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    Fmoc固相合成生長激素釋放肽-2

    2015-11-26 14:37:18王小青尹志峰王良友河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室承德醫(yī)學院中藥研究所河北承德067000
    承德醫(yī)學院學報 2015年2期
    關鍵詞:戴安生長激素多肽

    王小青,鄭 霄,尹志峰,王良友(河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室/承德醫(yī)學院中藥研究所,河北承德 067000)

    Fmoc固相合成生長激素釋放肽-2

    王小青,鄭 霄,尹志峰,王良友
    (河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室/承德醫(yī)學院中藥研究所,河北承德 067000)

    GHRP-2;Fmoc固相合成;純化

    生長激素釋放肽(GHRP)于20世紀70年代末、80年代初依據(jù)蛋氨酸-亮氨酸腦啡肽的結構首次合成[1],之后又合成了數(shù)種類型的GHRP[2]。研究發(fā)現(xiàn),結構改造后的GHRP-2(又名KP-102,藥品名為Pralmorelin,氨基酸序列為D-Ala-(D-β-naphthyl)-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2)具有更強的刺激生長激素釋放和改善兒童生長激素缺乏癥的作用[3-4]。2004年,Pralmorelin用于治療身材矮小癥的Ⅱ期臨床試驗已在日本開始進行[5]。GHRP造價低廉,給藥簡便,在下丘腦生長激素釋放激素無效時仍可產(chǎn)生作用,不影響或少影響生長素的內源節(jié)律性釋放,具有明顯的藥物發(fā)展前景[2,5]。

    20世紀90年代末,王勤等[6-8]采用Merrifild固相法合成了生長激素釋放肽并對其活性進行了測定。但現(xiàn)有的制備方法操作難度大,不利于工業(yè)生產(chǎn),而我們也未檢嚴守紀律到國內以Fmoc固相合成方法合成生長激素釋放肽的文獻。本研究以GHRP-2為研究對象,采用Fmoc固相合成策略,優(yōu)化合成工藝,合成了含有3個D型氨基酸的GHRP-2,以期為工業(yè)化量產(chǎn)提供參考。

    1 儀器與試劑

    1.1 儀器 戴安U3000高效液相色譜儀(UV檢測器,美國戴安公司),Newstyle型反相高效半制備液相色譜儀(蘇州漢邦科技有限公司),戴安液相色譜質譜聯(lián)用儀Ultimate 3000/ MSQ(美國戴安公司),CHRIST凍干機(北京博勵行儀器有限公司),高速大容量離心機(上海安亭科學儀器廠)。

    1.2 試劑 固相合成載體Rink-Amide-AM樹脂(天津南開合成科技有限公司,替代度為0.58mmol/g),肽鏈中所有保護氨基酸(成都誠諾新技術有限公司),HOBt、DIC(蘇州中科天馬肽工程中心有限公司),冰乙醚、TFA(天津市風船化學試劑科技有限公司),哌啶、苯甲硫醚、間甲酚與苯甲醚(上海晶純試劑有限公司),EDT(Sigma-Aldrich),DMF(天津市科密歐化學試劑有限公司),DCM(天津博迪化工股份有限公司)。

    2 方法與結果

    2.1 Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-AM樹脂的制備 在洗凈并干燥的反應柱中,加入896.2mg(0.5mmol)Rink Amide-AM樹脂,加DMF通氮氣溶脹30min,充分溶脹后抽掉DMF,加入適量DBLK溶液(哌啶/DMF(V/V)=1:4)脫Fmoc保護基兩次,時間分別為5min和7min,茚三酮檢測合格后,用DMF和DCM分別洗滌樹脂,抽干溶劑。稱942.0mg(2 mmol)Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 和27.1mg HOBt(2mmol)溶于DMF,冰浴并加入310μl(2mmol)DIC活化5min,加入反應柱反應,茚三酮檢測合格后,抽干,分別用DMF與DCM洗滌樹脂,并進行替代度檢測,加入11ml的醋酸酐與吡啶(V/V,6:5)混合液封閉14小時。沖洗樹脂,加甲醇收縮兩次(5min/次),減壓干燥至恒重,得干燥樹脂0.971g。

    2.2 GHRP-2逐 步 偶 聯(lián) 將2.1制 備 的Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-AM樹脂置于反應柱中,加入DMF溶脹30 min,按照附表進行氨基酸偶聯(lián),偶聯(lián)結束后脫去最后一個氨基酸氨基并用甲醇收縮樹脂,抽干并稱重得GHRP-2肽樹脂1.185g。

    偶聯(lián)D-Phe、D-βNal和D-Ala三個D型氨基酸時反應時間控制在120min以內,反應時間在100min時茚三酮檢測合成效果最好,反應時間越長,粗肽HPLC檢測雜質越多,得率也較低。GHRP-2序列中含有疏水性氨基酸Ala,Phe以及D-βNal等,在反應的過程中添加N-甲基-2吡咯烷酮(NMP)來增強疏水性氨基酸的溶解性,加快反應。見附表:

    附表 固相Fmoc保護策略偶聯(lián)反應的一般程序

    2.3 肽樹脂的裂解 平行稱取干燥至恒重的GHRP-2-Rink Amide-AM樹脂200.0mg 3 份,置于玻璃燒瓶中,分別加入裂解液①TFA:間甲酚(99:1)、②TFA:苯甲硫醚:EDT:苯 甲 醚(9:0.5:0.3:0.2)、③TFA:EDT:間 甲 酚(9.5:0.4:0.1)各2ml,冰浴反應30min,逐漸升至室溫,于室溫下反應1h。過濾,用少許TFA洗滌樹脂,將濾液傾入40ml無水冰乙醚中,析出白色固體,0℃靜置沉降20min。4000 r/min離心4min,棄去上清液,重復5次,真空干燥至恒重,得白色固體。

    2.4 粗肽的純化與鑒定 粗肽無氧水溶解,加少量醋酸助溶,置于4℃冰箱放置過夜。半制備液相條件:半制備柱Hedera ODS-2反相硅膠柱(20×250mm,10μm);檢測波長215nm;采用乙腈/0.1%TFA水分離體系,流速8ml/min,乙腈25%-55%,洗脫時間30min。純化后樣品經(jīng)戴安U3000高效液相分析,反相柱Kromasil C18(4.6×250mm,5μm),以乙腈/水為分析體系(0.1%TFA),乙腈5%-95%,流速1ml/ min,20min梯度洗脫,檢驗洗脫液純度。粗肽純度為80%,經(jīng)半制備液相純化得GHRP-2純度大于99.0%。結構經(jīng)ESIMS分析確證,質譜圖顯示[M+H]+峰m/z 818.6,[M+H]2+ 峰m/z 410.0,質譜數(shù)據(jù)與理論值相符。

    3 討論

    GHRP-2含有D-氨基酸和β-氨基酸,產(chǎn)物結構與活性密切相關,環(huán)境對產(chǎn)物影響較大,易發(fā)生消旋、氧化等副反應,產(chǎn)率也較其它多肽產(chǎn)品低。本研究選擇消旋率小的縮合體系,控制反應時間和反應溫度,優(yōu)化裂解條件和純化手段得到純度大于99.0%的目標產(chǎn)物。

    固相合成中固相載體的選擇非常關鍵,不僅關系到合成速率,對合成目標肽的純度、收率都有重要的影響。本研究選用的Rink Amide-AM樹脂主要用來合成末端羧基氨基化的多肽[9-10],同時,在實驗過程中對不同替代度的樹脂進行了比較,發(fā)現(xiàn)樹脂替代度在0.4-0.45mmol/g時產(chǎn)物的得率和純度最好。根據(jù)氨基酸種類選擇三種裂解液配比與裂解方法進行了平行比較,結果粗肽得率無統(tǒng)計學差異。因此,本研究選擇成本最低的TFA:間甲酚=99:1進行裂解。溫度、反應時間和裂解試劑劑量是實驗中重要的影響條件。

    采用F moc固相合成方法合成GHRP-2,該方法簡單,目標產(chǎn)物得率與純度較高,能夠為工業(yè)化量產(chǎn)提供理論依據(jù)。

    [1]Bowers CY, Momany F, Reynolds GA, et al. Structure-Activity Relationships of a Synthetic Pentapeptide that Specifically Releases Growth Hormone in Vitro[J]. Journal of Endocrinological Investigation, 1980,106(3):663-670.

    [2]陳晨.生長素釋放肽的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展及展望[J].基礎醫(yī)學與臨床,2002,22(1):1-5.

    [3]Wu D, Chen C, Katoh K, et al. The effect of GH-Releasing Peptide-2 (GHRP-2 or KP 102) on GH secretion from primary cultured ovine pituitary cells can be abolished by a specific GH-Releasing Factor (GRF) receptor antagonist[J]. Journal of Endocrinological Investigation, 1994, 140(2):R9-13.

    [4]Pralmorelin.改善兒童生長激素缺乏癥[J].國外醫(yī)藥-合成藥生化藥制劑分冊,1999,20(2):81-82.

    [5]厲保秋.多肽藥物研究與開發(fā)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2011.185.

    [6]王勤,高立偉,胡小愚,等.生長激素釋放肽(GHRP)的合成及促生長效應[J].蘭州大學學報(自然科學版),1996,32(1):98-101.

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    [10]鄭彥慧,張艷平,張浩.Rink Amide樹脂結構對多肽合成的影響研究[J].離子交換與吸附,2008,24(6):563-569.

    (技術方法欄目編輯:張 ?。?/p>

    R914.5

    A

    1004-6879(2015)02-0144-03

    2014-09-13)

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