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    一種新型的利用DSS交聯(lián)劑避免重鏈輕鏈干擾的免疫沉淀技術(shù)

    2017-06-09 18:38張婉陳健陳恒玲
    科教導(dǎo)刊 2017年10期

    張婉+陳健+陳恒玲

    摘 要 抗體是含有4條多肽鏈的對稱結(jié)構(gòu),其中兩條較長的相對分子量較大的為重鏈,大小為55KDa,另外兩條較短的相對分子量較小的為輕鏈,大小25KDa。在免疫沉淀技術(shù)中如果目的條帶大小和重鏈輕鏈的大小一樣或接近將影響實驗結(jié)果的判斷。本文章通過DSS 使抗體和蛋白A/G磁珠緊密交聯(lián),即使高溫或還原劑作用下也不會破壞交聯(lián)的結(jié)構(gòu),而高溫或還原劑可以使抗體和抗原分開,從而達(dá)到SDS-PAGE 檢測到的條帶都是蛋白條帶而沒有重鏈輕鏈條帶的干擾的目的。

    關(guān)鍵詞 DSS 重鏈 輕鏈 免疫沉淀

    當(dāng)抗原或抗原類似物侵入機體將誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞尤其是漿細(xì)胞,分泌免疫球蛋白即抗體。本實驗用的是實驗室自制的多克隆抗體以及純化蛋白,并且把蛋白用針劑注射至兔子身體內(nèi)部,兔子在出現(xiàn)免疫之后會產(chǎn)生抗體。抗體的結(jié)構(gòu)決定了抗體能夠與抗原的特異性相結(jié)合。通過觀察可以看出,抗體的結(jié)構(gòu)圖形與“Y”字母相似,分子量大小為150KDa,重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)是由抗體在高溫或還原劑作用下分解而來,在兩條比較長的相對分子量中較大的是重鏈即H鏈,其分子量的具體大小是55KDa,而兩條相對較短的中較小是輕鏈即L鏈,其分子量的具體大小是25KDa,“Y”兩個分支的頂端含抗原的特異性結(jié)合位點,由重鏈和輕鏈共同決定??贵w具有較強而穩(wěn)定的氨基酸結(jié)構(gòu),能夠特異結(jié)合到抗原上,被應(yīng)用到免疫沉淀,免疫熒光,免疫組化等免疫學(xué)實驗技術(shù)中。

    進(jìn)行蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)亦或是蛋白質(zhì)同遺傳物質(zhì)之間互補作用的方法之一就是免疫沉淀??贵w具有能夠同抗原進(jìn)行特異性結(jié)合的特點,靈敏度高等優(yōu)點,達(dá)到確定蛋白質(zhì)機在體內(nèi)的完整生理特性的效果。抗體通過捕獲抗原達(dá)到富集,純化,目的蛋白或和目的蛋白相互作用的蛋白的目的。但傳統(tǒng)的實驗中如果目的蛋白與抗體的重鏈輕鏈的大小一致或接近時,將會影響實驗者對結(jié)果的判斷。因為傳統(tǒng)的實驗中,抗原-抗體-蛋白A/G磁珠復(fù)合物在高溫或還原劑作用下分裂為抗原-抗體復(fù)合物和蛋白A/G磁珠,所以在后續(xù)的SDS-PAGE檢測中的上樣液含有抗體,結(jié)果中會出現(xiàn)抗體的重鏈和輕鏈有可能遮蔽目的蛋白條帶,影響實驗者對結(jié)果的判斷。本實驗中使用DSS交聯(lián)劑使抗體和蛋白A/G磁珠緊密交聯(lián),在高溫或還原劑作用下抗原-抗體-蛋白A/G磁珠復(fù)合物分裂為抗原和抗體-蛋白A/G磁珠復(fù)合物,在后續(xù)的SDS-PAGE檢測中的上樣液將不含有抗體,凝膠結(jié)果中避免了抗體的重鏈和輕鏈的干擾,有利于實驗者對實驗結(jié)果進(jìn)行精確分析。

    1 實驗材料

    1.1 主要儀器和試劑

    DSS(Thermo scientific),抗體(實驗室自制),蛋白A/G磁珠(Roche),NP-40蛋白裂解液(Biosharp),苯甲基磺酰(PMSF), SDS-PAGE凝膠試劑盒(博士德生物),4度超高速離心機(Thermo scientific),垂直混合儀(其林貝爾儀器公司),bio-rad蛋白電泳儀

    1.2 動物材料

    成熟昆明白小鼠(雄性)。

    2 實驗方法

    2.1 提總蛋白

    實驗之前充分準(zhǔn)備好各種實驗用品,包括手術(shù)器械、5ml玻璃軍均漿器、1.5mlEP管、1ml槍頭、200ul槍頭、10ul槍頭實行高壓滅菌,同時放在烘箱里面?zhèn)溆谩?度離心機預(yù)冷,勻漿器放入冰盒中冰鎮(zhèn),配蛋白裂解液(用120mM氯化鈉溶液配0.5%NP-40),1ml蛋白裂解液中加10ul,0.1mM的苯甲基磺酰,混勻,放入冰盒中。斷髓法處死小鼠,取小鼠睪丸組織100mg,稱量時用吸水紙盡量吸干組織表面的水分,之后轉(zhuǎn)存在冰鎮(zhèn)的里面,同時放入具有的蛋白裂解液來進(jìn)行均漿,所有的操作過程都在冰上進(jìn)行,把均漿全部轉(zhuǎn)移至管中1.5mlEP、4度、1000*g,離心10min。同時把清至轉(zhuǎn)移到新型的EP管里面,放在冰塊上面?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 蛋白A/G磁珠與抗體結(jié)合

    準(zhǔn)備實驗試劑,配置溶液Ⅰ (0.01M中性磷酸鹽溶液)。對蛋白A/G進(jìn)行震蕩,使得磁珠能夠完全混到液體內(nèi)部,便于液體的吸取,并且吸取混勻的50ul液體至1.5mlEP里。1000*g、4度、離心1min,去除上清。使用200ul溶液進(jìn)行磁珠的清洗,1000*g、4度、離心1min,之后進(jìn)行磁珠兩次的重復(fù)清洗振蕩蛋白A/G磁珠瓶子,使磁珠充分混勻到。去除上清,往EP管內(nèi)加入90ul溶液Ⅰ 和10ul一抗溶液。將EP管固定在垂直混合儀上,以合適的轉(zhuǎn)速使溶液混勻,在室溫狀態(tài)下孵育一個小時。在孵育之后,1000*g、4度、離心1min。棄去上清,EP管內(nèi)加入200ul溶液Ⅰ清洗磁珠,此時抗體已和磁珠結(jié)合,1000*g、4度、離心1min。再次對磁珠進(jìn)行兩次的清洗。

    2.3 DSS交聯(lián)蛋白A/G磁珠和抗體

    準(zhǔn)備實驗試劑,配置2.5mM的DSS溶液,溶液Ⅱ0.1M,ph2.0。除去上述EP管內(nèi)的上清,加入32ul溶液Ⅰ和18ul 2.5mM的DSS溶液,將EP管固定在垂直混合儀上以合適的轉(zhuǎn)速使溶液混勻,是室溫狀態(tài)下孵育一個小時。在結(jié)束相關(guān)交聯(lián)之后,1000*g、4度、離心1min。棄去上清,用50ul溶液清洗珠子,1000*g、4度、離心1min。之后對磁珠進(jìn)行兩次清洗。除去上清,運用蛋白解液進(jìn)行磁珠的清洗,1000*g、4度、離心1min。在結(jié)束清洗之后,除去上清,EP管放在冰上備用。

    2.4 蛋白和一抗孵育

    將2.1中提取的蛋白即上清加入到含有已經(jīng)交聯(lián)一抗的蛋白A/G磁珠的EP管中即2.3的EP管中。將EP管固定于垂直混合儀上,以合適的速度旋轉(zhuǎn),4度,過夜。

    2.5 10%SDS-PAG凝膠檢測

    實驗之前充分準(zhǔn)備好實驗過程中需要的試劑,并進(jìn)行電泳液的配置,tris-base 3.03g、18.77g氨基酸、1g sds,在充分溶解之后,使用蒸餾水對其。同時進(jìn)行配置,0.25g的(R250)、50ml甲醇50ml,10ml的冰醋酸,在完全溶解之后,使用蒸餾水進(jìn)行定容達(dá)到100ml。配置10%分離膠,蒸餾水2.7毫升,30%丙烯酰胺(29:1)3.3毫升,3.8ml的1MTris-hcl PH8.8、100微升的濃度為10%的SDS ,以及100微升的濃度為10%的過硫酸銨,在混勻之后添加4微升的TMEMD ,混勻,灌入已測漏的垂直玻璃板內(nèi),用蒸餾水液封。室溫聚合30分鐘。把上面運用在液封方面的蒸餾水倒去。同時配置濃度為5%的濃縮膠、2.7ml的、0.67ml濃度為30%的丙烯酰胺,0.5ml的1Mtris-hclPH6.8、40微升濃度為10%的SDS,在與40微升的濃度為10%的過硫酸銨攪勻之后,加入TMEMD 4微升,混勻,灌入垂直玻璃板內(nèi),在整個玻璃板被灌滿直至溢出的時候插入數(shù)字,室溫狀態(tài)下聚合半小時。

    將上述樣品即2.4中蛋白抗體蛋白A/G磁珠復(fù)合物進(jìn)行離心,1000*g、4度、離心1min。去上清液,加入200ul的蛋白裂解液往EP管中清洗磁珠,所進(jìn)行的離心條件是1000*g、4度、離心1min。之后對磁珠進(jìn)行兩次的重復(fù)清洗。去除上清,加入40ul溶液Ⅱ洗脫抗原,在室溫保持五分鐘。1000*g、4度、離心1min,收集上清,加入20ul溶液Ⅱ洗脫抗原,室溫5分鐘。將收集的洗脫液12000*g 4度 離心10min。將洗脫液轉(zhuǎn)移至新的EP管內(nèi)(盡量不要吸到珠子)。往60ul洗脫液中加入15ul的5*loading buffer,混勻備用,往含有40ul磁珠的EP管中加入10ul的5*loading buffer混勻備用。將兩個EP管在沸水中煮8分鐘。含洗脫液的EP管12000*g,4度,離心2分鐘,收集上清備用。

    把放電泳槽內(nèi)部,同時倒進(jìn)去電泳液,輕輕拔下梳子,進(jìn)行點樣,點樣順序marker,煮沸的洗脫液即蛋白液,蛋白A/G磁珠。電泳條件,30v,60分鐘后電壓調(diào)至80v,保持2.5個小時。在結(jié)束電泳之后,把凝膠取出并放在玻璃皿里面,并把其倒入溶液里面進(jìn)行染色,將玻璃皿轉(zhuǎn)移到搖床上,合適的轉(zhuǎn)速染色,時間40分鐘。在染色之后把染色液收回,運用凝膠脫色:將凝膠放在打的玻璃器皿中并加入自來水,之后放進(jìn)微波爐里進(jìn)行高溫加熱,七分鐘之后換水,再次依據(jù)上面的條件進(jìn)行脫色,直到凝膠上面出現(xiàn)清晰的條帶。在結(jié)束脫色之后,對其進(jìn)行拍照,實現(xiàn)實驗結(jié)果的保存(圖1)。切下的目的條帶可以進(jìn)行后續(xù)質(zhì)譜鑒定。

    從圖1中可以看出抗體的重鏈輕鏈出現(xiàn)在蛋白A/G磁珠泳道,蛋白A/G磁珠和抗體在DSS作用下緊密交聯(lián),蛋白液泳道是沒有重鏈和輕鏈的,說明DSS交聯(lián)劑成功避免了重鏈輕鏈對目的蛋白條帶的干擾。

    3 結(jié)果與討論

    從實驗結(jié)果中看出,抗體的重鏈和輕鏈出現(xiàn)在蛋白A/G磁珠泳道中而未出現(xiàn)在抗原液泳道中,說明DSS交聯(lián)劑可以有效避免抗體的重鏈輕鏈對實驗結(jié)果的干擾。免疫沉淀是以抗體與抗原特意性結(jié)合為基礎(chǔ)研究蛋白相互作用的經(jīng)典方法。研究蛋白質(zhì)間的相互作用對解釋疾病的機制如腫瘤異質(zhì)性和藥物的研發(fā)如抗體藥具有重要意義。DSS交聯(lián)的免疫沉淀方法能夠避免重鏈輕鏈干擾,希望能為科研學(xué)者提供一個新思路。綜上所述,本實驗的優(yōu)點可以分為以下三點:DSS交聯(lián)劑能夠成功避免免疫沉淀中抗體的重鏈輕鏈對實驗結(jié)果的干擾;DSS交聯(lián)劑與其他方功法如使用試劑盒(pierce)相比較,樣品可以進(jìn)行后續(xù)的質(zhì)譜鑒定,為開展功能試驗打下基礎(chǔ);DSS交聯(lián)劑溶液配置方便,使用簡單,與使用實驗盒相比較極大地降低了實驗成本。

    *通訊作者:陳恒玲

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