產(chǎn)腦苷脂雞樅菌Termitomyces clypeatus CTM-1的分子生物學(xué)鑒定及生長特性研究

花衛(wèi)俊，繆冶煉，陳介余，尤業(yè)兵，孫 唱，袁麗紅，許 琳

（1.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.日本秋田縣立大學(xué) 生物資源學(xué)部，日本 秋田 010-0195；3.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800）

產(chǎn)腦苷脂雞樅菌Termitomyces clypeatus CTM-1的分子生物學(xué)鑒定及生長特性研究

花衛(wèi)俊1，繆冶煉1，陳介余2，尤業(yè)兵1，孫 唱1，袁麗紅3，許 琳3

（1.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.日本秋田縣立大學(xué) 生物資源學(xué)部，日本 秋田 010-0195；3.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800）

腦苷脂A和B具有顯著的鎮(zhèn)痛作用和腦神經(jīng)保護(hù)作用。雞樅菌（Termitomyces clypeatus）子實體含有腦苷脂A和B，但是野生雞樅菌子實體資源稀少。筆者在前期研究中以野生雞樅菌子實體為原料，通過組織分離、菌種純化及篩選，培育出菌株CTM-1。本研究中，采用分子生物學(xué)方法鑒定了菌株CTM-1與雞樅菌的菌種同源性，測定了該菌株平板培養(yǎng)、液體培養(yǎng)中菌絲體的生長速率和腦苷脂含量。實驗結(jié)果表明：菌株CTM-1及其出發(fā)野生子實體與Termitomyces clypeatus的同源性為99%。在PDAY平板培養(yǎng)中，菌落直徑的增長速率在27 d內(nèi)基本穩(wěn)定在1.5 mm/d。比菌落直徑增長速率在1 d時為0.21 d-1，然后逐漸下降。在DPt液體培養(yǎng)中，9 d以后為菌絲體生長的穩(wěn)定期，此時的生物量為3.57 g/L。比菌絲體生長速率在1 d時為2.00 d-1，然后逐漸下降。菌絲體的腦苷脂A、B含量分別為0.152%、0.066%。由此可見，雞樅菌CTM-1的大規(guī)模培養(yǎng)可以成為腦苷脂A、B原料生產(chǎn)的有效途徑。關(guān)鍵詞：雞樅菌；菌絲體；腦苷脂；平板培養(yǎng)；液體培養(yǎng)

腦苷脂是單糖或低聚糖與神經(jīng)酰胺末端羥基結(jié)合所形成的一類化合物，是動物、植物、真菌和海洋生物細(xì)胞膜/壁的結(jié)構(gòu)成分。腦苷脂在細(xì)胞分化、細(xì)胞凝集、細(xì)胞骨架的遷移、跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，還具有調(diào)控細(xì)胞生長、腫瘤抑制活性、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)、抗菌抗病毒等生物學(xué)活性［1］。

Qi等［2-3］從雞樅菌子實體中成功分離出腦苷脂A～F。其中，腦苷脂A和B的結(jié)構(gòu)式見圖1。腦苷脂A和B作為新型鎮(zhèn)痛藥物，具有鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)、持續(xù)時間長、無明顯副作用、沒有藥物成癮和藥物耐受反應(yīng)等特點(diǎn)。通過腹腔注射、口服、皮膚涂抹等途徑給藥，都顯示對神經(jīng)性疼痛和炎性疼痛的鎮(zhèn)痛作用，生物利用度高達(dá)46.7%［4］。此外，腦苷脂A和B能通過血腦屏障，減小缺血后的腦梗塞面積和神經(jīng)細(xì)胞死亡，減輕腦水腫，促進(jìn)腦卒中后運(yùn)動和認(rèn)知功能的恢復(fù)［5-7］。由于腦苷脂A和B對神經(jīng)的多靶點(diǎn)具有保護(hù)作用，其治療腦卒中的有效時間超過26 h［7-9］。

圖1 腦苷脂A和B的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of cerebroside A and B

為了防止世界上瘋牛病發(fā)生對藥物安全帶來的危害，腦苷類化合物來源需要從動物腦組織轉(zhuǎn)向植物、食用菌等。雞樅菌是一種肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富的野生珍稀食（藥）用菌，但是雞樅菌只能在貴州、云南、四川等省的山區(qū)生長，而且采收季節(jié)性強(qiáng)。另外，由于雞樅菌與白蟻共生，其子實體僅能在白蟻巢上生長，至今還沒有實現(xiàn)雞樅菌子實體人工培養(yǎng)的產(chǎn)業(yè)化。因此，雞樅菌資源稀少、價格昂貴。這些問題是腦苷脂A和B成藥的瓶頸。

筆者在前期研究中以野生雞樅菌子實體為原料，采用組織分離、菌種純化及篩選的方法，培育出菌株CTM-1［10］。通過菌株 CTM-1的大規(guī)模培養(yǎng)，可以生產(chǎn)出制備腦苷脂A和B的菌絲體，克服野生雞樅菌子實體生產(chǎn)在地域、季節(jié)和產(chǎn)量等方面受限制的困難。本研究采用分子生物學(xué)方法鑒定菌株CTM-1與雞樅菌的菌種同源性。此外，為了探明該菌株的生長特性，測定平板培養(yǎng)、液體培養(yǎng)中菌絲體的生長速率和腦苷脂含量。

1 材料與方法

1.1 雞樅菌子實體及菌種

新鮮雞樅菌子實體采自云南省紅河州建水縣山區(qū)。用自來水清洗后，裝入密封袋中，在-20℃條件下凍藏。使用前，分別用無菌水和75%乙醇和無菌水各清洗一次，作為子實體試樣。

以新鮮雞樅菌子實體為原料，通過組織分離、菌種純化及篩選獲得菌種CTM-1［10］。用接種鉤將菌種接至PDAY斜面培養(yǎng)基上，在28℃下培養(yǎng)至菌絲長滿斜面，置于4℃的冰箱中保存，并定期轉(zhuǎn)接活化。

1.2 主要試劑

Wizard? Genomic DNA Purification Kit試劑盒，普洛麥格生物技術(shù)有限公司；NS1、NS4、Taq DNA聚合酶、dNTPs，寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

PDAY培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯浸出粉15，葡萄糖20，酵母浸粉2，瓊脂20。采用1 mol/L的檸檬酸調(diào)節(jié)pH至5.0，121℃滅菌20min，倒斜面及平板。

DPt液體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，MgSO40.75，KH2PO41.5。采用1 mol/L的檸檬酸調(diào)節(jié)pH至5.0，115℃滅菌30min。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

采用分子生物學(xué)方法對子實體及菌絲體的菌種同源性進(jìn)行鑒定。

1.4.1 菌絲體準(zhǔn)備

用接種鉤挑取斜面菌種接入裝有200mL液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在28℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行發(fā)酵液的抽濾，收集菌絲體，分別用75%乙醇和無菌水各清洗1次，作為菌絲體試樣。

1.4.2 基因組的提取

按照Wizard? Genomic DNA Purification Kit試劑盒說明書的方法，進(jìn)行子實體和菌絲體基因組的提取。

1.4.3 18S rRNA的PCR擴(kuò)增和測序

擴(kuò)增引物采用通用引物（上游引物 NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′；下游引物NS4：5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′），采用 9700型PCR擴(kuò)增儀（北京麥百金科技有限公司）進(jìn)行子實體和菌絲體基因組的18S rRNA擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：4μL dNTP、5μL 10×Taq buffer（Mg2+free）、2μL NS1、2μL NS4、2μL模板DNA、1μL Taq酶，用超純水定容至50μL；PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性 5min、98℃變性10 s、55℃退火30 s、72℃延伸60 s、30個循環(huán)、72℃延伸10min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢驗通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行。瓊脂糖凝膠電泳中，瓊脂糖質(zhì)量濃度為8 g/L，電泳電壓為190 V，緩沖液為TBE緩沖液，時間為15min。

18S rRNA序列分析根據(jù)Sanger雙脫氧鏈終止法，采用ABI 3730型DNA測序儀（天津金思德生物有限公司）進(jìn)行。

1.4.4 18S rRNA進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用序列局部相似性查詢系統(tǒng)BLAST（美國國立生物技術(shù)信息中心），將子實體、菌絲體的18S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫（美國國立生物技術(shù)信息中心）中的所有序列進(jìn)行比較，找出序列相似的菌種，并用MEGA4.1軟件進(jìn)行匹配排列，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 平板培養(yǎng)

用孔徑5 mm的無菌打孔器從平板菌落邊緣部取出菌絲長勢均勻、直徑為5 mm的圓形菌塊，接入新的PDAY平板培養(yǎng)基，每個平板培養(yǎng)基上接3個菌塊。28℃恒溫培養(yǎng)，定期用十字交叉法測量菌落直徑，觀察菌落顏色形態(tài)和長勢。每次菌落直徑測定采用9個試樣，取平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.6 液體培養(yǎng)

用孔徑5 mm的無菌打孔器從平板菌落邊緣部取出長勢均勻的圓形菌落，接入裝有200mL液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，每瓶接3個菌落。在28℃、150r/min條件下培養(yǎng)3 d，作為種子液。此時，種子液中的菌體呈短小、均勻的菌絲狀，有利于提高種子液轉(zhuǎn)接時接種量的均勻程度。

將種子液按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入裝有30mL液體培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，共接18瓶。在28℃、150r/min條件下培養(yǎng)10 d。從第2天開始，每天取出2瓶發(fā)酵液，抽濾，收集菌絲體，在105℃下干燥4 h，測量菌絲體干質(zhì)量。

1.7 腦苷脂含量測定

1.7.1 試樣處理

稱取菌絲體（或子實體）試樣1.0 g、石英砂3.0 g于研缽中，加入甲醇5mL，于冰浴中研磨10min。將勻漿全部移入試管中，加入20mL的二氯甲烷-甲醇溶液（體積比1∶1），在室溫條件下超聲處理2 h，靜置。浸提液用0.45μm濾膜過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至適當(dāng)體積，作為提取物。取提取物1mL，再用等體積的二氯甲烷-甲醇溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，作為測試液。

1.7.2 液相色譜-質(zhì)譜分析

測試樣的腦苷脂A和B含量采用LC-MS/MS系統(tǒng)，LC-10AD型液相色譜儀（LC），日本島津公司；API 3000型質(zhì)譜（MS），美國AB SCIEX公司）進(jìn)行測定。

1）液相色譜分析條件 色譜柱為Agela Venusil XBP C8（50 mm×2.1 mm，5μm）；柱溫為室溫；流動相A為甲酸和10 mmol/L甲酸銨溶液（體積比1∶999）；流動相B為甲酸和甲醇（體積比1∶999）；洗脫按表1程序進(jìn)行梯度洗脫；進(jìn)樣量10μL。

2）質(zhì)譜分析條件 電噴霧離子源（ESI）；正離子模式；離子噴霧電壓3 000 V；離子源溫度400℃；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描方式。

腦苷脂A和B的標(biāo)準(zhǔn)品按文獻(xiàn)［8］制備，其純度為99.5%。采用100%甲醇溶液，制備質(zhì)量濃度分別為4、20、80、200、500、1 000和2 000 ng/mL的腦苷脂A標(biāo)準(zhǔn)品溶液，質(zhì)量濃度分別為25、50、150、300、400、500、600和750 ng/mL的腦苷脂B標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以離子流信號強(qiáng)度的峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，繪制各成分含量測定用的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 液相色譜洗脫程序Table 1 Elution schedule in HPLC

在腦苷脂A質(zhì)量濃度0～2 000 ng/mL的范圍內(nèi)，峰面積與腦苷脂A濃度之間的關(guān)系見式（1）。

式中：Aa為腦苷脂A的峰面積，counts；ρa(bǔ)為腦苷脂A的質(zhì)量濃度，ng/mL。

在腦苷脂B質(zhì)量濃度0～750 ng/mL的范圍內(nèi)，峰面積與腦苷脂B質(zhì)量濃度之間的關(guān)系見式（2）。

式中：Ab為腦苷脂B的峰面積，counts；ρb為腦苷脂B的質(zhì)量濃度，ng/mL。

1.7.3 腦苷脂含量計算

菌絲體和子實體中腦苷脂A或B的含量Mc分別以菌絲體、子實體的干物基準(zhǔn)表示，其計算見式（3）。

式中：ρt為測試液中腦苷脂 A或B的質(zhì)量濃度，g/mL；Vt為測試液的體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為菌絲體或子實體試樣的質(zhì)量，g；Mm為菌絲體或子實體試樣的濕物基準(zhǔn)含水率。

2 結(jié)果與討論

2.1 子實體和菌絲體的菌種同源性

對子實體和菌絲體的菌種同源性進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：子實體和菌絲體的18S rRNA片段大小一致，大約為1 500 bp。通過比對子實體和菌絲體的18S rRNA序列（登錄號分別為KM657823、KM657824）發(fā)現(xiàn)，子實體和菌絲體的18S rRNA在478、479和480位點(diǎn)上有堿基差異。在這3個位點(diǎn)上，子實體的堿基分別為T（胸腺嘧啶）、A（腺嘌呤）和C（胞嘧啶），而菌絲體的堿基分別為C（胞嘧啶）、T（胸腺嘧啶）和A（腺嘌呤）。菌株CTM-1及其出發(fā)子實體（Fruiting body-5）均與盾尖雞樅菌Termitomyces clypeatus有99%的同源性，菌株CTM-1與出發(fā)子實體（Fruiting body-5）之間也有99%的同源性。鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），從進(jìn)化樹看出本實驗的子實體和菌株CTM-1均為盾尖雞樅菌T.clypeatus。

圖2 子實體和菌絲體的18S rRNA電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of the 18S rRNA of fruiting body and mycelia

圖3 基于18S rRNA序列及鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 18S rRNA sequence and neighbor-joining method

食用菌菌種的鑒定主要有形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。形態(tài)學(xué)方法主要根據(jù)子實體形態(tài)進(jìn)行鑒定，而雞樅菌子實體無法通過菌絲體的人工栽培獲得，因此其菌絲體的菌種鑒定不能采用形態(tài)學(xué)方法。與形態(tài)學(xué)方法相比，分子生物學(xué)方法不但適用于子實體，而且還適用于菌絲體的鑒定，已被廣泛應(yīng)用［11-13］。筆者采用分子生物學(xué)方法，成功鑒定了菌株CTM-1及其出發(fā)子實體與盾尖雞樅菌T.clypeatus的同源性，為雞樅菌菌絲體的大規(guī)模培養(yǎng)提供了技術(shù)依據(jù)。

2.2 菌絲體的生長特性

圖4為雞樅菌CTM-1的菌絲體照片。由圖4可知：菌絲體無色，分支較少，有橫隔膜，未見鎖狀聯(lián)合，菌絲體的直徑約為5～7μm。

圖4 雞樅菌CTM-1的菌絲體照片（×600倍）Fig.4 Picture of the mycelia of T.clypeatus CTM-1（×600）

雞樅菌CTM-1平板培養(yǎng)過程中，菌落直徑及比菌落直徑增長速率的變化如圖5所示。由圖5可知：菌落直徑的增長速率在27 d內(nèi)基本一定，然后逐漸下降。27 d時，菌落直徑達(dá)到43.9 mm，培養(yǎng)期間的平均增長速率為1.5 mm/d。比菌落直徑增長速率在1 d時為0.21 d-1，然后逐漸下降，27 d下降到0.02 d-1。據(jù)文獻(xiàn)［14］報道，T.albuminosus、T.fulginosus、T.cylindricus、T.Aurantiacus和T.microcarpus等5種雞樅菌在25℃、PDA平板培養(yǎng)基、30 d的培養(yǎng)條件下，菌落直徑的平均增長速率分別為1.3、1.7、1.1、2.0和2.0 mm/d，而雞樅菌10-1和雞樅菌10-2在28℃、PDA平板培養(yǎng)基、30 d的培養(yǎng)條件下，菌落直徑的平均增長速率分別為7.5和12.9 mm/d［15］。由此可見，平板培養(yǎng)中的菌落直徑增長速率受到菌種和培養(yǎng)條件的影響。

圖5 雞樅菌CTM-1平板培養(yǎng)過程中菌落直徑及比菌落直徑增長速率的變化Fig.5 Change of colony diameter and specific colonydiameter increasing rate in the plate culture of T.clypeatus CTM-1

圖6為平板培養(yǎng)0、14和27 d時的菌落照片。在培養(yǎng)初期，菌落呈致密的絨毛狀，匍匐生長在培養(yǎng)基表面，中部稍凸，邊緣整齊，表面有褶皺。27 d后，隨著菌絲體的老化，其顏色由純白色轉(zhuǎn)為棕色?？偟膩碚f，雞樅菌平板培養(yǎng)的菌落可以分為菌絲型、孢子型和中間型［16］。雞樅菌CTM-1的菌落特征與菌絲型一致。

圖6 雞樅菌CTM-1在不同平板培養(yǎng)時間的菌落形態(tài)Fig.6 Colony morphology of T.clypeatus CTM-1 at different plate-culture time

雞樅菌CTM-1液體培養(yǎng)過程中，生物量及比菌絲體生長速率的變化如圖7所示。由圖7可知：菌絲體生長可以分為0～2 d的延滯期、3～8 d的對數(shù)期以及9 d以后的穩(wěn)定期。穩(wěn)定期的生物量約為3.57 g/L。比菌絲體生長速率在1 d時為2.00 d-1，然后逐漸下降。

圖7 雞樅菌CTM-1液體培養(yǎng)過程中生物量及比菌絲體生長速率的變化Fig.7 Change of biomass and specific mycelium growth rate in the liquid culture of T.clypeatus CTM-1

2.3 菌絲體中腦苷脂A和B的含量

圖8為腦苷脂A和B標(biāo)準(zhǔn)品的二級質(zhì)譜圖。腦苷脂A和腦苷脂B的相對分子質(zhì)量分別為727和755。由圖1可知，腦苷脂A和B均是由葡糖基與含氮的鞘氨醇及脂肪酸連接而成。圖8（a）中，m/z= 728.6的峰為腦苷脂 A的［M+H］+。m/z=710.8、m/z=566.6、m/z=548.7和m/z=530.8的峰分別對應(yīng)腦苷脂A的［M+H-H2O］+、［M+H-C6H10O5］+、［M+H-C6H12O6］+和［M+H-C6H12O6-H2O］+。圖8（b）中，m/z=756.7的峰為腦苷脂B的［M+H］+。m/z= 738.6、594.5、576.5和558.7的峰分別對應(yīng)腦苷脂B的［M+H-H2O］+、［M+H-C6H10O5］+、［M+H-C6H12O6］+和［M+H-C6H12O6-H2O］+，因此，用于腦苷脂A和B定量分析的離子對分別為m/z=728.6/548.7和m/z= 756.7/576.5。

菌絲體、子實體的腦苷脂A和B含量如表2所示。菌絲體通過雞樅菌CTM-1的液體培養(yǎng)制備而成，子實體按照取樣部位分為子實體菌柄和子實體菌蓋。由表2可知，菌絲體的腦苷脂A和B質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.152%、0.066%，略低于子實體菌柄的0.266%、0.088%以及子實體菌蓋的0.251%、0.077%。

圖8 腦苷脂A和腦苷脂B標(biāo)準(zhǔn)品的二級質(zhì)譜圖Fig.8 MS2spectra of cerebroside A and B standard

表2 菌絲體、子實體的腦苷脂A和B含量Table 2 Content of cerebrosides A and B in mycelia and fruiting body

菌絲體與子實體中腦苷脂含量的差異可能與雞樅菌的生活史有關(guān)。雞樅菌的生活史主要由以下幾個階段組成：①孢子萌發(fā)形成單核菌絲；②單核菌絲融合形成次生菌絲；③由次生菌絲發(fā)育成小白球、原基、假根、子實體［17-18］。與菌絲體相比，子實體中腦苷脂的含量較高。這表明在由菌絲體向子實體發(fā)育的階段中，腦苷脂的合成仍在進(jìn)行。此外，與其他微生物一樣，雞樅菌的生長和代謝受到培養(yǎng)條件的影響［19］。通過對培養(yǎng)基中碳氮源種類和濃度、無機(jī)鹽濃度、pH、接種量、轉(zhuǎn)速、裝液量和溫度等條件的優(yōu)化，T.albuminosus JNPF-TA01胞內(nèi)皂甙的產(chǎn)量由28.4 mg/L增加到59.5 mg/L［20］。在T. clypeatus的液體培養(yǎng)基中額外添加1%的葡萄糖并培養(yǎng)6～8 d后，發(fā)酵液中纖維二糖脫氫酶的濃度明顯高于未添加葡萄糖時的濃度［21］。在T.clypeatus的液體培養(yǎng)基中添加0.1%的2-脫氧-D-葡萄糖后，發(fā)酵液的纖維二糖酶活力由1.44 U/mL提高到140.60 U/mL［22］。因此，為了提高雞樅菌菌絲體中腦苷脂的含量，腦苷脂合成途徑的解析、培養(yǎng)條件對菌絲體的生長和代謝的影響、菌絲體中腦苷脂合成的調(diào)控等將成為今后研究的主要內(nèi)容。

3 結(jié)論

采用分子生物學(xué)方法鑒定了由筆者自行分離出來的菌株CTM-1與雞樅菌的菌種同源性，測定了菌絲體的生長速率和腦苷脂含量。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，菌株 CTM -1為盾尖雞樅菌（T.clypeatus），菌株CTM-1及其出發(fā)子實體與盾尖雞樅菌的同源性為99%。在PDAY平板培養(yǎng)中，菌落直徑的增長速率在27 d內(nèi)基本穩(wěn)定在1.5 mm/d，27 d后逐漸降低。比菌落直徑增長速率在1 d時為0.21 d-1，然后逐漸下降。在DPt液體培養(yǎng)中，菌絲體生長可以分為0～2 d的延滯期、3～8 d的對數(shù)期以及9 d以后的穩(wěn)定期，穩(wěn)定期中的生物量為3.57 g/L。比菌絲體生長速率在1 d時為2.00 d-1，然后逐漸下降。菌絲體中腦苷脂A、B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.152%和0.066%。菌絲體中腦苷脂的含量有望通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化進(jìn)一步提高。

［1］陳穎，呂潔麗，段金廒，等.從生物進(jìn)化看腦苷脂類化合物的分布及其生物活性研究進(jìn)展［J］.國際藥學(xué)研究雜志，2009，36（2）：121-126.

［2］Qi J，Ojika M，Sakagami Y.Termitomycesphins A-D，novel neuritogenic cerebrosides from the edible chinese mushroom Termitomyces albuminosus［J］.Tetrahedron，2000，56（32）：5835-5841.

［3］Qi J，Ojika M，Sakagami Y.Neuritogenic cerebrosides from an edible chinese mushroom.part 2：structures of two additional termitomycesphins and activity enhancementofan inactive cerebroside by hydroxylation［J］.Bioorg Med Chem，2001，9：2171-2177.

［4］陳玲，戚建華，繆冶煉，等.腦苷類化合物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用：中國，201310272349.6［P］.2013-12-04.

［5］Chi S，Cai W，Liu P，et al.Baifuzi reduces transient ischemic brain damage through an interaction with the STREX domain of BKCa channels［J］.Cell Death and Disease，2010，1（1）：1-11.

［6］Li L，Yang R，Sun K，et al.Cerebroside-A provides potent neuroprotection after cerebral ischemia through reducing glutamate release and Ca2+influx of NMDA receptors［J］.Int J Neuropsychopharmacol，2012，15（4）：497-507.

［7］陳玲，戚智，蔡維艷，等.一種保護(hù)缺血性腦損傷的白附子脂溶性成分提取物：中國，200910024861.2［P］.2009-10-07.

［8］陳玲，戚建華，戚智，等.一種腦苷脂類化合物的應(yīng)用：中國，200910154675.0［P］.2010-05-12.

［9］陳玲，戚建華，戚智，等.一種腦苷脂B化合物的應(yīng)用：中國，201110324561.3［P］.2012-06-20.

［10］繆冶煉，花衛(wèi)俊，陳玲，等.一株高產(chǎn)腦苷脂類化合物的雞樅菌菌種及其菌絲體培養(yǎng)方法：中國，201410252645.4［P］. 2014-09-03.

［11］余仲東，張星耀，曹支敏.真菌核糖體基因間隔區(qū)研究概況［J］.西北林學(xué)院學(xué)報，2000，15（2）：107-112.

［12］劉作易.DNA指紋技術(shù)的發(fā)展及其在真菌分類上的應(yīng)用［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2000，19（5）：460-469.

［13］許學(xué)鋒，林范學(xué)，林芳燦.中國香菇自然種質(zhì)的 rDNA遺傳多樣性分析［J］.菌物學(xué)報，2005，24（1）：29-35.

［14］胡清秀.五種雞樅菌的分離培養(yǎng)試驗［J］.食用菌學(xué)報，2000，7（3）：43-47.

［15］曾先富，陳陽婷，熊維全，等.雞樅菌菌絲體培養(yǎng)試驗［J］.食用菌，2012（6）：9-11.

［16］龍正海，曾大興.雞樅菌培養(yǎng)特性的初步研究［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2007，26（3）：90-94.

［17］陳楚鋆，溫志強(qiáng).雞樅菌生活史的研究［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1991（2）：193-196.

［18］韋革宏，王衛(wèi)衛(wèi).微生物學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2008.

［19］張嗣良.發(fā)酵工程原理［M］.北京：高等教育出版社，2013.

［20］聶曉東.雞樅菌絲體及其皂甙的深層發(fā)酵條件的優(yōu)化［D］.無錫：江南大學(xué)，2009.

［21］Saha T，Ghosh D，Mukherjee S，et al.Cellobiose dehydrogenase production by the mycelial culture of the mushroom Termitomyces clypeatus［J］.Process Biochem，2008，43（6）：634-641.

［22］Suman K，Sumana M.Method for enhancing cellobiase activity of the novel strain Termitomyces clypeatus using 2-deoxy-D-glucose as glycosylation inhibitor：US，20020148009A1［P］.2002-10-10.

（責(zé)任編輯 管 珺）

Identification and growth characterization of a cerebroside producing Termitomyces clypeatus CTM-1

HUA Weijun1，MIAO Yelian1，CHEN Jieyu2，YOU Yebing1，SUN Chang1，YUAN Lihong3，XU Lin3
（1.College of Food Science and Light Industrial Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China；2.Faculty of Bioresource Science，Akita Prefectural University，Akita 010-0195，Japan；3.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China）

Cerebrosides A and B have significant effects of analgesia and brain protection.Fruiting bodies of Termitomyces contains cerebrosides A and B，but wild Termitomyces resources are scarce.In author′s previous work，a strain CTM-1 was developed by means of tissue isolation，strain purification and screening，using the fresh fruiting bodies of wild Termitomyces as raw material.In the present study，the sequence homology of CTM-1 and Termitomyces was identified with a molecular-biological method.The mycelium growth rate in plate and liquid culture，and the cerebroside content in mycelia were investigated for the strain CTM-1.It was shown that the stain CTM-1 and its parental fruiting bodies had a sequence homology up to 99%with Termitomyces clypeatus.In PDAY plate culture，the colony-diameter increasingrate was constant at 1.5 mm/d in the period between and 27 d.The specific colony-diameter increasing rate was 0.21 d-1at 1 d，and decreased gradually after then.In DPtliquid culture，the growth of mycelia entered the stable phase at 9 d，and the biomass was 3.57 g/L.The specific mycelium growth rate was 2.00 d-1at 1 d，and decreased gradually after then.The content of cerebrosides A and B in mycelia was 0.152%and 0.066%，respectively.Consequently，the large-scale culture of T.clypeatus CTM-1 can be considered as an effective way for the production of raw material containing cerebrosides A and B.

Termitomyces；mycelium；cerebroside；plate culture；liquid culture

Q939.99

A

1672-3678（2015）05-0067-07

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.013

2014-10-08

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2011CBA00807）

花衛(wèi)?。?990—），男，江蘇鹽城人，碩士研究生，研究方向：功能成分及功能食品；繆冶煉（聯(lián)系人），教授，E-mail：ylmiao@njtech. edu.cn