• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    液體培養(yǎng)真菌菌絲體及發(fā)酵液的高效分離方法

    2015-07-01 08:01:46安子旋呂曼曼朱國棟張佩佩劉志華張榮沭
    貴州農(nóng)業(yè)科學 2015年6期
    關(guān)鍵詞:過濾法離心法菌絲體

    安子旋,呂曼曼,朱國棟,張佩佩,常 媛,劉志華,張榮沭*

    (1.東北林業(yè)大學 園林學院,黑龍江 哈爾濱150040;2.東北林業(yè)大學 林學院,黑龍江 哈爾濱150040)

    在微生物試驗中,經(jīng)常需要將液體培養(yǎng)的少量真菌菌絲體與其發(fā)酵液進行分離。在分離過程中由于不同屬的真菌菌絲體的形態(tài)特征、菌絲之間糾結(jié)程度和發(fā)酵液粘稠度不同,采用不同的分離方法會導致不同的菌絲收集效果。當需要利用菌絲體提取其總RNA、DNA 和蛋白時,如果收集的菌絲體中殘留少量的發(fā)酵液,其中的小分子化合物及蛋白等物質(zhì)會干擾試驗結(jié)果;相反,當需要研究真菌發(fā)酵液的特性及成分時,如果發(fā)酵液中殘留菌絲體也會干擾試驗結(jié)果。可見,采用高效的菌絲體與發(fā)酵液分離方法非常重要,將直接影響后續(xù)試驗的進程及結(jié)果。目前,多數(shù)實驗室均采用傳統(tǒng)的高速離心法和真空抽濾法分離菌絲體和發(fā)酵液[1-5],然而,研究發(fā)現(xiàn),這2種方法均存在操作步驟多、收集速度慢、耗電、成本高、對某些液體培養(yǎng)菌絲體收集效果差的缺點。為此,本研究建立一種快速節(jié)能的菌絲體與發(fā)酵液分離方法—多層紗布過濾法。為闡明多層紗布過濾法的優(yōu)點和實用性,本研究選取不同種屬具有代表性的6種真菌菌株,包括木霉屬的棘孢木霉、毛殼屬的球毛殼菌、核盤菌屬的核盤菌、鐮刀菌屬的尖孢鐮刀菌、鏈格孢屬的鏈格孢菌和絲核菌屬的立枯絲核菌的菌株[6],分別利用高速離心法、真空抽濾法及紗布過濾法從發(fā)酵液中收集菌絲體,通過比較其分離效果及試驗成本,闡明紗布過濾法的多種優(yōu)點,為同行提供一種快速節(jié)能、低成本的高效分離真菌菌絲體及發(fā)酵液的優(yōu)良方法。

    1 材料與方法

    1.1 菌種來源及菌絲體獲得

    木霉屬的棘孢木霉(Trichodermaasperellum)、毛殼屬的球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)、鏈格孢屬的鏈格孢菌(Alternaliaalternate)、鐮刀菌屬的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、核盤菌屬的核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)和絲核菌屬的立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)共6 種真菌菌種,均由東北林業(yè)大學森保學科提供(表1)。由于供試的6種真菌在液體PD 培養(yǎng)基中菌絲的繁殖速度不同,為了在同一時間能收集到適量菌絲體,采用不同的接菌量。其中,T.asperellum、A.alternate、F.oxysporum和C.globosum培養(yǎng)48h可獲得適量菌絲體,S.sclerotiorum和R.solani菌絲的繁殖速度相對較慢,培養(yǎng)120h后可收獲適量菌絲體。

    表1 供試真菌種類及其培養(yǎng)菌絲體的接菌量和培養(yǎng)時間Table 1 Different species of fungi and inoculums of the cultured mycelium

    1.2 主要儀器與培養(yǎng)基

    超凈工作臺,恒溫振蕩培養(yǎng)箱,減壓抽濾裝置,高壓蒸汽滅菌鍋,恒溫水浴鍋,超低溫冰箱,臺式冷凍離心機,凝膠成像系統(tǒng),核酸鑒定儀。

    馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基,馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂粉18g,H2O 1 000mL,pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基為不加瓊脂粉的PD 液體培養(yǎng)基。

    1.3 試驗設計與培養(yǎng)方法

    采用高速離心法、真空抽濾法及紗布過濾法從發(fā)酵液中收集菌絲體,比較3種方法的收集效果及試驗成本。

    菌種活化。4℃保存的菌種轉(zhuǎn)接到新配制的PDA 斜面上,26℃培養(yǎng)5d,獲得分生孢子。

    菌絲體培養(yǎng)。將PDA 斜面上生長好的分生孢子用一定體積的無菌水稀釋,測定孢子含量,將一定量的孢子懸液(表1)接入裝有100mL 的PD 培養(yǎng)液的三角瓶中,26℃200r/min振蕩培養(yǎng)。每種真菌均培養(yǎng)9瓶,分別用于高速離心法、真空抽濾法及紗布過濾法3種分離方法,每種分離方法設3次重復。

    1.4 分離真菌菌絲體的方法

    1.4.1 高速離心法 將6種真菌的發(fā)酵產(chǎn)物分別置于50mL離心管中,在20℃8 000r/min條件下離心10min,分離上清液,收集的菌絲體置于培養(yǎng)皿中。

    1.4.2 減壓抽濾法 6種真菌的發(fā)酵產(chǎn)物分別用抽濾裝置進行常溫減壓抽濾,將菌絲體與發(fā)酵液分開。菌絲體保留在濾紙上,發(fā)酵液流入收集瓶中。

    1.4.3 多層紗布過濾法 將折疊8層后的紗布放在培養(yǎng)皿中,分別將6種真菌的發(fā)酵產(chǎn)物平攤于紗布,操作者戴無菌乳膠手套,將紗布細心卷起,雙手反向擰緊紗布,使發(fā)酵液與菌絲體分離,待無液體流下時,輕輕展開紗布,收集菌絲體。

    1.5 測定方法

    1.5.1 分生孢子計數(shù) 用血球計數(shù)器將真菌的孢子懸浮液在顯微鏡下計數(shù)。

    1.5.2 菌絲體含水率 菌株培養(yǎng)一定時間后(表1),分別取不同菌種的發(fā)酵產(chǎn)物100 mL,采用高速離心、真空抽濾和紗布過濾3種方法收集菌絲體,精確稱量菌體濕重(g),然后將菌體在105℃下烘干至恒重,精確稱量干重。菌絲體含水率計算公式為:

    菌絲體含水率=(菌絲體鮮重-菌絲體干重)/菌絲體鮮重×100%。

    1.6 提取真菌菌絲體的總RNA

    將采用不同方法收集的6種真菌菌絲體分別稱取等重,液氮研磨。采用CTAB 方法[7]提取不同菌種、不同方法收集的菌絲體的總RNA。

    1.7 數(shù)據(jù)處理

    所有數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件處理,結(jié)果以平均值±SD表示。采用Minitab 16統(tǒng)計軟件(Minitab,Version 16)進行ANOVA 分析,比較各方法之間的差異性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌絲體

    6種真菌發(fā)酵一定時間后,其菌絲體大量生長。這6個菌種的發(fā)酵產(chǎn)物在菌絲的形態(tài)、發(fā)酵產(chǎn)物顏色和粘稠度等方面差異很大(圖1)。說明,研究選取的6種真菌各具代表性,且菌絲產(chǎn)量差異不大。

    2.2 高速離心法分離的菌絲體與發(fā)酵液

    采用高速離心法將真菌的發(fā)酵產(chǎn)物離心后,6種真菌均表現(xiàn)為菌絲體與發(fā)酵液分離,形成絮狀或松散沉淀(圖2-1)。用移液器將上清液分離后,將菌絲體置于培養(yǎng)皿中發(fā)現(xiàn),由于菌絲體很輕(只有球毛殼菌的菌絲球堅硬),并且發(fā)酵液粘稠,導致離心后收集的菌絲體中仍含有少量發(fā)酵液(圖2-2),說明,采用高速離心法很難將菌絲體與發(fā)酵液徹底分離。

    圖1 振蕩培養(yǎng)一定時間后6種真菌的菌絲體Fig.1 State of the six fungal mycelium after shaking culture some time.

    圖2 高速離心法收集的菌絲體Fig.2 The mycelia collected by high speed centrifuging method

    2.3 減壓抽濾法分離的菌絲體與發(fā)酵液

    采用減壓抽濾法將真菌的發(fā)酵產(chǎn)物進行常溫減壓抽濾發(fā)現(xiàn),6種真菌均表現(xiàn)為菌絲體與發(fā)酵液的分離速度差異極大(表2)。木霉菌的菌絲體與其發(fā)酵液很易分離,壓力減為0.02kpa時,只用1min,發(fā)酵液快速被抽濾到收集瓶中。球毛殼菌、鏈格孢菌、尖孢鐮刀菌的菌絲體則較難與其發(fā)酵液分離,在壓力減至0.08kpa時,達到圖3所示的分離效果,所需的抽濾時間分別為20 min、30 min和60min,而核盤菌和立枯絲核菌即使在壓力減至0.08kpa條件下,抽濾時間達60 min,收集到的菌絲體中還能見到有發(fā)酵液存在(表2;圖3-1中e和f),說明此方法用于收集不同菌種的菌絲體,其效果和用電成本存在很大差異。另外,收集的菌絲體與濾紙接合的緊密程度不同,如木霉、鏈格孢菌、尖孢鐮刀菌的菌絲體與濾紙接合緊密,需要小心細致才能將其從濾紙上剝離。而球毛殼菌的菌絲球堅硬,與濾紙接合松散,較易剝離,但菌球并沒有完全被抽癟,仍含有一定水分。雖然試驗中多數(shù)菌種的菌絲體與發(fā)酵液能很好地被分離,但這些菌絲體緊密附著于濾紙上,收集時間長,說明此方法用于不同菌種的分離,其分離效果、所用時間及成本均存在差異。

    表2 6種菌絲體的抽濾時間和減壓壓力Table 2 Suction filtration time and decompression pressure

    圖3 減壓抽濾法分離獲得的菌絲體Fig.3 Mycelium was separated by the vacuum filtration method

    圖4 多層紗布過濾法分離的菌絲體Fig.4 The mycelium of six fungi was separately left on the dry gauze

    2.4 多層紗布過濾法分離的菌絲體與發(fā)酵液

    從圖4可見,采用多層紗布過濾法(將真菌的發(fā)酵產(chǎn)物用擰壓的力量)將菌絲體與發(fā)酵液分離,干燥菌絲體團塊的邊緣卷起,與紗布分離,易于剝離菌絲體。球毛殼菌堅硬的菌絲球也可以被壓擠成片,脫水效果優(yōu)于高速離心和減壓抽濾法。說明,多層紗布過濾方法操作簡單,成本低,無需使用電力設備,分離速度快,效果好。

    2.5 不同分離法收集菌絲體的含水量

    從表3看出,采用紗布過濾法收集的菌絲體的含水量均極顯著低于高速離心法(P<0.01)。說明,紗布過濾法與高速離心法相比分離效果極好。另外,只有真菌S.sclerotiorum和R.solani采用紗布過濾法得到的菌絲體的含水量極顯著低于減壓過濾法(P<0.01),其他4種真菌(T.asperellum、C.globosum、A.alternate和F.oxysporum)分離獲得的菌絲體的含水量與減壓過濾法相比雖然略低,但未達極顯著差異。說明,采用減壓過濾法分離菌絲體并不適合對S.sclerotiorum和R.solani的分離,分離后菌絲中的含水量較高。因此,采用紗布過濾法將真菌菌絲體與其發(fā)酵液分離的效果也優(yōu)于減壓過濾法。

    表3 不同分離方法獲得的菌絲體的含水量Table 3 Moisture content of separating the mycelium by different methods %

    表4 不同方法分離的菌絲體提取RNA的產(chǎn)量Table 4 The RNA yield of separating the mycelium in different methods

    2.6 不同分離法收集菌絲體中提取的核酸質(zhì)量和產(chǎn)量

    采用CTAB方法提取不同菌種、不同方法收集的菌絲體的總RNA 結(jié)果(表4)表明,6種真菌分別采用3種分離方法收集的菌絲體中均能提取出總RNA,并且RNA 的OD 值均在1.9~2.1。說明,采用這3種分離方法獲得的菌絲體中的RNA 均能滿足后續(xù)試驗的質(zhì)量要求。但對于同一菌種,3 種分離方法收集的等量菌絲體中提取的總RNA 的產(chǎn)量差異較大,其中,以采用紗布過濾法收集的菌絲體,其提取的總RNA 產(chǎn)量最高。說明,采用紗布過濾法分離菌絲體,比高速離心和減壓過濾法能獲得更高的核酸產(chǎn)量。

    3 結(jié)論與討論

    研究建立了一種快速節(jié)能的菌絲體與發(fā)酵液分離方法——多層紗布過濾法。該方法具有操作簡單、分離速度快,節(jié)能,成本低,收集的菌絲體含水量低,以及不影響菌絲體中提取的核酸質(zhì)量等許多優(yōu)點,非常實用,值得推廣。

    目前,實驗室中多采用傳統(tǒng)的高速離心法和減壓抽濾法將菌絲體與發(fā)酵液分離。本研究選取6個不同種屬具有代表性的生長性狀差異極大的真菌菌株,分別采用高速離心、減壓抽濾和紗布過濾3種不同的分離方法收集菌絲體的效果表明,高速離心法即使離心速度很高也很難將真菌發(fā)酵產(chǎn)物中的菌絲體完全密實地沉降到試管底部,導致分離上清液后收集到的菌絲體仍含有較多的水分,分離效果不好。而減壓抽濾法對這6種真菌的菌絲體進行分離時,對有些菌種的菌絲體收集效果好,對有些菌絲體的收集效果差,如收集的真菌S.sclerotiorum和R.solani的菌絲體的含水量仍然較高。并且,高速離心法和減壓抽濾法均須采用電動儀器設備(如高速離心機、真空抽濾泵等),存在操作步驟多、收集速度慢、耗電、成本高等問題。而本研究建立的紗布過濾法,操作簡單、成本低廉,只需要折疊8層、折疊后大小近似為30cm×12cm 的紗布、1副乳膠手套和1個15cm 直徑的培養(yǎng)皿即可。該方法廣泛適用于分離各種真菌的菌絲體及發(fā)酵液,與同行采用的傳統(tǒng)的高速離心法和減壓抽濾法相比,具有許多優(yōu)點。由此可見,多層紗布過濾收集菌絲體的方法非常實用,具有極大的推廣價值。

    [1]陳建愛,杜方嶺.黃綠木霉T1010對櫻桃番茄橫向土壤環(huán)境性狀改良效果研究[J].農(nóng)學學報,2011(8):36-41.

    [2]Aggarwal R,Sharma V,Kharbikar L L,et al.Molecular characterization ofChaetomiumspecies using URP-PCR[J].Genetics Molecular Biology,2008,31(4):943-946.

    [3]Fernando W G D,Nakkeeran S,Zhang Y,et al.Biological control ofSclerotiniasclerotiorum(Lib.)de Bary byPseudomonasandBacillusspecies on canola petals[J].Crop Protection,2007,26:100-107.

    [4]蘇惠春,程 波,傅冷西,等.3 種破壁方法提取念珠菌總RNA 效果的比較[J].中國真菌學雜志,2007,2(5):286-288.

    [5]徐 健,陶洪文,陳 蔭,等.厚藤共生真菌(Fusarium oxysporumY24-2)胞外多糖的化學組成和結(jié)構(gòu)研究[J].中國海洋大學學報,2011,41(10):87-92

    [6]劉志恒.現(xiàn)代微生物學[M].第2版.北京:科學出版社,2008.

    [7]左瑞娟,周雨泫,李麗娟,等.CTAB 法用于染病煙草植株中煙草叢頂病毒RNA 的提取[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報,2011,26(1):26-29.

    猜你喜歡
    過濾法離心法菌絲體
    基于深度強化學習的直流配電線路短路故障測距方法
    自然沉淀法與離心法在自體脂肪移植隆乳術(shù)中的應用效果對比研究
    一種改進的超聲提取氣相色譜法測定土壤中15種硝基苯類化合物
    中國測試(2018年4期)2018-05-14 15:33:30
    離心法和蒸餾法原油化驗研究
    影響原油含水化驗準確性的因素分析與改進措施
    葡萄糖酸鈉發(fā)酵廢棄菌絲體提取殼聚糖的研究
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:25
    新型環(huán)保吸聲材料——菌絲體膠合秸稈
    安全(2015年7期)2016-01-19 06:19:39
    冬蟲夏草發(fā)酵液和菌絲體中主要核苷類成分分析
    藥品檢驗中薄膜過濾法的應用價值
    擬黃薄孔菌菌絲體的固體培養(yǎng)條件及CAT和SOD活力動態(tài)研究
    人体艺术视频欧美日本| 久久久久九九精品影院| 少妇熟女欧美另类| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久精品人妻少妇| 麻豆国产97在线/欧美| 插阴视频在线观看视频| 国产综合懂色| 国产熟女欧美一区二区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国精品久久久久久国模美| 少妇熟女欧美另类| 高清视频免费观看一区二区 | 色视频www国产| 一级毛片aaaaaa免费看小| 九九在线视频观看精品| 日韩欧美三级三区| 亚洲四区av| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 成人亚洲精品一区在线观看 | 天天一区二区日本电影三级| 欧美日韩精品成人综合77777| 欧美性感艳星| 亚洲精品第二区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 高清午夜精品一区二区三区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 精品久久久久久久末码| 老女人水多毛片| h日本视频在线播放| 又大又黄又爽视频免费| 一区二区三区四区激情视频| 91精品国产九色| 中文资源天堂在线| 国产黄色免费在线视频| 搡老乐熟女国产| 乱系列少妇在线播放| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产老妇女一区| 草草在线视频免费看| 久久精品久久精品一区二区三区| 中文字幕免费在线视频6| 内射极品少妇av片p| 日日啪夜夜撸| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 亚洲av福利一区| 美女内射精品一级片tv| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲国产精品sss在线观看| 超碰av人人做人人爽久久| a级毛色黄片| kizo精华| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲高清免费不卡视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国产有黄有色有爽视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 五月天丁香电影| 夜夜爽夜夜爽视频| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲av免费在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 高清在线视频一区二区三区| 精品国产露脸久久av麻豆 | 亚洲av电影不卡..在线观看| h日本视频在线播放| 亚洲怡红院男人天堂| 午夜福利在线观看吧| 久久精品国产亚洲av天美| 看十八女毛片水多多多| 97超视频在线观看视频| 国产成人aa在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| av在线蜜桃| 国产成人精品婷婷| 男人和女人高潮做爰伦理| 日韩视频在线欧美| 男女啪啪激烈高潮av片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 免费看av在线观看网站| 亚洲av二区三区四区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 欧美激情在线99| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲色图av天堂| 热99在线观看视频| 毛片一级片免费看久久久久| 日韩视频在线欧美| freevideosex欧美| 搡老妇女老女人老熟妇| 又爽又黄a免费视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 婷婷六月久久综合丁香| 水蜜桃什么品种好| 日韩在线高清观看一区二区三区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 中国国产av一级| 韩国高清视频一区二区三区| 大香蕉久久网| 久久久久久伊人网av| 欧美成人一区二区免费高清观看| 天堂网av新在线| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产黄片视频在线免费观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 大陆偷拍与自拍| 国产 亚洲一区二区三区 | 成人无遮挡网站| 午夜久久久久精精品| av.在线天堂| 国产黄a三级三级三级人| 久99久视频精品免费| 久久久久久久久中文| 亚洲欧美精品专区久久| 在线观看免费高清a一片| 直男gayav资源| 欧美xxⅹ黑人| 成人特级av手机在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 麻豆成人av视频| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲精品国产av成人精品| 免费人成在线观看视频色| 亚洲精品,欧美精品| 天美传媒精品一区二区| 国产大屁股一区二区在线视频| 永久免费av网站大全| 丰满乱子伦码专区| 免费黄网站久久成人精品| 九九在线视频观看精品| 18禁在线播放成人免费| 亚洲久久久久久中文字幕| 九九在线视频观看精品| 精品久久国产蜜桃| 成人亚洲精品av一区二区| h日本视频在线播放| 99久久中文字幕三级久久日本| 精品欧美国产一区二区三| 18+在线观看网站| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲精品影视一区二区三区av| 男女那种视频在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 99久国产av精品国产电影| 国产色婷婷99| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 青青草视频在线视频观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 高清午夜精品一区二区三区| 久久精品综合一区二区三区| 一级av片app| av福利片在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 免费看av在线观看网站| av福利片在线观看| or卡值多少钱| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产精品1区2区在线观看.| 高清日韩中文字幕在线| 人妻系列 视频| 伦理电影大哥的女人| 国产一区亚洲一区在线观看| 三级毛片av免费| 亚洲,欧美,日韩| 午夜日本视频在线| 两个人视频免费观看高清| 国产在视频线在精品| 1000部很黄的大片| 午夜亚洲福利在线播放| 高清在线视频一区二区三区| 免费高清在线观看视频在线观看| 禁无遮挡网站| 欧美日本视频| 国产 亚洲一区二区三区 | 禁无遮挡网站| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲综合色惰| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲经典国产精华液单| 深爱激情五月婷婷| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 久久精品国产亚洲网站| 女人久久www免费人成看片| 日韩三级伦理在线观看| 人妻系列 视频| 国产高清不卡午夜福利| 夫妻午夜视频| 99热这里只有精品一区| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲国产精品成人综合色| 国产淫语在线视频| 国产成人91sexporn| 97精品久久久久久久久久精品| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 黑人高潮一二区| 韩国av在线不卡| 国产黄片美女视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲自拍偷在线| 久久久久九九精品影院| 大香蕉久久网| av一本久久久久| 亚洲精品国产av蜜桃| 两个人的视频大全免费| 亚洲国产最新在线播放| 欧美人与善性xxx| av免费在线看不卡| 久久精品久久久久久久性| 人体艺术视频欧美日本| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 免费人成在线观看视频色| 日本色播在线视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品久久久久久久久久久久久| 久久精品人妻少妇| 在现免费观看毛片| 国产老妇女一区| 深爱激情五月婷婷| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲国产av新网站| 欧美丝袜亚洲另类| 国产精品一区二区性色av| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 精品一区二区免费观看| 极品教师在线视频| 欧美精品一区二区大全| 最后的刺客免费高清国语| kizo精华| 亚洲欧洲日产国产| 国产成人精品一,二区| 午夜日本视频在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 七月丁香在线播放| 丝瓜视频免费看黄片| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 插阴视频在线观看视频| 亚洲成色77777| or卡值多少钱| 一级爰片在线观看| 国产精品一及| 中文字幕免费在线视频6| 午夜日本视频在线| 乱系列少妇在线播放| 大陆偷拍与自拍| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产v大片淫在线免费观看| 22中文网久久字幕| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品三级大全| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 51国产日韩欧美| 夫妻性生交免费视频一级片| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 有码 亚洲区| videos熟女内射| 亚洲成人精品中文字幕电影| 五月天丁香电影| 波野结衣二区三区在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 18+在线观看网站| 亚洲av福利一区| 亚洲图色成人| 久久精品国产自在天天线| 免费在线观看成人毛片| 久久久久久九九精品二区国产| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久久久久久久久成人| 亚洲最大成人av| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久这里只有精品中国| 久久精品久久久久久久性| 国产精品综合久久久久久久免费| 精品欧美国产一区二区三| 波野结衣二区三区在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| a级一级毛片免费在线观看| 久久久久久久久久黄片| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲精品成人久久久久久| 麻豆乱淫一区二区| 2022亚洲国产成人精品| 国产黄色视频一区二区在线观看| ponron亚洲| 精品久久久精品久久久| 大陆偷拍与自拍| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产伦一二天堂av在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日韩一区二区视频免费看| 高清日韩中文字幕在线| 午夜久久久久精精品| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美3d第一页| 国产永久视频网站| 国产人妻一区二区三区在| 99视频精品全部免费 在线| 一二三四中文在线观看免费高清| 不卡视频在线观看欧美| 午夜亚洲福利在线播放| 十八禁网站网址无遮挡 | 伦理电影大哥的女人| 综合色丁香网| 亚洲无线观看免费| 久久综合国产亚洲精品| 国产伦一二天堂av在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲av福利一区| 观看免费一级毛片| 七月丁香在线播放| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲怡红院男人天堂| 成人亚洲精品av一区二区| 日韩欧美精品v在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久久色成人| 1000部很黄的大片| 久99久视频精品免费| 我的老师免费观看完整版| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲经典国产精华液单| 成人无遮挡网站| 亚洲成色77777| 91久久精品国产一区二区成人| 在线播放无遮挡| 丰满乱子伦码专区| 欧美日本视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲在久久综合| 舔av片在线| 18+在线观看网站| av一本久久久久| 久久久精品免费免费高清| 亚洲国产欧美在线一区| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美bdsm另类| 国产在线一区二区三区精| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 18禁动态无遮挡网站| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲精品第二区| 亚洲av中文av极速乱| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久人人爽人人片av| 国产乱人视频| 久久99热6这里只有精品| 免费看a级黄色片| 成年免费大片在线观看| 只有这里有精品99| 99久国产av精品| 日韩中字成人| 亚洲国产精品国产精品| 精品国产三级普通话版| 午夜久久久久精精品| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久久久久久久久久丰满| 久久99热这里只有精品18| 内地一区二区视频在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久久久久伊人网av| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 91狼人影院| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲经典国产精华液单| 99久久精品国产国产毛片| 国内精品美女久久久久久| 国内精品宾馆在线| 日韩av不卡免费在线播放| 免费黄色在线免费观看| 国产三级在线视频| 久热久热在线精品观看| 日韩制服骚丝袜av| 免费黄频网站在线观看国产| 日韩av免费高清视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美一区二区亚洲| 国产精品.久久久| 一个人观看的视频www高清免费观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 黄色配什么色好看| 一区二区三区免费毛片| 大话2 男鬼变身卡| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 99久久精品热视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美精品国产亚洲| 免费av观看视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久亚洲国产成人精品v| 搡老妇女老女人老熟妇| 在线a可以看的网站| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲精品aⅴ在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产单亲对白刺激| 亚洲国产av新网站| 亚洲三级黄色毛片| 少妇的逼好多水| 免费av观看视频| 日本av手机在线免费观看| 白带黄色成豆腐渣| 午夜免费激情av| 欧美精品一区二区大全| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲美女视频黄频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产黄a三级三级三级人| 欧美高清成人免费视频www| 欧美性感艳星| 看十八女毛片水多多多| 男人和女人高潮做爰伦理| 日韩av在线免费看完整版不卡| 欧美3d第一页| www.色视频.com| 国产日韩欧美在线精品| 丰满乱子伦码专区| 九草在线视频观看| 国产亚洲精品久久久com| 日韩人妻高清精品专区| 免费看日本二区| 久久久成人免费电影| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲成色77777| 男人和女人高潮做爰伦理| 男人舔奶头视频| 超碰97精品在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 国产成人a区在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲无线观看免费| 好男人视频免费观看在线| 国产精品一区二区性色av| 麻豆乱淫一区二区| 草草在线视频免费看| 日本wwww免费看| 免费在线观看成人毛片| freevideosex欧美| 亚洲精品国产av蜜桃| 日日撸夜夜添| 国产 一区 欧美 日韩| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日韩欧美国产在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产精品熟女久久久久浪| 边亲边吃奶的免费视频| 免费看日本二区| 一级毛片 在线播放| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 一二三四中文在线观看免费高清| 大话2 男鬼变身卡| 免费看av在线观看网站| 免费电影在线观看免费观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 免费观看性生交大片5| 在线天堂最新版资源| 日韩 亚洲 欧美在线| 精华霜和精华液先用哪个| 观看免费一级毛片| 一级二级三级毛片免费看| 黄色日韩在线| 在线免费十八禁| 街头女战士在线观看网站| 欧美成人午夜免费资源| 色哟哟·www| 99re6热这里在线精品视频| 日韩欧美精品免费久久| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产亚洲91精品色在线| 国产一区二区三区综合在线观看 | 久久97久久精品| 国产午夜福利久久久久久| 秋霞在线观看毛片| 亚洲伊人久久精品综合| 国产又色又爽无遮挡免| av卡一久久| 在线观看av片永久免费下载| 精品久久久久久成人av| 麻豆国产97在线/欧美| 黄色配什么色好看| 久久久久精品性色| 久久精品国产自在天天线| 精品久久久噜噜| 午夜亚洲福利在线播放| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美3d第一页| 亚洲精品色激情综合| 国产精品人妻久久久久久| 色播亚洲综合网| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲内射少妇av| 久久鲁丝午夜福利片| 日本欧美国产在线视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| or卡值多少钱| 国产老妇女一区| 人妻系列 视频| 亚洲av.av天堂| 久久亚洲国产成人精品v| 最后的刺客免费高清国语| 国产精品国产三级专区第一集| 高清在线视频一区二区三区| 青春草亚洲视频在线观看| av福利片在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 我的女老师完整版在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 一区二区三区四区激情视频| 男的添女的下面高潮视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 一级a做视频免费观看| 岛国毛片在线播放| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲怡红院男人天堂| 国产精品人妻久久久久久| 日韩欧美精品免费久久| 中文欧美无线码| 免费少妇av软件| 日韩成人av中文字幕在线观看| 免费黄色在线免费观看| 七月丁香在线播放| 亚洲,欧美,日韩| 老司机影院成人| 3wmmmm亚洲av在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 日韩欧美国产在线观看| 观看美女的网站| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产大屁股一区二区在线视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| av.在线天堂| 亚洲成人一二三区av| 久久久国产一区二区| h日本视频在线播放| 久久精品国产亚洲网站| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 麻豆成人午夜福利视频| 99久久精品热视频| 高清视频免费观看一区二区 | 美女大奶头视频| 国产探花在线观看一区二区| 69av精品久久久久久| 精品人妻偷拍中文字幕| 午夜久久久久精精品| 国产黄色小视频在线观看| 午夜福利高清视频| 国产乱人偷精品视频| 国产综合精华液| 欧美精品一区二区大全| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产综合精华液| 中文天堂在线官网| 日韩欧美国产在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| ponron亚洲| 乱码一卡2卡4卡精品| 色综合站精品国产| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲av不卡在线观看| 97在线视频观看| av.在线天堂| 亚洲久久久久久中文字幕| 青春草亚洲视频在线观看| 身体一侧抽搐| 色尼玛亚洲综合影院| 日本免费a在线| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产一区有黄有色的免费视频 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 99热6这里只有精品| 国产精品人妻久久久影院|