• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    液體培養(yǎng)真菌菌絲體及發(fā)酵液的高效分離方法

    2015-07-01 08:01:46安子旋呂曼曼朱國棟張佩佩劉志華張榮沭
    貴州農(nóng)業(yè)科學 2015年6期
    關(guān)鍵詞:過濾法離心法菌絲體

    安子旋,呂曼曼,朱國棟,張佩佩,常 媛,劉志華,張榮沭*

    (1.東北林業(yè)大學 園林學院,黑龍江 哈爾濱150040;2.東北林業(yè)大學 林學院,黑龍江 哈爾濱150040)

    在微生物試驗中,經(jīng)常需要將液體培養(yǎng)的少量真菌菌絲體與其發(fā)酵液進行分離。在分離過程中由于不同屬的真菌菌絲體的形態(tài)特征、菌絲之間糾結(jié)程度和發(fā)酵液粘稠度不同,采用不同的分離方法會導致不同的菌絲收集效果。當需要利用菌絲體提取其總RNA、DNA 和蛋白時,如果收集的菌絲體中殘留少量的發(fā)酵液,其中的小分子化合物及蛋白等物質(zhì)會干擾試驗結(jié)果;相反,當需要研究真菌發(fā)酵液的特性及成分時,如果發(fā)酵液中殘留菌絲體也會干擾試驗結(jié)果。可見,采用高效的菌絲體與發(fā)酵液分離方法非常重要,將直接影響后續(xù)試驗的進程及結(jié)果。目前,多數(shù)實驗室均采用傳統(tǒng)的高速離心法和真空抽濾法分離菌絲體和發(fā)酵液[1-5],然而,研究發(fā)現(xiàn),這2種方法均存在操作步驟多、收集速度慢、耗電、成本高、對某些液體培養(yǎng)菌絲體收集效果差的缺點。為此,本研究建立一種快速節(jié)能的菌絲體與發(fā)酵液分離方法—多層紗布過濾法。為闡明多層紗布過濾法的優(yōu)點和實用性,本研究選取不同種屬具有代表性的6種真菌菌株,包括木霉屬的棘孢木霉、毛殼屬的球毛殼菌、核盤菌屬的核盤菌、鐮刀菌屬的尖孢鐮刀菌、鏈格孢屬的鏈格孢菌和絲核菌屬的立枯絲核菌的菌株[6],分別利用高速離心法、真空抽濾法及紗布過濾法從發(fā)酵液中收集菌絲體,通過比較其分離效果及試驗成本,闡明紗布過濾法的多種優(yōu)點,為同行提供一種快速節(jié)能、低成本的高效分離真菌菌絲體及發(fā)酵液的優(yōu)良方法。

    1 材料與方法

    1.1 菌種來源及菌絲體獲得

    木霉屬的棘孢木霉(Trichodermaasperellum)、毛殼屬的球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)、鏈格孢屬的鏈格孢菌(Alternaliaalternate)、鐮刀菌屬的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、核盤菌屬的核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)和絲核菌屬的立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)共6 種真菌菌種,均由東北林業(yè)大學森保學科提供(表1)。由于供試的6種真菌在液體PD 培養(yǎng)基中菌絲的繁殖速度不同,為了在同一時間能收集到適量菌絲體,采用不同的接菌量。其中,T.asperellum、A.alternate、F.oxysporum和C.globosum培養(yǎng)48h可獲得適量菌絲體,S.sclerotiorum和R.solani菌絲的繁殖速度相對較慢,培養(yǎng)120h后可收獲適量菌絲體。

    表1 供試真菌種類及其培養(yǎng)菌絲體的接菌量和培養(yǎng)時間Table 1 Different species of fungi and inoculums of the cultured mycelium

    1.2 主要儀器與培養(yǎng)基

    超凈工作臺,恒溫振蕩培養(yǎng)箱,減壓抽濾裝置,高壓蒸汽滅菌鍋,恒溫水浴鍋,超低溫冰箱,臺式冷凍離心機,凝膠成像系統(tǒng),核酸鑒定儀。

    馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基,馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂粉18g,H2O 1 000mL,pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基為不加瓊脂粉的PD 液體培養(yǎng)基。

    1.3 試驗設計與培養(yǎng)方法

    采用高速離心法、真空抽濾法及紗布過濾法從發(fā)酵液中收集菌絲體,比較3種方法的收集效果及試驗成本。

    菌種活化。4℃保存的菌種轉(zhuǎn)接到新配制的PDA 斜面上,26℃培養(yǎng)5d,獲得分生孢子。

    菌絲體培養(yǎng)。將PDA 斜面上生長好的分生孢子用一定體積的無菌水稀釋,測定孢子含量,將一定量的孢子懸液(表1)接入裝有100mL 的PD 培養(yǎng)液的三角瓶中,26℃200r/min振蕩培養(yǎng)。每種真菌均培養(yǎng)9瓶,分別用于高速離心法、真空抽濾法及紗布過濾法3種分離方法,每種分離方法設3次重復。

    1.4 分離真菌菌絲體的方法

    1.4.1 高速離心法 將6種真菌的發(fā)酵產(chǎn)物分別置于50mL離心管中,在20℃8 000r/min條件下離心10min,分離上清液,收集的菌絲體置于培養(yǎng)皿中。

    1.4.2 減壓抽濾法 6種真菌的發(fā)酵產(chǎn)物分別用抽濾裝置進行常溫減壓抽濾,將菌絲體與發(fā)酵液分開。菌絲體保留在濾紙上,發(fā)酵液流入收集瓶中。

    1.4.3 多層紗布過濾法 將折疊8層后的紗布放在培養(yǎng)皿中,分別將6種真菌的發(fā)酵產(chǎn)物平攤于紗布,操作者戴無菌乳膠手套,將紗布細心卷起,雙手反向擰緊紗布,使發(fā)酵液與菌絲體分離,待無液體流下時,輕輕展開紗布,收集菌絲體。

    1.5 測定方法

    1.5.1 分生孢子計數(shù) 用血球計數(shù)器將真菌的孢子懸浮液在顯微鏡下計數(shù)。

    1.5.2 菌絲體含水率 菌株培養(yǎng)一定時間后(表1),分別取不同菌種的發(fā)酵產(chǎn)物100 mL,采用高速離心、真空抽濾和紗布過濾3種方法收集菌絲體,精確稱量菌體濕重(g),然后將菌體在105℃下烘干至恒重,精確稱量干重。菌絲體含水率計算公式為:

    菌絲體含水率=(菌絲體鮮重-菌絲體干重)/菌絲體鮮重×100%。

    1.6 提取真菌菌絲體的總RNA

    將采用不同方法收集的6種真菌菌絲體分別稱取等重,液氮研磨。采用CTAB 方法[7]提取不同菌種、不同方法收集的菌絲體的總RNA。

    1.7 數(shù)據(jù)處理

    所有數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件處理,結(jié)果以平均值±SD表示。采用Minitab 16統(tǒng)計軟件(Minitab,Version 16)進行ANOVA 分析,比較各方法之間的差異性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌絲體

    6種真菌發(fā)酵一定時間后,其菌絲體大量生長。這6個菌種的發(fā)酵產(chǎn)物在菌絲的形態(tài)、發(fā)酵產(chǎn)物顏色和粘稠度等方面差異很大(圖1)。說明,研究選取的6種真菌各具代表性,且菌絲產(chǎn)量差異不大。

    2.2 高速離心法分離的菌絲體與發(fā)酵液

    采用高速離心法將真菌的發(fā)酵產(chǎn)物離心后,6種真菌均表現(xiàn)為菌絲體與發(fā)酵液分離,形成絮狀或松散沉淀(圖2-1)。用移液器將上清液分離后,將菌絲體置于培養(yǎng)皿中發(fā)現(xiàn),由于菌絲體很輕(只有球毛殼菌的菌絲球堅硬),并且發(fā)酵液粘稠,導致離心后收集的菌絲體中仍含有少量發(fā)酵液(圖2-2),說明,采用高速離心法很難將菌絲體與發(fā)酵液徹底分離。

    圖1 振蕩培養(yǎng)一定時間后6種真菌的菌絲體Fig.1 State of the six fungal mycelium after shaking culture some time.

    圖2 高速離心法收集的菌絲體Fig.2 The mycelia collected by high speed centrifuging method

    2.3 減壓抽濾法分離的菌絲體與發(fā)酵液

    采用減壓抽濾法將真菌的發(fā)酵產(chǎn)物進行常溫減壓抽濾發(fā)現(xiàn),6種真菌均表現(xiàn)為菌絲體與發(fā)酵液的分離速度差異極大(表2)。木霉菌的菌絲體與其發(fā)酵液很易分離,壓力減為0.02kpa時,只用1min,發(fā)酵液快速被抽濾到收集瓶中。球毛殼菌、鏈格孢菌、尖孢鐮刀菌的菌絲體則較難與其發(fā)酵液分離,在壓力減至0.08kpa時,達到圖3所示的分離效果,所需的抽濾時間分別為20 min、30 min和60min,而核盤菌和立枯絲核菌即使在壓力減至0.08kpa條件下,抽濾時間達60 min,收集到的菌絲體中還能見到有發(fā)酵液存在(表2;圖3-1中e和f),說明此方法用于收集不同菌種的菌絲體,其效果和用電成本存在很大差異。另外,收集的菌絲體與濾紙接合的緊密程度不同,如木霉、鏈格孢菌、尖孢鐮刀菌的菌絲體與濾紙接合緊密,需要小心細致才能將其從濾紙上剝離。而球毛殼菌的菌絲球堅硬,與濾紙接合松散,較易剝離,但菌球并沒有完全被抽癟,仍含有一定水分。雖然試驗中多數(shù)菌種的菌絲體與發(fā)酵液能很好地被分離,但這些菌絲體緊密附著于濾紙上,收集時間長,說明此方法用于不同菌種的分離,其分離效果、所用時間及成本均存在差異。

    表2 6種菌絲體的抽濾時間和減壓壓力Table 2 Suction filtration time and decompression pressure

    圖3 減壓抽濾法分離獲得的菌絲體Fig.3 Mycelium was separated by the vacuum filtration method

    圖4 多層紗布過濾法分離的菌絲體Fig.4 The mycelium of six fungi was separately left on the dry gauze

    2.4 多層紗布過濾法分離的菌絲體與發(fā)酵液

    從圖4可見,采用多層紗布過濾法(將真菌的發(fā)酵產(chǎn)物用擰壓的力量)將菌絲體與發(fā)酵液分離,干燥菌絲體團塊的邊緣卷起,與紗布分離,易于剝離菌絲體。球毛殼菌堅硬的菌絲球也可以被壓擠成片,脫水效果優(yōu)于高速離心和減壓抽濾法。說明,多層紗布過濾方法操作簡單,成本低,無需使用電力設備,分離速度快,效果好。

    2.5 不同分離法收集菌絲體的含水量

    從表3看出,采用紗布過濾法收集的菌絲體的含水量均極顯著低于高速離心法(P<0.01)。說明,紗布過濾法與高速離心法相比分離效果極好。另外,只有真菌S.sclerotiorum和R.solani采用紗布過濾法得到的菌絲體的含水量極顯著低于減壓過濾法(P<0.01),其他4種真菌(T.asperellum、C.globosum、A.alternate和F.oxysporum)分離獲得的菌絲體的含水量與減壓過濾法相比雖然略低,但未達極顯著差異。說明,采用減壓過濾法分離菌絲體并不適合對S.sclerotiorum和R.solani的分離,分離后菌絲中的含水量較高。因此,采用紗布過濾法將真菌菌絲體與其發(fā)酵液分離的效果也優(yōu)于減壓過濾法。

    表3 不同分離方法獲得的菌絲體的含水量Table 3 Moisture content of separating the mycelium by different methods %

    表4 不同方法分離的菌絲體提取RNA的產(chǎn)量Table 4 The RNA yield of separating the mycelium in different methods

    2.6 不同分離法收集菌絲體中提取的核酸質(zhì)量和產(chǎn)量

    采用CTAB方法提取不同菌種、不同方法收集的菌絲體的總RNA 結(jié)果(表4)表明,6種真菌分別采用3種分離方法收集的菌絲體中均能提取出總RNA,并且RNA 的OD 值均在1.9~2.1。說明,采用這3種分離方法獲得的菌絲體中的RNA 均能滿足后續(xù)試驗的質(zhì)量要求。但對于同一菌種,3 種分離方法收集的等量菌絲體中提取的總RNA 的產(chǎn)量差異較大,其中,以采用紗布過濾法收集的菌絲體,其提取的總RNA 產(chǎn)量最高。說明,采用紗布過濾法分離菌絲體,比高速離心和減壓過濾法能獲得更高的核酸產(chǎn)量。

    3 結(jié)論與討論

    研究建立了一種快速節(jié)能的菌絲體與發(fā)酵液分離方法——多層紗布過濾法。該方法具有操作簡單、分離速度快,節(jié)能,成本低,收集的菌絲體含水量低,以及不影響菌絲體中提取的核酸質(zhì)量等許多優(yōu)點,非常實用,值得推廣。

    目前,實驗室中多采用傳統(tǒng)的高速離心法和減壓抽濾法將菌絲體與發(fā)酵液分離。本研究選取6個不同種屬具有代表性的生長性狀差異極大的真菌菌株,分別采用高速離心、減壓抽濾和紗布過濾3種不同的分離方法收集菌絲體的效果表明,高速離心法即使離心速度很高也很難將真菌發(fā)酵產(chǎn)物中的菌絲體完全密實地沉降到試管底部,導致分離上清液后收集到的菌絲體仍含有較多的水分,分離效果不好。而減壓抽濾法對這6種真菌的菌絲體進行分離時,對有些菌種的菌絲體收集效果好,對有些菌絲體的收集效果差,如收集的真菌S.sclerotiorum和R.solani的菌絲體的含水量仍然較高。并且,高速離心法和減壓抽濾法均須采用電動儀器設備(如高速離心機、真空抽濾泵等),存在操作步驟多、收集速度慢、耗電、成本高等問題。而本研究建立的紗布過濾法,操作簡單、成本低廉,只需要折疊8層、折疊后大小近似為30cm×12cm 的紗布、1副乳膠手套和1個15cm 直徑的培養(yǎng)皿即可。該方法廣泛適用于分離各種真菌的菌絲體及發(fā)酵液,與同行采用的傳統(tǒng)的高速離心法和減壓抽濾法相比,具有許多優(yōu)點。由此可見,多層紗布過濾收集菌絲體的方法非常實用,具有極大的推廣價值。

    [1]陳建愛,杜方嶺.黃綠木霉T1010對櫻桃番茄橫向土壤環(huán)境性狀改良效果研究[J].農(nóng)學學報,2011(8):36-41.

    [2]Aggarwal R,Sharma V,Kharbikar L L,et al.Molecular characterization ofChaetomiumspecies using URP-PCR[J].Genetics Molecular Biology,2008,31(4):943-946.

    [3]Fernando W G D,Nakkeeran S,Zhang Y,et al.Biological control ofSclerotiniasclerotiorum(Lib.)de Bary byPseudomonasandBacillusspecies on canola petals[J].Crop Protection,2007,26:100-107.

    [4]蘇惠春,程 波,傅冷西,等.3 種破壁方法提取念珠菌總RNA 效果的比較[J].中國真菌學雜志,2007,2(5):286-288.

    [5]徐 健,陶洪文,陳 蔭,等.厚藤共生真菌(Fusarium oxysporumY24-2)胞外多糖的化學組成和結(jié)構(gòu)研究[J].中國海洋大學學報,2011,41(10):87-92

    [6]劉志恒.現(xiàn)代微生物學[M].第2版.北京:科學出版社,2008.

    [7]左瑞娟,周雨泫,李麗娟,等.CTAB 法用于染病煙草植株中煙草叢頂病毒RNA 的提取[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報,2011,26(1):26-29.

    猜你喜歡
    過濾法離心法菌絲體
    基于深度強化學習的直流配電線路短路故障測距方法
    自然沉淀法與離心法在自體脂肪移植隆乳術(shù)中的應用效果對比研究
    一種改進的超聲提取氣相色譜法測定土壤中15種硝基苯類化合物
    中國測試(2018年4期)2018-05-14 15:33:30
    離心法和蒸餾法原油化驗研究
    影響原油含水化驗準確性的因素分析與改進措施
    葡萄糖酸鈉發(fā)酵廢棄菌絲體提取殼聚糖的研究
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:25
    新型環(huán)保吸聲材料——菌絲體膠合秸稈
    安全(2015年7期)2016-01-19 06:19:39
    冬蟲夏草發(fā)酵液和菌絲體中主要核苷類成分分析
    藥品檢驗中薄膜過濾法的應用價值
    擬黃薄孔菌菌絲體的固體培養(yǎng)條件及CAT和SOD活力動態(tài)研究
    蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久热精品热| 高清av免费在线| 一级毛片我不卡| 色视频www国产| 一级爰片在线观看| 全区人妻精品视频| 各种免费的搞黄视频| 久久97久久精品| 美女高潮的动态| 看黄色毛片网站| av在线蜜桃| 国产伦精品一区二区三区视频9| 精品一区在线观看国产| 少妇人妻精品综合一区二区| 一级毛片aaaaaa免费看小| 日本-黄色视频高清免费观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲最大成人av| 久久国内精品自在自线图片| 久久久久久久国产电影| 一个人看的www免费观看视频| 看非洲黑人一级黄片| 免费大片18禁| 如何舔出高潮| 国产精品.久久久| 少妇人妻一区二区三区视频| 91久久精品国产一区二区三区| 在线免费十八禁| 在线观看一区二区三区激情| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲综合色惰| 久久国内精品自在自线图片| 午夜免费观看性视频| 免费观看av网站的网址| 亚洲精品自拍成人| 各种免费的搞黄视频| 免费大片18禁| 国产 精品1| 中文字幕久久专区| 成人毛片60女人毛片免费| 各种免费的搞黄视频| 最近手机中文字幕大全| 精品一区二区三卡| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 一边亲一边摸免费视频| 丝袜脚勾引网站| 精品一区二区三卡| 免费高清在线观看视频在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久99热6这里只有精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美日韩精品成人综合77777| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 白带黄色成豆腐渣| 国产成人免费观看mmmm| 2021少妇久久久久久久久久久| 新久久久久国产一级毛片| 夫妻性生交免费视频一级片| 精品午夜福利在线看| 99久久精品国产国产毛片| 在线观看人妻少妇| 国产免费福利视频在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲无线观看免费| 黄片wwwwww| 在线观看免费高清a一片| 久久久久久久国产电影| 精品熟女少妇av免费看| 国国产精品蜜臀av免费| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 99久久精品一区二区三区| 交换朋友夫妻互换小说| 成人漫画全彩无遮挡| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲色图av天堂| 最新中文字幕久久久久| 精品久久久久久久末码| 欧美潮喷喷水| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 男女边吃奶边做爰视频| 韩国高清视频一区二区三区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精品久久久久久久久亚洲| 日日摸夜夜添夜夜爱| 99热这里只有精品一区| 夫妻性生交免费视频一级片| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 丝袜脚勾引网站| 另类亚洲欧美激情| 欧美日韩精品成人综合77777| 在线观看免费高清a一片| av线在线观看网站| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲国产精品成人久久小说| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久精品国产a三级三级三级| 成人亚洲精品一区在线观看 | 男女边吃奶边做爰视频| 香蕉精品网在线| 九草在线视频观看| 免费电影在线观看免费观看| 国内精品宾馆在线| 欧美日本视频| 久久99热这里只有精品18| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 九九在线视频观看精品| 欧美国产精品一级二级三级 | 久久久久网色| 免费看不卡的av| 黄片无遮挡物在线观看| 色播亚洲综合网| 99久久人妻综合| 国产熟女欧美一区二区| 91久久精品国产一区二区三区| 婷婷色av中文字幕| 亚洲av二区三区四区| 一级毛片 在线播放| 日韩亚洲欧美综合| 欧美+日韩+精品| 日韩中字成人| 久久久久精品性色| 特级一级黄色大片| av又黄又爽大尺度在线免费看| 在线免费十八禁| 免费av观看视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产综合懂色| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲国产成人一精品久久久| 大陆偷拍与自拍| 大码成人一级视频| 成人二区视频| 国产精品一区二区在线观看99| 在线观看三级黄色| 免费黄色在线免费观看| 久久女婷五月综合色啪小说 | 国产久久久一区二区三区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 777米奇影视久久| 最近的中文字幕免费完整| 麻豆成人av视频| 成人国产麻豆网| 国产亚洲av嫩草精品影院| 欧美潮喷喷水| 精品久久久久久电影网| 少妇人妻精品综合一区二区| 在线a可以看的网站| 国产男人的电影天堂91| 久热久热在线精品观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 日韩强制内射视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲人成网站高清观看| 久久国产乱子免费精品| 亚洲精品日本国产第一区| 欧美日本视频| 五月玫瑰六月丁香| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲成人av在线免费| 国产av不卡久久| 久久99热6这里只有精品| 免费av不卡在线播放| 亚洲国产欧美在线一区| 国产精品伦人一区二区| 91久久精品电影网| 国模一区二区三区四区视频| 人妻一区二区av| 精品一区二区免费观看| 少妇 在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| av一本久久久久| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 免费观看在线日韩| 色视频在线一区二区三区| videos熟女内射| 中文字幕av成人在线电影| 久久久久久久精品精品| 成年女人在线观看亚洲视频 | 老师上课跳d突然被开到最大视频| 久久精品人妻少妇| 亚洲精品国产av成人精品| 赤兔流量卡办理| 最新中文字幕久久久久| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 久久久久久久久久久免费av| av在线天堂中文字幕| 亚洲美女搞黄在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 欧美zozozo另类| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久99蜜桃精品久久| 午夜老司机福利剧场| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 夫妻午夜视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 交换朋友夫妻互换小说| 一区二区三区乱码不卡18| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产成人免费观看mmmm| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产精品av视频在线免费观看| 人妻少妇偷人精品九色| 在线a可以看的网站| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美zozozo另类| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲精品色激情综合| 干丝袜人妻中文字幕| 熟女电影av网| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 黄色欧美视频在线观看| 久久99热这里只有精品18| 少妇熟女欧美另类| 大话2 男鬼变身卡| 能在线免费看毛片的网站| 人人妻人人看人人澡| 亚洲伊人久久精品综合| 国产精品久久久久久久久免| 国产极品天堂在线| 成年人午夜在线观看视频| 国产成人freesex在线| 精品午夜福利在线看| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一级毛片我不卡| 熟女av电影| 亚洲av男天堂| 久热久热在线精品观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 在现免费观看毛片| 黄色一级大片看看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久99精品国语久久久| 美女内射精品一级片tv| 国产探花极品一区二区| 在线观看国产h片| 国产成人精品一,二区| 美女主播在线视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 日韩强制内射视频| 秋霞伦理黄片| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久久久久久国产电影| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产成人aa在线观看| 欧美区成人在线视频| 深爱激情五月婷婷| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 一级片'在线观看视频| 九九爱精品视频在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久国内精品自在自线图片| 九九在线视频观看精品| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲无线观看免费| 搡老乐熟女国产| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 永久免费av网站大全| 久久午夜福利片| 内射极品少妇av片p| 久久精品综合一区二区三区| 免费人成在线观看视频色| 少妇人妻久久综合中文| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产精品成人在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产成人精品久久久久久| 国产免费视频播放在线视频| 不卡视频在线观看欧美| 久久综合国产亚洲精品| 免费看不卡的av| 国产av不卡久久| 涩涩av久久男人的天堂| 草草在线视频免费看| 亚洲人与动物交配视频| 午夜福利高清视频| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲经典国产精华液单| 欧美zozozo另类| 国产伦在线观看视频一区| 色哟哟·www| 日本一本二区三区精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久精品国产自在天天线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲无线观看免费| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 高清日韩中文字幕在线| 日日啪夜夜爽| 精品一区二区免费观看| 高清在线视频一区二区三区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 高清毛片免费看| 免费观看a级毛片全部| 国产乱来视频区| 成人毛片a级毛片在线播放| 高清欧美精品videossex| 国产黄片美女视频| 亚洲高清免费不卡视频| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久久久久久久久成人| 免费大片18禁| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲,一卡二卡三卡| 在线精品无人区一区二区三 | 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲精品视频女| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一本一本综合久久| 大话2 男鬼变身卡| av女优亚洲男人天堂| 大话2 男鬼变身卡| 久久久久精品性色| 日韩av不卡免费在线播放| 下体分泌物呈黄色| 永久免费av网站大全| 久久久色成人| 国产爱豆传媒在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美xxⅹ黑人| av女优亚洲男人天堂| 人妻夜夜爽99麻豆av| 禁无遮挡网站| 寂寞人妻少妇视频99o| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产黄片美女视频| 丰满少妇做爰视频| 欧美三级亚洲精品| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 日日啪夜夜撸| 国产精品一二三区在线看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 22中文网久久字幕| 51国产日韩欧美| 国产爱豆传媒在线观看| 秋霞在线观看毛片| 午夜福利在线在线| 性色av一级| 国产黄频视频在线观看| 香蕉精品网在线| av国产免费在线观看| 久热久热在线精品观看| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲不卡免费看| 亚洲怡红院男人天堂| 91精品国产九色| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产精品一二三区在线看| 国产黄频视频在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 五月伊人婷婷丁香| av线在线观看网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产高清三级在线| 精品久久国产蜜桃| 尾随美女入室| 69人妻影院| 国产成人freesex在线| 久久97久久精品| 成人免费观看视频高清| videossex国产| 精品国产露脸久久av麻豆| 婷婷色综合www| 永久网站在线| 新久久久久国产一级毛片| 久久久久久伊人网av| 老女人水多毛片| 亚洲自偷自拍三级| 秋霞伦理黄片| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 欧美激情国产日韩精品一区| 一区二区三区四区激情视频| .国产精品久久| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品国产av成人精品| 天堂中文最新版在线下载 | 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日本一二三区视频观看| 永久免费av网站大全| 最近的中文字幕免费完整| 免费看a级黄色片| 欧美丝袜亚洲另类| 五月伊人婷婷丁香| 国产日韩欧美亚洲二区| 日韩av免费高清视频| 人妻 亚洲 视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 色5月婷婷丁香| 一区二区三区四区激情视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 精品少妇久久久久久888优播| 大香蕉久久网| 97热精品久久久久久| 日本免费在线观看一区| 最近2019中文字幕mv第一页| 深夜a级毛片| 亚洲美女搞黄在线观看| 精品午夜福利在线看| 99久久精品一区二区三区| 青春草亚洲视频在线观看| 日本熟妇午夜| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 秋霞在线观看毛片| 精品久久久久久久久亚洲| 久久久久久久久久久丰满| 免费电影在线观看免费观看| 午夜免费观看性视频| 偷拍熟女少妇极品色| 伦理电影大哥的女人| 一本久久精品| 在线观看av片永久免费下载| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美bdsm另类| 观看免费一级毛片| 97超视频在线观看视频| 涩涩av久久男人的天堂| 免费av毛片视频| 99热这里只有是精品50| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲天堂国产精品一区在线| www.色视频.com| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久久久久久午夜电影| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲精品aⅴ在线观看| 秋霞在线观看毛片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产免费又黄又爽又色| 欧美一区二区亚洲| 亚洲成色77777| 日韩亚洲欧美综合| 日本与韩国留学比较| 中文字幕制服av| 国产精品久久久久久精品电影| 日韩电影二区| 日本av手机在线免费观看| 亚洲av成人精品一区久久| 久久人人爽人人爽人人片va| 伦精品一区二区三区| 久久午夜福利片| 日韩欧美 国产精品| 乱系列少妇在线播放| 亚洲一区二区三区欧美精品 | av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产精品国产av在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲国产高清在线一区二区三| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产欧美亚洲国产| 一本一本综合久久| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产爽快片一区二区三区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 搡女人真爽免费视频火全软件| 精品久久久噜噜| 久久综合国产亚洲精品| 国产av码专区亚洲av| 在线免费观看不下载黄p国产| 精华霜和精华液先用哪个| 在线观看人妻少妇| 中国国产av一级| 白带黄色成豆腐渣| 久久久久精品性色| 黄片wwwwww| 黄色欧美视频在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 永久网站在线| 亚洲精品456在线播放app| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 精品久久久久久久末码| 男女啪啪激烈高潮av片| 丝瓜视频免费看黄片| 一级a做视频免费观看| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲色图综合在线观看| av在线蜜桃| 美女视频免费永久观看网站| xxx大片免费视频| 国产精品99久久久久久久久| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲欧美精品专区久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 舔av片在线| av天堂中文字幕网| 国产中年淑女户外野战色| 国产伦精品一区二区三区视频9| 午夜免费观看性视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产精品久久久久久久久免| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 人妻一区二区av| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 真实男女啪啪啪动态图| 欧美性感艳星| 日本-黄色视频高清免费观看| 欧美3d第一页| 亚洲av福利一区| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产欧美日韩精品一区二区| 国产高清有码在线观看视频| 日韩欧美 国产精品| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 精品久久国产蜜桃| 国模一区二区三区四区视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| av在线app专区| 国产视频首页在线观看| .国产精品久久| 麻豆乱淫一区二区| 最近最新中文字幕免费大全7| av专区在线播放| 69av精品久久久久久| 久久热精品热| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产精品爽爽va在线观看网站| 色网站视频免费| 人妻系列 视频| 高清日韩中文字幕在线| 欧美人与善性xxx| 五月天丁香电影| 久久精品久久久久久噜噜老黄| a级一级毛片免费在线观看| 精品久久久久久久末码| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产黄片视频在线免费观看| 午夜福利高清视频| 亚洲国产精品国产精品| 欧美一区二区亚洲| 国产精品一区二区性色av| 亚洲人成网站在线播| 欧美国产精品一级二级三级 | 国产成人freesex在线| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲精品一二三| 2021少妇久久久久久久久久久| 欧美日韩精品成人综合77777| 99久久精品一区二区三区| videossex国产| 黄片无遮挡物在线观看| 日韩电影二区| av国产久精品久网站免费入址| 国产精品偷伦视频观看了| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产成人免费无遮挡视频| 国产黄色免费在线视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 最近中文字幕高清免费大全6| 22中文网久久字幕| videos熟女内射| 久久精品久久精品一区二区三区| 中文字幕av成人在线电影| videos熟女内射| 69人妻影院| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 乱码一卡2卡4卡精品| 视频中文字幕在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产高清有码在线观看视频| 午夜日本视频在线| 国产色爽女视频免费观看| 免费观看无遮挡的男女| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产免费又黄又爽又色| 六月丁香七月| 免费看a级黄色片| 男女无遮挡免费网站观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲av国产av综合av卡| 丝袜喷水一区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 男人添女人高潮全过程视频|