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    白血病相關(guān)蛋白LRP16 過表達(dá)HepG2 穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建及鑒定

    2015-11-29 08:31:38李婷王安平李萍王雙雙母義明
    生物技術(shù)通訊 2015年5期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)粒試劑盒引物

    李婷,王安平,李萍,王雙雙,母義明

    解放軍總醫(yī)院 內(nèi)分泌科,北京 100853

    白血病相關(guān)蛋白16(leukemia related protein 16,LRP16)基因是韓為東等于1999年從正常人外周血淋巴細(xì)胞中克隆并命名的一個基因,屬于Macro Domain 家族。該基因定位于染色體11q12.23,含11個外顯子,編碼325 個氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白[1-2]。我們前期的研究表明,LRP16 基因?qū)σ葝u素分泌和胰島素抵抗均有影響。它在脂肪細(xì)胞3T3-L1、肌肉細(xì)胞C2-C12、肝癌細(xì)胞HepG2 中發(fā)揮著重要作用,LRP16 過表達(dá)可上調(diào)多種炎性因子(TNF-α、IL-6)的表達(dá),損傷IRS-1 信號傳導(dǎo)通路(降低pIRS-1、PI3-K、pAkt 的表達(dá)),抑制細(xì)胞胰島素刺激的葡萄糖攝取,引起外周胰島素抵抗[3-5]。在這些研究中我們采用的是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式,這一技術(shù)一方面只能達(dá)到短期轉(zhuǎn)染,另一方面轉(zhuǎn)染效率較低。我們想深入研究LRP16 促進(jìn)胰島素抵抗的分子機(jī)制,希望獲得長期穩(wěn)定的LRP16 過表達(dá)細(xì)胞株。因此,我們構(gòu)建了LRP16 過表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體,且成功地感染了HepG2 細(xì)胞,獲得穩(wěn)定過表達(dá)LRP16 的細(xì)胞株,為深入研究LRP16 抑制肝臟胰島素抵抗的相關(guān)機(jī)制提供相關(guān)技術(shù)支持。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    HEK293T 包裝細(xì)胞及人肝癌HepG2 細(xì)胞均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和細(xì)胞資源中心(CRC/PUMC);過表達(dá)質(zhì)粒載體EX-Y2069-Lv201 及對照質(zhì)粒載體EX-NEG-Lv201(表1,圖1)由OmicsLink 公司構(gòu)建;慢病毒包裝試劑盒Lenti-Pac HIV Expression Packaging Kit、Lenti-Pac HIV and FIV qRT-PCR 滴定試劑盒、第一鏈cDNA 合成試劑盒、2×All-in-One qPCR Mix 均購自Gene Copoeia 公司;MEM 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、丙酮酸鈉、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗均購自Gibco 公司;TRIzol 購自Invitrogen 公司;蛋白marker 購自Thermo公司;Western 印跡發(fā)光試劑盒購自北京普利萊公司;鼠抗人β-actin抗體購自Cell Signaling Technology 公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自中杉金橋公司;qPCR 引物由Invitrogen 公司合成;LRP16抗體由本實驗室制備保存。

    1.2 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

    選用25 mL 培養(yǎng)瓶,適量HepG2 細(xì)胞,加入5 mL MEM 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素、1 μmol/L 丙酮酸鈉),于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2 d換液一次,4~5 d傳代一次。

    1.3 質(zhì)粒載體構(gòu)建及鑒定

    對構(gòu)建的過表達(dá)質(zhì)粒載體EX-Y2069-Lv201 的LRP16 開放讀框(ORF)進(jìn)行測序,結(jié)果與人類LRP16基因(GenBank:NM_014067)序列相符。

    1.4 慢病毒包裝

    按照Lenti-Pac HIV Expression 慢病毒包裝試劑盒進(jìn)行下述操作。在轉(zhuǎn)染前2 d,按每個10 cm的培養(yǎng)皿1.3×106~1.5×106細(xì)胞數(shù)將HEK293T 包裝細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中,用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng),使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時達(dá)到70%~80%的密度;在去聚丙烯的試管中,取2.5 μg 病毒過表達(dá)質(zhì)粒EX-Y2069-Lv201 和5.0 μL(0.5 μg/μL)Lenti-Pac HIV mix 稀釋至200 μL 的Opti-MEM 內(nèi);取15 μL EndoFectin Lenti,在另一試管中用Opti-MEM 稀釋至終體積為200 μL;將稀釋的EndoFectin Lenti 反應(yīng)物加入輕微渦旋含DNA 的試管中(添加順序不可顛倒),然后將上述混合物轉(zhuǎn)移到5 mL 圓底聚丙烯試管Falcon 中;把形成的DNA-EndoFectin 復(fù)合物直接加入培養(yǎng)皿,輕輕搖晃培養(yǎng)皿使復(fù)合物均勻分布;在37℃、5% CO2孵箱中孵育細(xì)胞過夜(8~14 h),用含2%~5%經(jīng)熱失活的胎牛血清和青霉素、鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基替換過夜的原培養(yǎng)基;加入1/500 體積的TiterBoost 反應(yīng)物到培養(yǎng)基中,在37℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)孵育;經(jīng)48 h轉(zhuǎn)染,收集含假病毒的培養(yǎng)液到加蓋的試管中,500 r/min 離心10 min 去除細(xì)胞碎片;進(jìn)一步離心,用0.45 μm 孔徑的濾器過濾HEK293T 細(xì)胞上清液,得到過表達(dá)病毒濃縮液LPP-Y2069-Lv201-400,分裝小管放置于-80℃?zhèn)溆谩M瑯硬襟E得到對照病毒濃縮液LPP-NEG-Lv201-100。

    表1 載體克隆信息

    圖1 過表達(dá)質(zhì)粒載體EX-Y2069-Lv201(A)及對照質(zhì)粒載體EX-NEG-Lv201(B)信息

    1.5 慢病毒滴度測定

    HEK293T 細(xì)胞傳代,24 孔板中每孔加入1×105細(xì)胞,體積為500 μL;次日準(zhǔn)備10 支無菌Ep 管,每管加入90 μL 培養(yǎng)基,取待測病毒原液10 μL 加入第1 支管中,混合均勻,取混合均勻的第1 管液10 μL 加入第2 支管中,繼續(xù)相同操作直到最后一管;選取所需細(xì)胞孔,吸去90 μL培養(yǎng)基,加入稀釋好的病毒溶液,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);1 d后,加入新鮮培養(yǎng)基500 μL;小心操作;4 d 后抽提RNA,然后采用Lenti-Pac HIV and FIV qRT-PCR 滴定試劑盒提取總RNA,將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,實時定量PCR檢測綠色熒光蛋白標(biāo)記的慢病毒滴度。病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量,即2/(1E-6)=2E+6 TU/μL,亦即2E+9 TU/mL。確保病毒滴度≥108TU/mL(LPP-Y2069-Lv201-400 為3.87×108TU/mL,LPP-NEG-Lv201-100 為6.25×108TU/mL),以便后續(xù)操作。

    1.6 慢病毒載體感染HepG2細(xì)胞系

    將HepG2 細(xì)胞計數(shù)后鋪到6 孔板中培養(yǎng),各孔加入2 mL MEM 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,1%青鏈霉素,1 μmol/L 丙酮酸鈉),在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h;鋪板24 h 后,按照MOI=30,每孔加入相應(yīng)目的基因慢病毒液LPP-Y2069-Lv201-400 和對照慢病毒液LPP-NEG-Lv201-100,混勻后于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng);感染48 h 后,觀察慢病毒侵染結(jié)果,拍攝細(xì)胞熒光圖片;用胰酶消化感染過的細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至6 孔板(每塊6 孔板對應(yīng)一種慢病毒,留出1 孔用于陰性對照細(xì)胞),以含1 μg/mL 嘌呤霉素的MEM 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,1%青鏈霉素,1 μmol/L 丙酮酸鈉)進(jìn)行藥物篩選培養(yǎng)5~7 d,觀察細(xì)胞存活情況和熒光圖片,當(dāng)細(xì)胞熒光圖片與明場細(xì)胞相對應(yīng),則嘌呤霉素濃度可以減半進(jìn)行培養(yǎng);連續(xù)加藥培養(yǎng)7 d后,嘌呤霉素濃度減半至0.5 μg/mL 繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞長滿后收取細(xì)胞。

    1.7 qPCR檢測LRP16的mRNA表達(dá)

    從細(xì)胞中提取RNA,定量,電泳確定其純度。用第一鏈cDNA 合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,用Gene Copoeia 公司試劑盒配置所推薦的反應(yīng)體系后在PRISM 7300(ABI 公司)上進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。根據(jù)LRP16 的基因序列設(shè)計PCR 引物(上游引物:5'-A GCTCTTTCACTCGGAGGATT-3';下游引物:5'-TG GCAAAAGAAGAAGACAAAGC-3')。以GAPDH 基因為內(nèi)參,根據(jù)GAPDH 的基因序列設(shè)計PCR 引物(上游引物:5'-TGGGTGTGAACCACGAGAA-3';下游引物:5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3')。反應(yīng)條件:95℃ 30 s 預(yù)變性;95℃ 5 s,60℃ 20 s,72℃10 s,40 個循環(huán)。目標(biāo)基因mRNA 的相對含量通過ΔΔCt計算方法獲得。

    1.8 Western印跡檢測LRP16的表達(dá)

    用自制IP 緩沖液(0.15 mol/L NaC1,20 mmol/L Tris-HC1,10%甘油,0.1% NP-40)加入25×總蛋白酶抑制劑及用100×PMSF 配置的細(xì)胞裂解液,分別裂解過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株、對照穩(wěn)轉(zhuǎn)株和野生型(未轉(zhuǎn)染)HepG2 細(xì)胞,4℃、12 000 r/min 離心后取上清作為樣品,測定蛋白濃度,取等量蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE 后轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF 膜,用以TBST 液配制的5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h,LRP16 鼠抗以1∶200稀釋,β-actin 鼠抗人以1∶1000 稀釋,4℃反應(yīng)過夜,用TBST 液洗膜3 次,每次15 min,二抗以1∶5000 稀釋,室溫反應(yīng)1 h,用TBST液洗膜3次,每次15 min,在膜上滴加發(fā)光液后進(jìn)行曝光。

    2 結(jié)果

    2.1 慢病毒載體感染HepG2細(xì)胞株的篩選

    按前述方法將HepG2 細(xì)胞計數(shù)后鋪到6 孔板中培養(yǎng),每孔加入目的基因慢病毒液LPP-Y2069-Lv201-400 和對照慢病毒液LPP-NEG-Lv201-100,感染48 h 后,觀察慢病毒侵染結(jié)果,拍攝細(xì)胞熒光圖片(圖2)??梢钥闯觯D(zhuǎn)入LPP-Y2069-Lv201-400 和LPP-NEG-Lv201-100 慢病毒后的HepG2 細(xì)胞,其綠色熒光蛋白表達(dá)超過90%。

    2.2 過表達(dá)慢病毒感染HepG2 細(xì)胞后對LRP16 基因表達(dá)的影響

    提取過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株、對照穩(wěn)轉(zhuǎn)株和野生型(未轉(zhuǎn)染)HepG2 細(xì)胞總RNA,采用實時熒光定量PCR 檢測各組細(xì)胞的LRP16 相對表達(dá)量。結(jié)果顯示,過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株LPP-Y2069-Lv201-400 中LRP16 目的基因的表達(dá)量為對照穩(wěn)轉(zhuǎn)株LPP-NEG-Lv201-100 的128.64倍(表2)。

    2.3 HepG2 細(xì)胞的感染和Western 印跡分析LRP16蛋白的過表達(dá)效果

    將獲得的LRP16 基因過表達(dá)的HepG2 細(xì)胞、過表達(dá)對照細(xì)胞及野生型HepG2 細(xì)胞分別培養(yǎng)4~5 d,在培養(yǎng)皿中加入適量細(xì)胞裂解液提取蛋白,用上清液行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行蛋白免疫印跡分析。結(jié)果顯示空白組和對照組細(xì)胞在相對分子質(zhì)量約28×103處均出現(xiàn)了微弱條帶,而過表達(dá)組出現(xiàn)明顯的粗黑條帶,表明過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株LPP-Y2069-Lv201-400 的LRP16 表達(dá)量明顯高于對照穩(wěn)轉(zhuǎn)株LP-NEG-Lv201-100和野生型HepG2(圖3),結(jié)果與實時熒光定量PCR一致。

    表2 qPCR檢測過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株、對照穩(wěn)轉(zhuǎn)株及野生型HepG2細(xì)胞中LRP16 mRNA水平

    圖2 LRP16過表達(dá)穩(wěn)定株(A)及對照穩(wěn)定株(B)熒光轉(zhuǎn)染情況

    圖3 Western印跡檢測LRP16蛋白表達(dá)的差異

    3 討論

    前期,我們做了大量LRP16相關(guān)研究,發(fā)現(xiàn)它是機(jī)體發(fā)育過程中不可或缺的一個基因,其表達(dá)不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-7],也參與了胰島素的分泌及胰島素外周器官的胰島素抵抗作用。

    隨著糖尿病發(fā)生率的上升,胰島素抵抗一度成為近年的研究熱點(diǎn),胰島素通路受到重視。而我們發(fā)現(xiàn)的LRP16 基因參與胰島素抵抗立刻引起了關(guān)注。但目前我們的發(fā)現(xiàn)大多停留在表明現(xiàn)象,真正所涉及到的機(jī)制研究甚少。

    因為肝臟是胰島素發(fā)揮作用的重要外周器官,而且之前我們也曾在肝癌HepG2 細(xì)胞系中研究過LRP16的作用,所以,在深入研究LRP16基因?qū)σ葝u素信號通路的影響機(jī)制時,我們?nèi)匀贿x用這一常用的肝癌細(xì)胞系。此LRP16 基因過表達(dá)的HepG2 穩(wěn)定細(xì)胞系的建立,為我們今后的研究提供了一個長期有效的研究工具。

    [1]韓衛(wèi)東,于力,樓方定,等.一個新的白血病相關(guān)基因LRP16全長cDNA 的克隆、序列分析及表達(dá)特征[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2001,17(2):209-204.

    [2]于力,韓衛(wèi)東,樓方定,等.新的白血病相關(guān)基因LRP16 的克隆[J].軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報,2000,21(2):81-84.

    [3]臧麗,呂朝暉,汪保安,等.LRP16 通過下調(diào)PPARγ表達(dá)抑制細(xì)胞葡萄糖攝取[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2010,26(3):217-220.

    [4]臧麗,母義明,呂朝暉,等.LRP16基因抑制IRS-1信號通路和過氧化物酶體增殖物激活受體γ轉(zhuǎn)錄活性導(dǎo)致C2-C12 成肌細(xì)胞胰島素抵抗[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2011,91(20):1408-1412.

    [5]臧麗,母義明,呂朝暉,等.人白血病相關(guān)蛋白16 基因?qū)?T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取及過氧化物酶體增殖物激活受體γ活性的影響[J].中國糖尿病雜志,2011,19(4):293-297.

    [6]Meng Y G,Han W D,Zhao Y L,et al.Induction of the LRP16 gene by estrogen promotes the invasive growth of Ishikawa human endometrial cancer cells through the downregulation of E-cadherin[J].Cell Res,2007,17:869-880.

    [7]Tian L Y,Wu Z Q,Zhao Y L,et al.Differential induction of LRP16 by liganded and unliganded estrogen receptor alpha in SKOV3 ovarian carcinoma cells[J].J Endocrinol,2009,202:167-177.

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