靶向人表皮生長(zhǎng)因子受體3的人源Fab抗體構(gòu)建及鑒定

張晶 ，劉玉杰,2，萬(wàn)德有，劉蘊(yùn)慧，王芳，武逸熏，付潔，宋海峰

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530000

人表皮生長(zhǎng)因子受體3（human epidermal growth factor receptor 3，HER3）是表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族的一員，該家族是目前最重要的癌癥治療靶點(diǎn)之一，被廣泛研究并應(yīng)用于多種癌癥的研究及治療中，如乳腺癌、宮頸癌、胃癌、肺癌等。早在2005 年就有了第一個(gè)完全人源化的針對(duì)該家族中EGFR 的抗體藥物，而以HER2 為靶點(diǎn)的抗體藥物赫賽汀更是2014年公認(rèn)的明星藥物之一。盡管C 端缺少激酶活性，但HER3 通過(guò)與HER2 和EGFR 形成異源二聚體，促發(fā)下游通路激活，在靶向HER2及EGFR的抗體類(lèi)藥物如赫賽汀、西妥昔單抗等抗體類(lèi)藥物的耐藥中HER3 補(bǔ)償性表達(dá)上調(diào)。因此，HER3 在機(jī)體耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用[1-3]。自2010 年AVEO Pharma 完成首個(gè)HER3 抗體項(xiàng)目起[4]，已有多家公司和研究機(jī)構(gòu)針對(duì)HER3 靶點(diǎn)進(jìn)行抗體研發(fā)工作[5]，且數(shù)量呈逐年增多狀態(tài)。

抗體-藥物偶聯(lián)物（antibody conjudge drug，ADC）是目前抗體應(yīng)用的趨勢(shì)之一，如Seattle Genetics 公司以CD30 為靶點(diǎn)的Adcetris、羅氏公司以HER2 為靶點(diǎn)的Kadcyla。目前ADC 藥物雖然以全長(zhǎng)型抗體為主，但藥物分子越大越難以透過(guò)毛細(xì)管內(nèi)皮層及穿過(guò)腫瘤細(xì)胞外間隙到達(dá)實(shí)體瘤的深部?；谏鲜霾蛔?，小型化或適度小型化是研制ADC 藥物的重要途徑，如scFv、Fab 類(lèi)基因工程抗體受到越來(lái)越多的關(guān)注及應(yīng)用[6-8]。這類(lèi)抗體因含有完整的抗體可變區(qū)而保留了與抗原特異性結(jié)合的能力，同時(shí)由于其分子小而更易于與其他藥物制備成不同形式的更為安全的疫苗和藥物制劑，同時(shí)也更易于通過(guò)較為經(jīng)濟(jì)的方式獲得抗體制備成診斷試劑[9]。

本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示型全人源scFv 抗體庫(kù)，并通過(guò)流式細(xì)胞分選技術(shù)獲得了靶向人HER3 胞外區(qū)蛋白的scFv 抗體[10]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們?yōu)閷ER3 scFv 抗體改構(gòu)成Fab 形式，利用真核表達(dá)載體p3457 構(gòu)建了HER3 Fab 抗體真核表達(dá)質(zhì)粒，并通過(guò)293E 懸浮細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，對(duì)其親和力及初步的生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定，為后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

293T、293E 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)公司；pPICZα AVH-CH-VL-CL、pDisplay-scFv、p3457 均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

293E 細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gbico 公司；BspQⅠ購(gòu)自NEB 公司；PrimeSTAR 購(gòu)自TaKaRa 公司；DNA maker 購(gòu)自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；DNA 瓊脂糖膠回收試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；PEI轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen 公司；HRP 標(biāo)記的抗His 抗體購(gòu)自西美杰生物技術(shù)公司；兔抗人ERBB3（Nterm）單克隆抗體購(gòu)自ABGENT 公司；羅丹明標(biāo)記的抗兔IgG（H+L）多克隆抗體購(gòu)自KPL 公司；DAPI 購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；CCK8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 HER3 Fab型抗體表達(dá)載體構(gòu)建

1.2.1 VH、VL、CH1、CL基因擴(kuò)增 抗人源HER3抗體模板來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室前期從真核哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示型人源scFv 抗體庫(kù)篩選的pDisplay-scFv 質(zhì)粒[11]。為從pDisplay-scFv 中擴(kuò)增VH 及VL，設(shè)計(jì)引物PHfw/PHrv、PLfw/PLrv（表1），并在引物的5'端引入限制性酶切位點(diǎn)BSpQⅠ；為構(gòu)建Fab 型重鏈和輕鏈，設(shè)計(jì)引物PHfw'/PHrv'、PLfw'/PLrv'（表1），分別從本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的VEGF 全長(zhǎng)抗體質(zhì)粒pPICZα A-VH-CH-VL-CL[11]中擴(kuò)增CH1及CL基因。

VH、VL 的PCR 反應(yīng)體系：pDisplay-scFv 1 μL，5×PrimeSTAR 緩沖液10 μL，dDTP 混合液4 μL，Primestar DNA 聚合酶0.5 μL，PHfw/PHrv 或PLfw/PLrv（10 μmol/L）各1 μL，加ddH2O至50 μL。

CH1、CL 的PCR 反應(yīng)體系：pPICZα A-VH-CHVL-CL 1 μL，5×PrimeSTAR 緩沖液10 μL，dDTP 混合液4 μL，Primestar DNA 聚合酶0.5 μL，PHfw/PHrv 或PLfw/PLrv（10 μmol/L）各1 μL，加ddH2O 至50 μL。

PCR 反應(yīng)參數(shù)：98℃ 8 min；98℃ 30 s，55℃30 s，72℃40 s，28個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

1.2.2 HC、LC 基因擴(kuò)增 分別用DNA 瓊脂糖膠回收試劑盒回收目的大小正確的VH、VL、CH1、CL，詳細(xì)步驟參見(jiàn)膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)。分別通過(guò)重疊PCR 獲 得HC 及LC。重鏈PCR 反應(yīng)體系：CH1 1 μL，VH 1 μL，5×PrimeSTAR 緩沖液10 μL，dDTP混合液4 μL，Primestar DNA 聚合酶0.5 μL，PHfw/PHrv'（10 μmol/L）各1 μL，加ddH2O 至50 μL。輕鏈PCR 反應(yīng)體系：CL 1 μL，VL 1 μL,5×Prime-STAR 緩沖液10 μL，dDTP 混合液4 μL，Primestar DNA 聚合酶0.5 μL，PLfw/PLrv'（10 μmol/L）各1 μL，加ddH2O至50 μL。

1.2.3 p3457-HC 及p3457-LC 質(zhì)粒構(gòu)建 分別用BspQⅠ酶切重鏈、輕鏈及載體p3457。酶切體系：HC/LC/p3457 2 μg，BspQⅠ1 μL，緩沖液1 μL，加ddH2O 至50 μL。50℃孵育2 h，65℃滅活20 min。酶切產(chǎn)物回收后經(jīng)T4DNA 連接酶于16℃連接過(guò)夜。連接體系：HC、LC 各7 μL，p3457 1 μL，T4DNA 連接酶1 μL，T4緩沖液1 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，對(duì)挑取的單克隆進(jìn)行質(zhì)粒小量提取和菌液PCR 鑒定，挑選陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序分析和表達(dá)鑒定。

1.3 p3457及p3457質(zhì)粒表達(dá)鑒定

用含10%新生牛血清和雙抗（工作濃度為100U/mL 的青霉素及工作濃度為0.1 mg/mL 的鏈霉素）的DMEM 培養(yǎng)基于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293T 細(xì)胞，接種50 000細(xì)胞（貼壁時(shí)密度約30%）于24 孔板中，培養(yǎng)24 h，至細(xì)胞密度達(dá)70%時(shí)，按PEI轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染p3457-HC 及p3457-LC，轉(zhuǎn)染48 h 后收細(xì)胞上清，經(jīng)12.5% SDS-PAGE 分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再用1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的小鼠抗His單克隆抗體室溫孵育1 h，經(jīng)TBST 漂洗3 次，每次7 min，用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

表1 PCR引物序列

1.4 HER3 Fab抗體表達(dá)條件摸索及純化

以0.8×106/mL 的密度接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293E細(xì)胞，于37℃、5% CO2培養(yǎng)至細(xì)胞濃度為（1.4×106～2.0×106）/mL 時(shí)，按PEI 轉(zhuǎn)染試 劑說(shuō)明書(shū)將p3457-HC 及p3457-LC 分別按1∶1 的比例瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，第3 d 向細(xì)胞中添加10×CB5（儲(chǔ)存濃度為33 g/L），并開(kāi)始每天收集1 mL 細(xì)胞上清，第5 d 完全收集細(xì)胞，800 r/min 離心10 min 后收上清并用Western印跡檢測(cè)細(xì)胞上清中HER3 Fab的表達(dá)水平。

按優(yōu)化后的條件大量培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)HER3 Fab 抗體，第5 d 收集細(xì)胞上清后用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，用鎳親和柱純化細(xì)胞上清。平衡液配方：NaCl 500 mmol/L，磷酸鈉緩沖液20 mmol/L，pH7.4；洗脫液配方：NaCl 500 mmol/L，磷酸鈉緩沖液20 mmol/L，咪唑500 mmol/L，pH7.4。1～10 個(gè)柱體積內(nèi)咪唑濃度線性上升到100%洗脫，收集洗脫液，用PBS 置換緩沖液，將蛋白溶液分裝保存于-80℃。

1.5 ELISA檢測(cè)HER3 Fab與HER3的結(jié)合

用HER3 胞 外區(qū)（extracelluar membrane domain，ECD）蛋白（6 nmol/L）包被酶標(biāo)板，4℃包被過(guò)夜；用1% BSA 于37℃封閉2 h；加入不同稀釋率的HER3 Fab 抗體，37℃孵育1 h；PBST 洗滌6 次，加入HRP 標(biāo)記的抗His 抗體（1∶10000），37℃孵育1 h；PBST 洗滌6 次，加入TMB 底物顯色。以商品化的抗ERBB3（N-term）抗體為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS 替代HER3 Fab抗體為陰性對(duì)照。

1.6 ForteBio法鑒定HER3 Fab的親和力

采用ForteBio 法測(cè)定HER3 Fab 抗體與HER3的平衡解離常數(shù)KD。將HER3胞外區(qū)蛋白生物素化后，以20 μg/mL 的濃度固定在鏈霉親和素探針上，用PBS 平衡探針后，再與梯度稀釋的HER3 Fab 抗體（500、250、125、62.5、31.25、15.625 nmol/L）結(jié)合，以PBS 作為空白對(duì)照，然后探針再孵育在PBS 中進(jìn)行解離。

1.7 CCK8 法檢測(cè)HER3 Fab 抗體對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞增殖的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-453 細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，以4000/孔接種到96 孔板中，24 h 后去除上清，第1、2組分別加入50 μL 完全培養(yǎng)基，第3、4組分別加入50 μL含40 μg/mL HER3 Fab抗體的完全培養(yǎng)基；1 h后第1、3組分別加入50 μL 完全培養(yǎng)基，第2、4組分別加入50 μL含200 ng/mL神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（NRG1）的完全培養(yǎng)基；每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，24 h時(shí)分別加入10 μL CCK8，37℃孵育1 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定D450nm值。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒p3457-HC、p3457-LC及其表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖1。VH、VL、CH1、CL PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分別可見(jiàn)359、309、315、315 bp 條帶（圖2A）；VH 及CH1 重疊PCR 產(chǎn)物HC、VL 與CL 重疊PCR 產(chǎn)物L(fēng)C 經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分別可見(jiàn)674、624 bp 條帶（圖2B）；質(zhì)粒p3457-HC 及p3457-LC 的大小分別為5184 及5134 bp。挑選單克隆經(jīng)菌液PCR 鑒定后分析均為陽(yáng)性（圖2C）。挑選菌液PCR 陽(yáng)性的單克隆進(jìn)行小量質(zhì)粒提取并測(cè)序，編碼區(qū)序列完全正確（數(shù)據(jù)略），說(shuō)明克隆構(gòu)建成功。Western 印跡結(jié)果顯示，p3457-HC及p3457-LC 質(zhì)粒分別瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293E 細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物在相對(duì)分子質(zhì)量約25×103處可見(jiàn)目的條帶（結(jié)果略）。在瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293E 時(shí)，第5 d 時(shí)抗體表達(dá)量最高（圖3）。

2.2 抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)及親和力檢測(cè)結(jié)果

ELISA 檢測(cè)表明HER3 Fab 能與HER3 胞外區(qū)蛋白直接結(jié)合（圖4）。采用ForteBio 實(shí)驗(yàn)測(cè)定單克隆抗體與HER3 的平衡解離常數(shù)KD為1.08×10-8mol/L。

2.3 HER3 Fab 對(duì)MDA-MB-453 細(xì)胞增殖能力的影響

圖1 p3457-HC、p3457-LC表達(dá)載體的構(gòu)建

圖2 HER3 Fab質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

在NRG1 刺激的條件下將HER3 Fab 抗體與MDA-MB-453 細(xì)胞共同孵育24 h，CCK8 法檢測(cè)結(jié)果表明NRG1 刺激組（第2 組）與未刺激組（第1 組）結(jié)果有顯著差異（P=0.03），說(shuō)明細(xì)胞經(jīng)100 ng/mL NRG1刺激后HER3膜表達(dá)增加，細(xì)胞增殖明顯。同時(shí)，在NRG1同等刺激條件下，加入HER3 Fab組（第3 組）與未加入HER3 Fab 組（第2 組）相比結(jié)果有差異（P=0.07），說(shuō)明HER3 Fab 抗體可以顯著抑制MDA-MB-453細(xì)胞增殖。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖3 不同表達(dá)時(shí)間點(diǎn)HER3 Fab的表達(dá)鑒定

圖4 ELISA檢測(cè)HER3 Fab與HER3的結(jié)合

圖5 CCK8檢測(cè)HER3 Fab對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞增殖的抑制性

3 討論

目前哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)抗體的2 種形式是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系。一般在大量生產(chǎn)抗體類(lèi)蛋白應(yīng)用于試劑盒開(kāi)發(fā)或抗體藥物時(shí)，會(huì)使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方式，但實(shí)驗(yàn)研究新的抗體時(shí)一般采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)抗體一般是將抗體的輕鏈和重鏈分別構(gòu)建到2 種載體上，再通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染到同一細(xì)胞中，細(xì)胞分別翻譯出輕、重鏈，再在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中通過(guò)二硫鍵將輕、重鏈合成為抗體形式。

一般情況下，293E 哺乳動(dòng)物懸浮細(xì)胞表達(dá)抗原蛋白時(shí)僅需要3 d，而表達(dá)抗體類(lèi)蛋白時(shí)需要4～6 d。在本實(shí)驗(yàn)中，我們驗(yàn)證了蛋白在不同表達(dá)時(shí)間的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染后第3 d 抗體開(kāi)始表達(dá)，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)水平逐漸提高但細(xì)胞活率逐漸下降，在第5和第6 d抗體的表達(dá)量水平一致。考慮到細(xì)胞活率，我們?cè)诘? d 時(shí)收取細(xì)胞上清純化蛋白。

HER3 屬于酪氨酸激酶受體家族，經(jīng)配體刺激后觸發(fā)構(gòu)型改變并與該家族中其他成員EGFR、HER2，特別是HER2 形成異源二聚體。NRG1 是促發(fā)HER3 下游通路激活的重要因子之一，多種與HER3 抗體研究有關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)都用NRG1 刺激靶細(xì)胞。在本研究中，我們還設(shè)置了在未經(jīng)NRG1 刺激的情況下加入HER3 Fab 的組別，結(jié)果顯示該條件下Fab 抗體的孵育對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響，但是在刺激情況下Fab顯著抑制細(xì)胞增長(zhǎng)，該現(xiàn)象與HER3的膜表達(dá)量呈正相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

綜上，我們構(gòu)建、表達(dá)并純化獲得了平衡解離常數(shù)KD為1.08×10-8mol/L 的靶向人HER3 的Fab 型抗體，其在NRG1 刺激下對(duì)MDA-MB-453 細(xì)胞的增殖有一定的抑制能力，這為后期對(duì)HER3 高表達(dá)型癌癥的研究和診斷提供了一種新的思路與方法。

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