L HEPES，2.5 mmol/L DTT，10 μmol/L ZnCl2，pH7.5）中于37℃孵育，每2 min 檢測一次，SDS-PAGE 分析結(jié)果見圖4，BoNT/A LC 酶解SNAP-25 后產(chǎn)生了與預(yù)期相符的2條蛋白片段，說明重組蛋白BoNT/A LC 能特異性酶解底物SNAP-25。動力學(xué)參數(shù)測定表明，BoNT/A LC 酶解SNAP-25 的Km和kcat值分別為0.96±0.05 mmol/L和0.09±0.01 s-1。

圖1 BoNT/A LC基因PCR產(chǎn)物和

圖2 重組BoNT/A LC在大腸桿菌BL21（DE3）Rosetta中的表達

3 討論

對于肉毒中毒，迄今國內(nèi)外尚未有較滿意的解毒藥物，僅有的馬血清抗毒劑存在易產(chǎn)生免疫反應(yīng)副作用等缺點。LC 已被證實是治療肉毒毒素中毒的關(guān)鍵藥靶，開發(fā)高效的BoNT LC 抑制劑是當(dāng)前研究的熱點領(lǐng)域[14-21]。在基于肉毒神經(jīng)毒素活性的分析方法中，小鼠生物檢測仍是目前惟一被公認的確認BoNT 的方法[22]。但小鼠生物檢測本身也有缺點，如檢測花費時間較長、使用小鼠的檢測成本較高、對大批量的樣本進行檢測存在困難等。針對BoNT LC抑制劑開發(fā)的大量樣本的初步篩選，建立高通量的體外檢測方法能夠極大地減少檢測時間和工作量。本研究的目的是以BoNT LC 代替BoNT 作為試劑，應(yīng)用于BoNT LC抑制劑高通量體外檢測方法研究。

我們在重組BoNT/A LC 蛋白的C端加上組氨酸標(biāo)簽，利用HisTrap FF柱進行親和純化，通過一次過柱純化得到高純度的目的蛋白，純化方法簡單容易。為了提高目標(biāo)蛋白的表達產(chǎn)量，我們選擇攜帶稀有密碼子的表達菌株BL21（DE3）Rosetta，發(fā)現(xiàn)其比BL21（DE3）的表達量更高，重組蛋白達到全菌蛋白總量的20%；采用20℃低溫誘導(dǎo)并延長誘導(dǎo)時間，比37℃誘導(dǎo)時的表達量提高50%以上，且包涵體更少，可能是由于低溫條件下更有利于該蛋白的表達和正確折疊，表達的目的蛋白絕大部分存在于超聲波破碎后的上清中。酶活分析證明所制備的重組蛋白的酶活性略高于全毒素，這可能是由于全毒素中LC 的活性部位被包圍在HC 的易位域帶中，而單獨的LC 比全毒素中的LC 可暴露更多的活性位點。曾有類似結(jié)果報道[21]。

圖3 重組BoNT/A LC蛋白的純化

圖4 SDS-PAGE分析BoNT/A LC與SNAP-25的反應(yīng)

綜上，本研究構(gòu)建的表達菌株能夠高表達重組BoNT/A LC，獲得的BoNT/A LC 重組蛋白具有高活性、高穩(wěn)定性，容易制備且安全無毒，可用于后續(xù)研究。這為BoNT/A LC 抑制劑高通量體外檢測方法的研究和BoNT/A LC抑制劑的篩選奠定了基礎(chǔ)。

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