星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化戊己丸提取工藝

張曉琳，張丹丹

（青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266042）

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化戊己丸提取工藝

張曉琳，張丹丹

（青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266042）

本文旨在優(yōu)化戊己丸中抑菌活性物質(zhì)的提取工藝。通過單因素試驗(yàn)考察了提取方法、提取溶劑、提取時間、液固比及溶劑體積分?jǐn)?shù)對抑菌活性的影響，在此基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對其提取工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，并對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。研究中以金黃色葡萄球菌為指示菌，以抑菌直徑為活性追蹤指標(biāo)。單因素試驗(yàn)表明：用乙醇為溶劑，回流提取戊己丸的抑菌效果最佳。通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化確定最佳提取工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)80.5%，提取時間38min，液固比8.3mL/g，回流提取2次。在此工藝條件下得到戊己丸提取液的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到22.20 mm。最終確定提取工藝簡單易行，所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性好。

戊己丸；抑菌活性物質(zhì)；提取工藝；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法

戊己丸始載于《太平惠民和劑局方》，現(xiàn)收載于《中國藥典》（2010版）一部［1］，由黃連、制吳茱萸和炒白芍按質(zhì)量比6∶1∶6組成。黃連抗?jié)兒涂垢篂a作用顯著，為君藥；吳茱萸的配伍使其抗?jié)?、抗腹瀉作用顯著增強(qiáng)，同時具備較好的鎮(zhèn)痛作用，起到反佐的功效；等量配伍的白芍則作為臣藥，起協(xié)同增效的作用［2］，是臨床上治療消化性胃潰瘍、胃炎的經(jīng)典方劑。該方傳統(tǒng)劑型為丸劑，以三味中藥的細(xì)粉為原料，水泛成丸，該制劑胃內(nèi)停留時間短，生物利用度差，若以全方提取物為原料入藥，將促進(jìn)有效成分的溶出，從而提高療效。因此，對其提取工藝的優(yōu)化研究顯得尤為重要。

近年來，對戊己丸全方提取工藝的優(yōu)化研究多以測定其代表成分的含量為評價指標(biāo)［3-4］，與藥效之間的關(guān)系并不明確。筆者選取3種藥材抑菌譜中的相同菌種［5］（金黃色葡萄球菌）為目標(biāo)菌，通過觀察戊己丸不同提取物對金黃色葡萄球菌抑菌活性的強(qiáng)弱，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，以期為進(jìn)一步的劑型開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

牛肉膏（北京鴻潤寶順科技有限公司，生物試劑）；蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，生物試劑）；瓊脂（青島正業(yè)試劑儀器有限公司，分析純）；乙醇（煙臺三和化學(xué)試劑有限公司，分析純）；NaOH（天津博迪化工股份有限公司，分析純）；NaCl（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，分析純）；金黃色葡萄球菌（筆者所在實(shí)驗(yàn)室成員自制）；其余試劑均為分析純，超純水；黃連、制吳茱萸和炒白芍藥材均購于青島同仁堂藥店。

FA1004型電子天平（上海精密科學(xué)儀器分公司）；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；四兩裝高速中藥粉碎機(jī)（山東青州精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；RXZ型智能型人工氣候箱（寧波市科技園新江南儀器有限公司）；立式壓力滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；Sw-Cj-1F型單人雙面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 戊己丸提取液的制備方法

將3味中藥分別粉碎（過孔徑450μm篩），然后按質(zhì)量比6∶1∶6的比例混合均勻，每次稱取13.00 g，在不同條件下提取，將提取液過濾2～3次，收集濾液并減壓濃縮至10mL后，水浴蒸干，105℃烘干120min［5］，用95%的乙醇定容至10mL，備用。

1.3 抑菌實(shí)驗(yàn)方法

采用平板打孔法［6］，每個平板中加入適量培養(yǎng)基，冷卻后在無菌條件下加入適量菌懸液涂布均勻。用無菌打孔器在瓊脂平板上打直徑為6 mm的孔，挑出孔內(nèi)瓊脂，然后吸取80μL樣品溶液注入已打好的圓孔中，以95%乙醇為空白對照，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑［7］，抑菌直徑=樣品抑菌直徑-空白抑菌直徑。

1.4 單因素試驗(yàn)

在250mL三角瓶中加入13.00 g樣品，然后考察提取工藝、提取溶劑、溶劑體積分?jǐn)?shù)、液固比及提取時間對戊己丸抑菌效果的影響。將提取液過濾2～3次，收集濾液并減壓濃縮至10mL后，水浴蒸干，105℃烘干120min［3］，用95%乙醇定容至10mL，備用。

1.5 戊己丸抑菌物質(zhì)提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別考察液固比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間對抑菌效果的綜合影響，采用星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)［8］，用statistic 6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對戊己丸抑菌物質(zhì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素和水平表見表1。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)的因素和水平表Table 1 Variables and codes of central composite design

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取工藝對戊己丸抑菌物質(zhì)抑菌效果的影響在250mL三角瓶中加入13.00 g樣品，然后按液固比8mL/g的比例分別加入104mL的95%乙醇中，分別用超聲法、回流法和冷浸法提取2次，每次30min?？疾焯崛」に噷ξ旒和枰志镔|(zhì)抑菌效果的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：不同提取工藝下戊己丸抑菌物質(zhì)抑菌效果由高到低的順序?yàn)榛亓鞣?、超聲法、冷浸法，分析原因可能是：回流提取和超聲提取相對于冷浸均有加熱的過程，溶劑分子受熱，分子熱運(yùn)動加快，促進(jìn)有效成分溶出；而超聲法提取物抑菌活性略低于回流提取物，可能是由于超聲提取時易對中藥的細(xì)胞壁進(jìn)行破壞，在有效成分大量提出的同時，細(xì)胞內(nèi)對抑菌作用無用的雜質(zhì)相比于回流提取也大量被提取，因而同質(zhì)量提取物的抑菌效果稍弱于回流提取的提取物。最終選用回流法作為戊己丸抑菌物質(zhì)提取的提取工藝。

圖1 提取工藝對戊己丸抑菌效果的影響Fig.1 Effects of extraction method on antibacterial effects of Wuji pills

2.1.2 提取溶劑對戊己丸抑菌物質(zhì)抑菌效果的影響

在250mL三角瓶中加入13.00 g樣品，然后按液固比8mL/g的比例分別加入104mL水、甲醇、95%乙醇、丙酮和乙酸乙酯，用回流提取法提取2次，每次30min?？疾焯崛∪軇ξ旒和枰志镔|(zhì)抑菌效果的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知：不同提取溶劑下戊己丸抑菌物質(zhì)抑菌效果由高到低的順序?yàn)轶w積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇、甲醇、水、丙酮、乙酸乙酯，根據(jù)結(jié)果推斷，戊己丸中抑菌物質(zhì)多為極性物質(zhì)，這也確證了3味藥在方中的君臣反佐的地位，作為君藥和臣藥的黃連和白芍，其有效成分多為極性物質(zhì)，作為佐藥的吳茱萸，其有效成分多為弱極性物質(zhì)，故最終選用乙醇作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對戊己丸抑菌效果的影響Fig.2 Effects of extraction solvent on antibacterial effects of Wuji pills

2.1.3 溶劑體積分?jǐn)?shù)對戊己丸抑菌物質(zhì)抑菌效果的影響

在250mL三角瓶中加入13.00 g樣品，然后按液固比8mL/g的比例分別加入104mL 95%、85%、75%、65%和55%的乙醇提取2次，每次30min?？疾烊軇w積分?jǐn)?shù)對戊己丸抑菌物質(zhì)抑菌效果的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知：抑菌效果隨溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大，先增強(qiáng)后減弱，在85%時達(dá)到最大。分析原因可能是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)偏低時，一些親水性的蛋白質(zhì)、黏液質(zhì)、果膠、淀粉、部分多糖及其他水溶性雜質(zhì)會溶解于溶劑中，而這些雜質(zhì)往往不具備抑菌活性，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，雜質(zhì)溶出減少，有效成分溶出增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)太高，即超過85%后，過高體積分?jǐn)?shù)的乙醇可使植物細(xì)胞蛋白質(zhì)很快凝固，繼而妨礙其向細(xì)胞內(nèi)滲透，影響戊己丸方藥中抑菌活性成分的浸出，因此抑菌效果減弱。

圖3 溶劑體積分?jǐn)?shù)對戊己丸抑菌效果的影響Fig.3 Effects of solvent concentration on antibacterial effects of Wuji pills

2.1.4 液固比對戊己丸抑菌物質(zhì)抑菌效果的影響

在250mL三角瓶中加入13.00 g樣品，然后分別按液固比6、7、8、9、10mL/g的比例加入相應(yīng)體積85%乙醇提取2次，每次30min?？疾煲汗瘫葘ξ旒和枰志镔|(zhì)抑菌效果的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：抑菌效果隨液固比的增加而增加，當(dāng)達(dá)到8mL/g后抑菌效果基本維持不變。分析原因可能是隨著液固比的增加，相同質(zhì)量中藥中，有效成分溶出增加，當(dāng)液固比達(dá)到8mL/g，中藥中有效成分達(dá)到最大限度溶出，繼續(xù)增加液固比，有效成分溶出幾乎不增加，因此抑菌活性基本不變。

圖4 液固比對戊己丸抑菌效果的影響Fig.4 Effects of liquid to solid ratio on antibacterial effects of Wuji pills

2.1.5 提取時間對戊己丸抑菌物質(zhì)抑菌效果的影響

在250mL三角瓶中加入13.00 g樣品，然后按液固比為8mL/g的比例加入104mL 85%乙醇提取2次，每次分別提取10、20、30、40和50min?？疾焯崛r間對戊己丸抑菌物質(zhì)抑菌效果的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：抑菌效果隨提取時間的延長先增強(qiáng)而后略有下降，在30min時達(dá)最大。分析原因可能是，提取時間的延長有助于抑菌物質(zhì)的充分溶出，提取時間達(dá)到30min時，有效成分已達(dá)到最大溶出限度，提取時間繼續(xù)延長，有效成分溶出幾乎不增加，而抑菌物質(zhì)長時間受熱，易造成部分失活，因而提取時間選定為38min。

圖5 提取時間對戊己丸抑菌效果的影響Fig.5 Effects of extraction time on antibacterial effects of Wuji pills

2.2 戊己丸抑菌物質(zhì)提取工藝參數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化戊己丸抑菌物質(zhì)提取工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果如表2所示，分別用二項(xiàng)式擬合和線性擬合對表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。經(jīng)比較得二項(xiàng)式擬合所得的R值相對于線性擬合有了較大幅度的提高，因此，選擇二項(xiàng)式擬合模型處理數(shù)據(jù)。

得回歸方程：Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b4+ b5+b6+b7X1X2+b8X1X3+b9X2X3，得到的復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.984 648 63，用Statistica 6.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行多元回歸分析，對回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)、方差分析及各因素最佳點(diǎn)值分析，結(jié)果見表3。

參照文獻(xiàn)［8］中數(shù)據(jù)處理方法，舍棄p＞0.05的b7、b8項(xiàng)，以回歸方程Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b4+ b5+b6+b9X2X3進(jìn)行分線性估計(jì)，得到相關(guān)系數(shù)R=0.984 583 71，所得結(jié)果仍滿足要求，故最終采用表3所確定的二項(xiàng)式，結(jié)果見表4。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of experiment designed by central composite design test

表3 二次多項(xiàng)式非線性估計(jì)結(jié)果Table 3 Results of binomial model fitting

表4 二次多項(xiàng)式非線性估計(jì)結(jié)果Table 4 Results of binomial model fitting

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測

利用Statistica 6.0軟件分別繪制各因素的三維效應(yīng)面圖（圖6）。各變量最佳取值范圍參照文獻(xiàn)［8］由三維等高線圖讀取，由于從各三維等高線圖可以讀出2個變量的取值范圍，因此分別對由圖6的三維等高線圖中得到的變量取值范圍進(jìn)行進(jìn)一步的疊加，最終確定各變量的最佳取值范圍：X1為8.02～8.61mL/g、X2為79%～84%、X3為31.2～38.8min。

圖6 X1、X2和X3與抑菌直徑的三維效應(yīng)面圖Fig.6 X1，X2and X3and the inhibition diameters of the three-dimensional response surface

根據(jù)文獻(xiàn)［9］的方法，對回歸方程Y=-435.221+ 30.667X1+7.222X2+2.095X3-1.848-0.042-0.015-0.012X2X3進(jìn)行極值求解，即得出最佳提取工藝：液固比8.3mL/g，溶劑體積分?jǐn)?shù)為80.5%，提取時間為38min，回流提取次數(shù)為2次。

2.4 處方優(yōu)選工藝的驗(yàn)證

根據(jù)效應(yīng)面法的最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，抑菌結(jié)果見表5。

表5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證Table 5 Verification form of the experimental results

由表5可知：抑菌直徑的實(shí)際平均值為22.20 mm，和預(yù)測值22.45 mm相差不大，說明效應(yīng)面法所確定的提取工藝是比較可靠穩(wěn)定的。

3 結(jié)論

通過單因素和效應(yīng)面法研究，確定了戊己丸抑菌活性物質(zhì)最佳提取工藝為液固比為8.3mL/g，溶劑體積分?jǐn)?shù)為80.5%，提取時間為38min，回流提取2次。在此工藝條件下，戊己丸提取物的抑菌圈直徑可達(dá)到22.20 mm，與預(yù)測值基本吻合，說明所建立的數(shù)學(xué)模型具有較好的預(yù)測性，提取工藝簡單易行，為進(jìn)一步劑型開發(fā)提供了參考。

［1］國家藥典委員會.中國藥典：一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］賴靜怡，張振秋，林麗麗，等.戊己丸配伍機(jī)制研究［J］.中成藥，2011，33（7）：1241-1243.

［3］賴靜怡，張振秋，劉峰，等.多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選戊己丸提取工藝［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（8）：26-28.

［4］羅東玲.戊己丸配伍機(jī)制及其質(zhì)量控制方法的研究［D］.貴陽：貴陽中醫(yī)學(xué)院，2007.

［5］蔡光先，周賽男，蔡銳，等.超微戊己丸復(fù)方及單味藥的抑菌作用研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（6）：25-28.

［6］遲雪，張丹丹.效應(yīng)面法優(yōu)化石榴皮抑菌物的提取工藝［J］.生物加工過程，2014，12（2）：33-37.

［7］胡永金，韓小溪，薛橋麗，等.普洱茶不同提取物體外抑菌活性研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2013，29（8）：1770-1773.

［8］吳偉，崔光華.星點(diǎn)設(shè)計(jì)：效應(yīng)面優(yōu)化法及其在藥學(xué)中的應(yīng)用［J］.國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊，2000，27（5）：292-298.

［9］陸彬，吳偉.中心多點(diǎn)等距設(shè)計(jì)法優(yōu)化醋酸地塞米松聚丙交酯微球的制備工藝［J］.藥學(xué)學(xué)報，1999，34（5）：387-391.

（責(zé)任編輯 周曉薇）

Extraction of Wuji pills by central composite design-response surface methodology

ZHANG Xiaolin，ZHANG Dandan
（College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，Qingdao 266042，China）

We optimized the extraction of Wuji pills by single factor and central composite by central composite design-response surface methodology.The factors，such as extraction solvent，extraction time，liquid to solid ratio and solvent content were studied Staphylococcus aureus was used as the indicator bacterium and diameter of inhibition zone was used as the activity monitoring parameter.The result of single factor experiment showed that the ethanol-extracts of Wuji pills extracted by refluxing method exhibited best antimicrobial activity.The parameters of optimal extraction method obtained by central composite design-response surface methodology were ethanol content 80.5%，extracting time 38min，liquid to solid ratio 8.3mL/g and refluxing extraction 2 times.Under the above conditons，the extracts showed the best antimicrobial activity with the diameter of inhibition zone was 22.20 mm.The extraction method was simple，the model established by response surface methodology delivered predictive accuray.

Wuji pills；antimicrobial substances；extraction method；central composite design-response surface methodology

R284.2

A

1672-3678（2015）05-0047-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.009

2014-08-08

山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃（J15LM62）

張曉琳（1990—），女，山東龍口人，碩士研究生，研究方向：藥物新劑型與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，張丹丹（聯(lián)系人），副教授，E-mail：312685423@qq.com