芬戈莫德研發(fā)歷程概述

鈕俊興，胡立宏

（中國科學院上海藥物研究所，中藥現(xiàn)代化中心，上海　201203）

芬戈莫德研發(fā)歷程概述

鈕俊興，胡立宏

（中國科學院上海藥物研究所，中藥現(xiàn)代化中心，上海201203）

芬戈莫德是以真菌的次級代謝產物ISPI為苗頭化合物所研發(fā)的免疫調節(jié)劑，于2010年被FDA批準上市，用以治療免疫性疾病多發(fā)性硬化癥。與傳統(tǒng)的免疫抑制劑不同，它不影響淋巴細胞的活化和增殖，主要作用于細胞表面的1-磷酸鞘氨醇（S1P）受體來發(fā)揮免疫抑制和免疫調控作用。本文通過梳理芬戈莫德的研發(fā)流程，闡述結構優(yōu)化和改造步驟，為藥物化學研究提供經(jīng)驗。

芬戈莫德；ISP-I；多發(fā)性硬化癥免疫調節(jié)劑

專家簡介

胡立宏，男，中國科學院上海藥物研究所研究員、研究組長、博士生導師，研究工作主要涉及“基于中草藥資源的藥物發(fā)現(xiàn)”研究領域?，F(xiàn)任世界中醫(yī)藥學會聯(lián)合會中藥分析專業(yè)委員會理事、中國植物學會民族植物學分會理事、上海市藥學會天然藥化專業(yè)委員會委員、上海市口腔醫(yī)學重點實驗室學術委員會委員，以通訊作者身份在Journal of Neuroscience，Chemistry&Biology，Journal of Medicinal Chemistry，Diabetes，Green Chemistry，Organic Letters等國際主流刊物上發(fā)表研究論文190余篇，獲得發(fā)明專利授權10余項。2009年以“天然藥物化學”研究方向獲得“國家杰出青年基金”資助，并入選“中國科學院百人計劃”，2012年獲得了“上海市優(yōu)秀學科帶頭人”稱號。

1　背景

多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)蛋白質炎性脫髓鞘病變?yōu)橹饕攸c的自身免疫病。目前全球約有250萬人受MS困擾，多發(fā)于20～40歲青年人群，女性患者為男性兩倍［1］。發(fā)病原因未知，一般認為與遺傳、環(huán)境、自身免疫等因素有關。MS最常累及的部位為腦室，會造成不可逆的神經(jīng)損傷，并因此產生廣泛的癥狀，諸如肢體無力、精神異常、共濟失調、視力衰退等［2］。

目前，臨床上用于治療MS的藥物有免疫調節(jié)劑、免疫抑制劑和抗炎藥3類［3］，但這些藥物對于MS的治療療效不顯著且副作用大。因此，人們迫切需要一種療效好，病人依從性好，副作用小的藥物。而芬戈莫德（Fingolimod）的出現(xiàn)，為廣大患者帶來了福音。

芬戈莫德是來源于天然產物的、首個口服給藥的用于治療MS的新型免疫抑制劑。它通過調節(jié)神經(jīng)細胞的1-磷酸鞘氨醇（S1P）受體，使淋巴細胞回流至淋巴結從而起到降低MS復發(fā)頻率、延緩病程的作用［4，5］。

2　芬戈莫德的研發(fā)歷程

2.1苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)20世紀中葉后，隨著青霉素類抗生素的興起，從細菌、真菌的代謝產物中尋找活性物質成為潮流，日本科學家藤田也不例外，他的研究對象是真菌辛克萊蟲草（Cordyceps sinclairii）和其近親冬蟲夏草（Cordyceps sinensis），并在20世紀80年代末分離得到化合物ISP-I［6，7］。

ISP-I有較強的免疫抑制活性，與已有抗MS藥物環(huán)孢素A（CsA）相比，體外活性是后者的5～10倍，體內活性是其10～100倍［8］。但是，該化合物的毒性比CsA大100倍，且溶解度低，成藥性差；同時手性原子較多，結構相對復雜，想要成為藥物用于臨床還需進一步的結構優(yōu)化。

因此，藤田小組決定以ISP-I作為苗頭化合物（Hit），從結構簡化角度入手，通過進一步的結構優(yōu)化獲得成藥性更佳的候選化合物。

為了定量的衡量和評價所得化合物的免疫抑制活性，藤田小組設計了兩種生物學模型來評價化合物的免疫抑制作用：分別是體外的T細胞活性抑制實驗和體內的小鼠間皮移植實驗［9］。體外試驗通過測定T細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）來表征化合物免疫抑制活性；體內實驗通過測定小鼠皮移植后平均存活時間（MST），間接評價化合物抑制活性和毒性。

2.2先導化合物的確定藤田小組在得到真菌次生代謝產物—化合物1（ISP-I）的同時，同時還得到其同系物2（Mycestericin D）、3（Mycestericin E）、4（Mycestericin F）和5（Mycestericin G）［10］，其結構如表1所示。

分析表1的數(shù)據(jù)，可以得出初步的結構與活性的關系：化合物2與1比較，其少了4-OH，活性略微下降，說明4-OH為活性非必需基團，可以除去；化合物2與3活性相差不大，說明3-OH的構型與活性無關；6、7位雙鍵還原后的化合物4和5活性顯著下降，說明6，7位雙鍵是活性必須的。

2.2.114位羰基的必要性為研究14位羰基的必要性，藤田小組設計、合成了化合物6、7，如表1所示。

比較化合物1、6、7的活性數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，將羰基還原為羥基活性略有下降；將羰基轉變?yōu)閬喖谆钚月杂刑嵘?，說明羰基并非活性必須基團，將其還原為亞甲基可簡化結構，并提高活性。

表1　化合物1～7對T細胞抑制活性數(shù)據(jù)表

2.2.22位手性碳構型與活性關系再次分析原型化合物1的結構，其2位是一個手性碳，合成難度較大，不利于進一步修飾改造；同時1又包含酸、堿兩性結構和親水、親脂的兩性結構，水溶性低。于是藤田小組又嘗試探索2位手性碳構型和羧基對于活性的影響，設計并合成了一系列化合物8～11［11］，見表2。

表2　化合物8～11對T細胞抑制活性數(shù)據(jù)表

比較化合物1和8發(fā)現(xiàn)，2位手性碳構型與活性無關，1-COOH可還原為1-CH2OH；化合物10、11的活性喪失進一步驗證了對脂肪鏈進行構象限制對生物活性是至關重要的。

2.2.3脂肪鏈鏈長與活性關系接下來，藤田小組考察脂肪鏈長度與活性的關系，為此，他們設計了一系列化合物12a～12j［12］，如表3所示。

分析表3的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)當脂肪鏈碳原子數(shù)目為15（12f）或14（12e）時，化合物活性均較好；而碳原子數(shù)目大于15或小于14時，化合物的活性均顯著降低；進而以口服給藥方式繼續(xù)比較12e和12f的體內活性（見表7），結果顯示，當給藥劑量為30 mg·kg-1時，CsA的MST為20.5d，12e為52.2d，而12f則表現(xiàn)出毒性?；衔?2e口服給藥下的生存期明顯長于化合物12f和陽性對照藥CsA，因此，可以確定脂肪鏈長度為14的碳原子時，其活性較好，毒性較小。

表3　化合物12a～12j對T細胞抑制活性數(shù)據(jù)表

根據(jù)以上結果，藤田小組決定以12e為先導化合物，進行進一步的結構優(yōu)化?；衔?2e的結構由右側親脂部分和左側親水部分組成，因此接下來將分別對這2個部分進行修飾改造。

2.3親脂部分改造

2.3.1引入芳香環(huán)由上文已知脂肪鏈上6、7位雙鍵對于化合物活性是必不可少的，分析原因可能是脂肪鏈柔性過大，而雙鍵可起到限制構象以及π-π堆積的作用。于是藤田小組嘗試引入苯環(huán)，在保持脂肪鏈碳原子總數(shù)為14的同時，獲得了苯環(huán)處于不同位置的系列化合物14～21，見表4。

表4　化合物13～21對T細胞抑制活性數(shù)據(jù)表

分析表4的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)化合物16活性較好，證明猜想正確：即引入苯環(huán)可以限制構象，提高化合物生物活性；同時也得知芳香環(huán)與親水部分之間間隔2個碳原子的距離為佳。

2.3.2苯環(huán)右側脂肪鏈鏈長與活性關系由上文已知，引入苯環(huán)可提高活性，且環(huán)與親水部分需間隔2個碳原子。隨后，藤田小組又合成了一系列化合物22～28，用以確定苯環(huán)右側脂肪鏈長度與活性的關系，如表5所示。

表5　化合物22～28對T細胞抑制活性表

分析表5的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在保證苯環(huán)與親水部分間隔兩個碳原子的前提下，化合物活性對苯環(huán)上的脂肪鏈取代基長度不明感，因為化合物22～28大多具有良好的生物活性。其中活性最好的化合物23因體內活性弱于化合物16（見表7），故藤田小組決定保持苯環(huán)上連接正辛基，即以化合物16繼續(xù)進行改造。

2.3.3苯環(huán)與脂肪鏈連接部分改造接著，藤田小組又合成了化合物29～34，嘗試對苯環(huán)和脂肪鏈的連接部分進行改造，化合物結構與活性如表6所示。

表6　化合物29～34對T細胞抑制活性表

分析表6的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)化合物29有與16相當?shù)幕钚裕湓隗w內中，3 mg·kg-1情況下顯示出毒性（見表7）；引入氧原子的32也具有與16相當?shù)幕钚?，但MST比16短；引入硫原子所得的33活性也很好，遺憾的是毒性也隨之增大；引入含氮基團所得的31與34活性較差。

以上結論說明芐位的改造不利于化合物活性的提高和毒性的降低。

2.3.4苯環(huán)上脂肪鏈取代基位置確定隨后藤田小組合成了化合物35、36，用來確定苯環(huán)上脂肪鏈取代基位置對于化合物活性的影響，如表8所示。

表7　相關化合物小鼠皮移植存活時間表

分析表8的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)脂肪鏈取代基位于苯環(huán)對位時活性最高，而位于鄰位、間位時活性喪失。

表8　取代基位置與T細胞抑制活表

綜合以上結果，化合物12e親脂部分的結構優(yōu)化得到藥物候選物16。

2.4親水部分改造接下來藤田小組對先導化合物12e的親水部分也進行了結構優(yōu)化?？紤]到“2.3.3”中芐位引入氧原子有可能提高化合物生物活性，于是，設計了相關化合物37～47，分別考察芐位原子和親水部分的取代基對于化合物活性的影響，結構與活性如表9所示。

分析表9的數(shù)據(jù)可知，參照ISP-I結構將羥甲基氧化為羧基、或直接去除都會使化合物活性大大下降（化合物37、38）；將羥甲基鏈長伸長也會使活性小幅度下降（化合物45～47），說明羥甲基不是一個合適的改造位點；而在芐位引入氧原子的情況下，化合物39～45的體外活性相對于16均有一定程度的下降，說明芐位引入雜原子不利于生物活性的保持。

表9　化合物37～47對T細胞的抑制活性

綜合以上結果，藤田等選擇化合物16（FTY720）作為候選化合物進行臨床研究，在順利通過Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期臨床后，于2010年被FDA批準上市，用于治療MS，這也是首個口服給藥的用于治療MS的新型免疫抑制劑。

3　芬戈莫德治療MS機制研究

Brinkmann等［1］對芬戈莫德的抗MS機制進行了細致的研究，得到了有趣的結果。

鞘氨醇（sphingosine）被鞘氨醇激酶2磷酸化形成S1P（見圖1）是產生T細胞與B細胞級聯(lián)反應的起始步驟。而S1P是5個不同的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）的激活劑，這些G蛋白偶聯(lián)受體的激活是淋巴結淋巴細胞在體內釋放的必要過程［13，14］。

圖1　鞘氨醇和S1P結構圖

淋巴細胞的過度釋放，會導致諸如MS、內部炎癥、細胞凋亡等多種病理過程。目前MS的治療藥物有CsA和他克莫司（FK506），其機理是通過抑制絲氨酸棕櫚酰轉移酶從而抑制鞘氨醇的生物合成，使相關的S1P受體1～5不能激活，最終抑制T細胞和B細胞的釋放，使身體不能產生任何免疫反應，起到緩解MS的作用。

而抗MS新藥芬戈莫德（Fingolimod）具有獨特和新穎的作用機制：芬戈莫德一旦吸收入血，將迅速被鞘氨醇激酶2磷酸化成磷酸化芬戈莫德（見圖2），后者與內源性配體S1P具有結構相似性，因而能夠競爭性的結合到 S1P受體上，起到阻斷 GPCRs信號傳導的作用［4，15］。母體芬戈莫德沒有任何受體結合能力，體內藥代動力學研究也已證實，口服芬戈莫德后，磷酸化芬戈莫德的血藥濃度是其母體的4倍［16，17］，這也是其得以發(fā)揮藥理活性的基礎。

圖2　芬戈莫德和磷酸化芬戈莫德結構圖

4　總結

藤田在發(fā)現(xiàn)天然產物ISP-I的免疫抑制活性后，通過分析確定了以化合物12e作為先導化合物，進行了進一步的結構修飾與改造，獲得活性化合物16（FYP720，芬戈莫德），并最終于2010年被FDA批準上市［18］，它的優(yōu)化過程對我們啟示頗多。

4.1簡化結構、去除手性原子。最初發(fā)現(xiàn)的天然產物ISP-I具有3個手性中心，結構較為復雜，合成困難，不利于進一步研究。藤田組首先就探索了手性碳原子的必要性，在確定了其不影響活性后，改用去手性衍生物進行后續(xù)探索。利用藥物改造的基本思想，在進一步簡化了結構的同時，提高了化合物活性，降低了合成難度和成本，使得后續(xù)的大規(guī)模生產成為可能。

4.2增加溶解度，降低毒性。前體化合物ISP-I的水溶解性很低且毒性大，因此藤田小組在保證活性的基礎上，通過生物電子等排、保持藥效團等手段改善了化合物的水溶性，同時使毒性降低到可接受范圍內，推動了其走向臨床的過程。

4.3合理的篩選模型。芬戈莫德是在受體未知的情況下，基于藥物化學理論改造出的藥物，而后續(xù)的藥理研究表明，它其實是個前藥，在體內通過形成磷酸化活性物質發(fā)揮作用。如果藤田采用分子水平模型而非細胞水平模型，那么將會與此化合物失之交臂。正是這種曲折歷程，才讓藥物化學這門學科總是神秘與驚喜并存，令無數(shù)藥化工作者流連忘返。

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A research and development overview of Fingolimod

NIU Jun-xing，HU Li-hong
（Shanghai Research Center for Modernization of Traditional Chinese Medicine，Shanghai Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201203，China）

Fingolimod（FTY720），a novel immunomodulator agent，is developed from ISP-I，which is a secondary metabolites of fungi.It was approved by FDA in 2012 for the treatment of autoimmune disease multiple sclerosis.Unlike the traditional immunosuppressive agents，fingolimod exerts immunosuppressive and immunoregulatory functions mainly through interaction with shhingosine-1-phosphate（S1P）receptors on the cell surface without affecting activation and proliferation of lymphocyhtes.This article briefly reviewed the development process of fingolimod，elaborate the structural optimization and transformation，in order to provide experience for chemical rsearch.

Finglimod；ISP-I；Multiple Sclerosis；Immunomodulator

R979.1

A

2095-5375（2015）12-0683-006

國家自然科學基金面上項目（No.81473110）