側(cè)腦室微量注射瘦素對(duì)大鼠下丘腦GnIH表達(dá)的影響*

魏 萌，武 儉，蘇 瑋，楊松鶴，程露陽(yáng)，喬躍兵（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

側(cè)腦室微量注射瘦素對(duì)大鼠下丘腦GnIH表達(dá)的影響*

魏 萌，武 儉，蘇 瑋，楊松鶴，程露陽(yáng)，喬躍兵△
（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

目的：探討側(cè)腦室微量注射瘦素對(duì)下丘腦促性腺激素抑制激素（GnIH）蛋白表達(dá)的影響。方法：10只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為注射生理鹽水6h組和注射瘦素6h組，每組5只大鼠。大鼠去卵巢手術(shù)同時(shí)給予17β-雌二醇后，分別于側(cè)腦室微量注射生理鹽水和瘦素各4μl。采用蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)下丘腦GnIH蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：與注射生理鹽水6h組相比，微量注射瘦素可明顯降低下丘腦GnIH的表達(dá)水平（P＜0.05）。結(jié)論：瘦素可能通過(guò)抑制GnIH的表達(dá)發(fā)揮對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)作用。

側(cè)腦室；瘦素；GnIH；下丘腦-垂體-性腺軸

生殖功能是包括人類在內(nèi)的各種物種得以繁衍的基礎(chǔ)，而下丘腦-垂體-性腺軸是調(diào)控生殖功能的極為微妙且復(fù)雜的系統(tǒng)之一。下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素（GnRH）是下丘腦中唯一能控制垂體促性腺素釋放的調(diào)節(jié)激素，可刺激甾體類激素的合成，促進(jìn)精子和卵子發(fā)生［1］。目前，已知瘦素（Leptin）可通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸對(duì)GnRH的釋放進(jìn)行調(diào)節(jié)，但具體機(jī)制尚不完全明了［2］。促性腺激素抑制激素（GnIH）是脊椎動(dòng)物體內(nèi)能抑制GnRH分泌的下丘腦神經(jīng)肽。目前，GnIH神經(jīng)元是否是Leptin調(diào)節(jié)GnRH分泌的多個(gè)途徑中的一員，國(guó)內(nèi)尚無(wú)此方面的報(bào)道。本研究旨在探討大鼠側(cè)腦室微量注射Leptin是否可影響下丘腦GnIH蛋白的表達(dá)，為探討Leptin是否能通過(guò)GnIH神經(jīng)元發(fā)揮對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)作用提供必要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立與分組 10只成年健康雌性Wsitar大鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001）行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)，術(shù)后第15d開始項(xiàng)背部皮下注射17β-雌二醇（0.1mg/kg/d）連續(xù)5d，以建立卵巢摘除術(shù)補(bǔ)充雌激素（OEP）大鼠模型。所有OEP模型大鼠隨機(jī)分為2組，注射生理鹽水6h組（5只）、注射Leptin 6h組（5只）。根據(jù)George Paxinos的方法定位側(cè)腦室：前囟點(diǎn)后1.0mm，旁開1.5mm，進(jìn)針深度4.4mm。注射Leptin組和注射生理鹽水組大鼠分別向側(cè)腦室微量注射Leptin（PeproTech公司）和生理鹽水各4μl，于5min內(nèi)注射完畢。

1.2 蛋白樣品制備和Western blot分析 兩組大鼠分別微量注射Leptin和生理鹽水后6h處死，迅速取出下丘腦稱重，加入裂解液后提取總蛋白，總蛋白含量用蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）測(cè)定，電泳時(shí)蛋白上樣量120μg。經(jīng)SDS-PAGE（12%分離膠，4%堆積膠）分離的蛋白電轉(zhuǎn)移（150mA，1.5h）至PVDF膜（Millipore）上，含5%脫脂奶粉的TBS緩沖液室溫封閉1h，一抗［兔抗GnIH多克隆抗體（1：1000，Santa Cruz公司），小鼠抗β-actin單克隆抗體（1：1000，Abcam公司）］4℃孵育過(guò)夜，二抗［分別為（HRP）結(jié)合的羊抗兔IgG（1：1000，Pierce公司）和羊抗小鼠IgG（1：1000，Pierce公司）］孵育1h，洗膜5次后，化學(xué)發(fā)光法顯色。圖像掃描后采用Quantity One 4.62分析軟件分析條帶的平均灰度值，以目的條帶灰度值與對(duì)應(yīng)β-actin條帶灰度值之比作為GnIH蛋白表達(dá)量的相對(duì)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

側(cè)腦室微量注射Leptin對(duì)大鼠下丘腦GnIH蛋白表達(dá)的影響：注射Leptin 6h組大鼠下丘腦GnIH蛋白的表達(dá)水平為（0.63±0.08），明顯低于注射生理鹽水6h組大鼠下丘腦GnIH蛋白的表達(dá)水平（1.32±0.22，P＜0.05）。見附圖。

附圖 大鼠下丘腦GnIH蛋白的表達(dá)水平

3 討論

Leptin在調(diào)節(jié)攝食、控制能量平衡及生殖功能等多方面發(fā)揮重要作用，長(zhǎng)期以來(lái)都是研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)之一。其中人和動(dòng)物的生殖功能受下丘腦弓狀核（ARC）及腹內(nèi)側(cè)核（VMN）等部位的調(diào)節(jié)，Leptin可作用于下丘腦影響GnRH的分泌。但迄今為止，研究人員沒有在GnRH神經(jīng)元上發(fā)現(xiàn)瘦素受體（Ob-R），說(shuō)明瘦素不能直接作用于GnRH神經(jīng)元，只能通過(guò)其它途徑間接發(fā)揮作用［3］。已經(jīng)明確的是，Leptin可以通過(guò)神經(jīng)肽Y（NPY）/刺鼠相關(guān)蛋白（AgRP）、阿片促黑激素皮質(zhì)素原（POMC）、親吻素（Kiss 1）等神經(jīng)元對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸進(jìn)行調(diào)節(jié)。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠Kiss 1神經(jīng)元上的Ob-R，并不影響小鼠青春期的啟動(dòng)和生育，提示在Leptin對(duì)GnRH的調(diào)節(jié)中，還有可能存在其它途徑［2］。

2000年，Tsutsui等發(fā)現(xiàn)了一個(gè)能抑制GnRH釋放的下丘腦神經(jīng)肽，命名為GnIH，它存在于包括哺乳動(dòng)物、鳥類、兩棲動(dòng)物和魚等多種生物的體內(nèi)［4-8］。哺乳動(dòng)物GnIH神經(jīng)元主要位于下丘腦的室周核、背內(nèi)側(cè)核以及背內(nèi)側(cè)核與下丘腦腹內(nèi)側(cè)核之間的區(qū)域［5］。體內(nèi)外給予GnIH可通過(guò)垂體抑制哺乳動(dòng)物和鵪鶉黃體生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的分泌［9-10］。2012年，研究人員發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物GnRH1神經(jīng)元上表達(dá)GnIH-R，明確證明GnIH可通過(guò)直接作用于GnRH1神經(jīng)元抑制生殖功能［6］。

本課題組前期研究已經(jīng)證明，OEP大鼠側(cè)腦室微量注射Leptin后，血中GnRH、LH、FSH水平呈升高-降低-正常水平的波動(dòng)性變化，提示Leptin可通過(guò)作用于上游神經(jīng)元來(lái)發(fā)揮作用。在Leptin影響血中GnRH、LH、FSH水平這一過(guò)程中，GnIH是否發(fā)揮了作用，Leptin是否可通過(guò)調(diào)節(jié)GnIH神經(jīng)元作用于GnRH神經(jīng)元從而發(fā)揮對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)作用還不明了。本研究采用蛋白印跡技術(shù)觀察了側(cè)腦室微量注射Leptin 6h后，OEP大鼠下丘腦GnIH蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示側(cè)腦室注射Leptin可明顯降低下丘腦GnIH的表達(dá)水平。由此，本研究提出Leptin可能通過(guò)抑制GnIH的釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)；Leptin除了通過(guò)NPY/AgRP、POMC、Kiss 1等神經(jīng)元對(duì)GnRH進(jìn)行調(diào)節(jié)之外，還可能通過(guò)GnIH這一途徑，確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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EFFECTS OF MICROINJECTION OF LEPTIN INTO LATERAL VENTRICLE ON GNIH EXPRESSION IN RATS’ HYPOTHALAMUS

WEI Meng， WU Jian， SU Wei， et al

（Chengde Medical College， Hebei Chengde 067000， China）

Objective：To explore the effects of microinjection of leptin into lateral ventricle on gonadotropin-inhibitory hormone （GnIH） expression in rats’ hypothalamus. Methods： 10 female Wistar rats were randomly divided into injection of normal saline 6h group and injection of leptin 6h group （n=5）. The rats in 2 groups were respectively injected 4μl normal saline and 4μl leptin into the lateral ventricle after bilateral ovariectomy and injecting 17β-estradiol. Western blot was used to detect the expression of GnIH in rats’ hypothalamus. Results： Compared with rats in injection of normal saline 6h group，the expression of GnIH in hypothalamus of rats in injection of leptin 6h group reduced obviously （P＜0.05）. Conclusions：Leptin may play a role in regulating the hypothalamic-pituitary-gonadal axis by inhibiting the expression of GnIH.

Lateral ventricle； Leptin； Gonadotropin-inhibitory hormone （GnIH）； Hypothalamic-pituitary-gonadal axis

R338.2

A

1004-6879（2015）02-0091-03

2014-09-30）

* 河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（H2013406115），河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究項(xiàng)目（20130012），河北省人口計(jì)生委科學(xué)研究項(xiàng)目（2012-A22），河北省高校重點(diǎn)發(fā)展學(xué)科“人體解剖與組織胚胎學(xué)”建設(shè)項(xiàng)目資助