無血清培養(yǎng)基干粉的生產(chǎn)工藝優(yōu)化

翁志兵，邵春花，胡 輝

（1.上海中信國健藥業(yè)股份有限公司，上海 201203；2.抗體藥物國家工程研究中心，上海 201203；3.上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200237）

無血清培養(yǎng)基干粉的生產(chǎn)工藝優(yōu)化

翁志兵1，邵春花1，胡 輝2，3

（1.上海中信國健藥業(yè)股份有限公司，上海 201203；2.抗體藥物國家工程研究中心，上海 201203；3.上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200237）

為了研究瞬時溫度的提高對培養(yǎng)基加工的影響，通過不同的固定溫度處理培養(yǎng)基，考察不同溫度長時間處理后的培養(yǎng)基對CHO細(xì)胞的生長和表達(dá)的影響。結(jié)果表明，40℃處理后的效果最佳，處理工序與對照工藝相比，大大簡化，產(chǎn)能有很大提升，為大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)基設(shè)備的選型和生產(chǎn)參數(shù)設(shè)置提供理論依據(jù)，且提高了設(shè)備的生產(chǎn)效率。

無血清培養(yǎng)基；溫度；針磨

動物細(xì)胞培養(yǎng)多采用無血清培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基長期被國外供應(yīng)商壟斷，國內(nèi)生產(chǎn)無血清培養(yǎng)基的公司寥寥無幾。由于培養(yǎng)基所需的大部分原料容易受潮，若不進(jìn)行干燥處理，會對培養(yǎng)基的最終品質(zhì)以及用量造成不利影響。因此，在培養(yǎng)基生產(chǎn)中，首先需要在一定溫度下對原料進(jìn)行干燥處理。在處理過程中，不同成分對溫度的敏感程度各不相同，需要在不同的溫度下進(jìn)行處理，然后混合在一起，經(jīng)過碾磨最終制成培養(yǎng)基干粉。國內(nèi)現(xiàn)有的企業(yè)都是采用傳統(tǒng)球磨方式，球磨雖然結(jié)構(gòu)簡單，但鋼珠的清洗及搬運(yùn)費時費力，效率低下，工作噪音大，占地面積大，增加了生產(chǎn)成本和生產(chǎn)時間。另外，球磨工藝采用的是批次生產(chǎn)，造成單批產(chǎn)能有限［1-2］。

國內(nèi)抗體產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，規(guī)模越來愈大。如上海中信國健藥業(yè)股份有限公司投資的亞洲最大30 000 L抗體項目將于2015年年底投產(chǎn)，必將增大對無血清培養(yǎng)基的需求。如果繼續(xù)采用球磨方式會很大程度降低培養(yǎng)基的年產(chǎn)能。目前國際上已經(jīng)有培養(yǎng)基公司采用先進(jìn)針磨工藝，其優(yōu)勢在于能實現(xiàn)無血清培養(yǎng)基的連續(xù)生產(chǎn)，一臺體量很小的針磨設(shè)備就可以與大型球磨機(jī)產(chǎn)能相當(dāng)。但針磨工藝的缺點是設(shè)備高速旋轉(zhuǎn)，產(chǎn)熱量大；熱交換面積小，導(dǎo)致傳熱效率低，對培養(yǎng)基的品質(zhì)也會造成不利影響。同時，不同的工作溫度對設(shè)備的產(chǎn)能影響很大［3-8］。因此，找到一個績效比最高的生產(chǎn)溫度就顯得非常重要。目前，國內(nèi)對培養(yǎng)基干粉溫度處理的研究較少，對于針磨的使用缺乏實際經(jīng)驗。

針對針磨工藝導(dǎo)致瞬間溫度提高影響培養(yǎng)基質(zhì)量問題，筆者研究不同溫度長時間處理的培養(yǎng)基干粉對CHO細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白表達(dá)的影響，以確定績效最高的處理溫度。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)抗人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體的CHO細(xì)胞由上海中信國健藥業(yè)股份有限公司提供，培養(yǎng)基生產(chǎn)原料由上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基處理方法

設(shè)定4個溫度點，分別為40、60、80和100℃，處理時間4 h（針磨設(shè)備物料接觸極限值），以原方法處理的作為對照實驗（RT）。每個溫度點加2個平行試驗，以消除實驗誤差可能帶來的影響。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)方法

將細(xì)胞以1×106個/mL的初始細(xì)胞密度接種于1 L搖瓶中，載液量為400mL，培養(yǎng)時間為10 d，pH低于6.8補(bǔ)堿，每天補(bǔ)糖至3 g/L，溫度為37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，轉(zhuǎn)速為125r/min。每天取樣計數(shù)，并將培養(yǎng)液于10 000r/min離心5min，保存上清液于-20℃冰箱，用于理化參數(shù)分析。

1.4 分析方法

1.4.1 細(xì)胞計數(shù)

每天取樣利用臺盼藍(lán)拒染法染色，使用上海睿鈺生物科技有限公司的Countstar自動細(xì)胞計數(shù)儀讀取活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率，每樣計數(shù)3次，取平均值。

1.4.2 葡萄糖-乳酸測定方法

采用德國Labo公司全自動TRACE葡萄糖-乳酸分析儀檢測乳酸和葡萄糖濃度，每一樣品重復(fù)檢測1次，取平均值。

1.4.3 蛋白表達(dá)量測定方法

色譜柱采用AB公司POROS?A20 Columns，2.1 mm×30 mm，系統(tǒng)采用Agilent1260 HPLC。流動相A：50 mmol/L磷酸緩沖液，0.1 mol/L NaCl，流動相B：0.1%HCl，0.1 mol/L NaCl，流動相A和流動相B的比例為3∶7；流速1mL/min；檢測波長280nm；進(jìn)樣溫度（5±3）℃；柱溫（25±5）℃；進(jìn)樣量100μL。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溫度處理的培養(yǎng)基對活細(xì)胞密度的影響

研究不同溫度處理的培養(yǎng)基對活細(xì)胞密度的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同溫度處理的培養(yǎng)基對活細(xì)胞密度的影響Fig.1 Effects of medium treated with different temperature on cell density

從圖1可以發(fā)現(xiàn)，100℃時的活細(xì)胞密度最低，可能是由于培養(yǎng)基中的某些成分經(jīng)過100℃高溫處理后，會有部分損失，營養(yǎng)成分的減少影響了細(xì)胞的生長繁殖，造成了活細(xì)胞密度較低。在培養(yǎng)基磨制過程中，實際針磨工藝瞬時高溫可達(dá)80℃以上，對熱敏感物質(zhì)有很大破壞，例如PF68（一種非離子型乙烯和環(huán)氧丙烷共聚物，被用作消泡劑和抗擊細(xì)胞培養(yǎng)中剪切力的細(xì)胞膜穩(wěn)定劑）就會熔化并結(jié)塊。針磨處理培養(yǎng)基原料時間受設(shè)備處理能力和篩網(wǎng)大小影響，一般接觸時間約為10～30min，因此，控制針磨腔體內(nèi)部溫度尤為重要，一般使用干冰或液氮降溫。合理控溫點可在節(jié)約成本的同時提高產(chǎn)能。從活細(xì)胞密度來看，40℃和對照組差異較小，基本相同，細(xì)胞活力較高。

2.2 不同溫度處理的培養(yǎng)基對乳酸的影響

研究不同溫度處理的培養(yǎng)基對乳酸的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同溫度處理的培養(yǎng)基對乳酸的影響Fig.2 Effects of medium treated with different temperatures on lactate concentration

從圖2可以發(fā)現(xiàn)，100、80℃時的乳酸質(zhì)量濃度較高，達(dá)到1.75 g/L以上，60℃時的乳酸濃度居中，40℃和對照組的乳酸濃度最低。乳酸濃度較高會抑制細(xì)胞的生長和表達(dá)，對比圖1和圖2可以看出，乳酸濃度較高的，活細(xì)胞密度相對較低。

培養(yǎng)基干粉處理溫度較高時會對培養(yǎng)基成分造成一定影響，比如谷氨酰胺和轉(zhuǎn)鐵蛋白等［9-10］，這些成分與細(xì)胞生長和代謝相關(guān)，有可能是影響了三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)），能量代謝進(jìn)入了糖酵解途徑或者己糖磷酸支路（HMP）途徑，乳酸濃度升高。乳酸濃度越低，說明能量代謝越徹底，釋放的ATP越多，越有利于細(xì)胞生長和代謝，乳酸濃度高影響細(xì)胞能量代謝，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長和表達(dá)。因此，從乳酸濃度來看，40℃和對照組最優(yōu)。

2.3 不同溫度處理的培養(yǎng)基對目的蛋白表達(dá)量的影響

研究不同溫度處理的培養(yǎng)基對目的蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同溫度處理的培養(yǎng)基對表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of medium treated with different temperatures on protein epression

從圖3可以看出，100℃處理下的蛋白表達(dá)量最低，僅有2.06 g/L；40℃處理后的蛋白表達(dá)量和對照組蛋白表達(dá)量最高，分別達(dá)到2.45和2.53 g/L。其他溫度處理下的蛋白表達(dá)量均低于40℃下的表達(dá)量。100℃時的蛋白表達(dá)量最低，可能是由于培養(yǎng)基中的部分成分經(jīng)過100℃高溫處理后，會有部分損耗，營養(yǎng)成分的減少影響了細(xì)胞代謝，造成了蛋白表達(dá)量較低。

2.4 單因素實驗結(jié)果及方差分析

比較不同培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后活細(xì)胞密度、乳酸及其目的蛋白表達(dá)量，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表1和2所示。

表1 各組培養(yǎng)10 d后的活細(xì)胞密度、乳酸及其目的蛋白表達(dá)量的比較Table 1 Comparison of live cell density，lactate concentrate and the epression level of aim protein in different groups after 10 d′s culture（x±s）

表2 單因素實驗方差分析Table 2 One-was analysis of variance

由表1和表2可知：100℃處理下的活細(xì)胞密度最低，40℃處理下的活細(xì)胞密度最高，其他溫度處理下的活細(xì)胞密度與對照組比較均為顯著性差異。40℃時，P＞0.05，為非顯著性差異。40℃和對照組的乳酸濃度最低，濃度相差較小，非顯著性差異，較為接近。從蛋白表達(dá)量來看，40℃和對照組為非顯著性差異，其他組與對照組為顯著性差異，明顯高于其他處理溫度時的蛋白表達(dá)量，因此，40℃和對照組最優(yōu)。

3 結(jié)論

針對針磨工藝導(dǎo)致瞬間溫度提高影響培養(yǎng)基質(zhì)量問題，筆者研究不同溫度長時間處理的培養(yǎng)基干粉對CHO細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白表達(dá)的影響，以確定績效最高的處理溫度。綜合乳酸濃度、活細(xì)胞密度和蛋白表達(dá)量來看，40℃和對照組的均優(yōu)于其他組，其中對照組的乳酸濃度最低，蛋白表達(dá)量最高，但對照組的培養(yǎng)基干粉處理工序較為繁瑣，生產(chǎn)效率較低。而40℃處理后細(xì)胞的生長狀況和對照組為非顯著性差異，但是處理工序卻大大減少，生產(chǎn)效率得到大幅提高。綜合考慮，40℃的培養(yǎng)基干粉針磨處理工序是最佳的處理溫度。

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（責(zé)任編輯 管 珺）

Optimization of production process of serum-free medium

WENG Zhibing1，SHAO Chunhua1，HU Hui2，3
（1.Shanghai CP Guojian Pharmaceutical Ltd.，Shanghai 201203，China；2.National Engineering Research Center of antibody Medicine，Shanghai 201203，China；3.Shanghai Collaborative Innovation Center of Bio-Manufacturing Technology，Shanghai 200237，China）

In order to study instantaneous temperature's effects on serum-free medium，following limit experiments are designed，keeping the serum-free medium under different temperature for a long time to study the effects of medium under different temperature on the growth of CHO cells.The results show that 40℃ was the best temperature，it also reduces the procedure of medium manufacturing.It will provide a theoretical basis for the selection of medium producing equipment and production parameters，and improves production efficiency of the equipment.

serum-free medium；temperature；pin grinding

Q813

A

1672-3678（2015）05-0057-04

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.011

2014-08-25

上海市科學(xué)技術(shù)委員會科技支撐項目（12431901402）

翁志兵（1980—），男，江蘇泰興人，工程師，研究方向：無血清培養(yǎng)基及大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)，E-mail：weng1980@sina.com