枇杷葉總?cè)扑岬奈⒉ㄝo助超聲提取工藝

劉 曦，黃伯駿，韓 偉

（華東理工大學(xué) 中藥現(xiàn)代化工程中心，上海 200237）

枇杷葉總?cè)扑岬奈⒉ㄝo助超聲提取工藝

劉 曦，黃伯駿，韓 偉

（華東理工大學(xué) 中藥現(xiàn)代化工程中心，上海 200237）

以枇杷葉為研究對象，采用微波輔助超聲提取其中的三萜酸，并采用香草醛-高氯酸比色法進行分析，建立標準曲線?？疾焯崛》绞健⒔輹r間、乙醇濃度、提取時間、液固比和超聲功率等因素，得到微波輔助超聲提取的優(yōu)化工藝條件：提取方式為先微波后超聲，無浸泡，乙醇體積分數(shù)為75%，超聲功率為144 W，液固比為25mL/g，微波時間為180 s，超聲時間為75min，由此得到的枇杷葉總?cè)扑岬寐蕿?.994%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的中藥提取方法。

枇杷葉；總?cè)扑?；微波輔助提??；超聲提取

枇杷葉（Eriobobotryae Folium）為薔薇科植物枇杷Eriobobotryae Folium（Thunb.）Lindl.的干燥葉，是一種常用的化痰止咳平喘藥，味苦、性微寒，歸肺經(jīng)和胃經(jīng)，其藥用歷史最早見于《名醫(yī)別錄》［1］。枇杷葉具有清肺、化痰、止咳和胃降逆止嘔的功效，主要用于治療肺熱咳嗽、胃熱嘔逆、氣逆氣喘和煩熱口渴等癥狀［2］。枇杷葉中含有多種有效成分，如三萜酸、黃酮、多糖、揮發(fā)油、鞣質(zhì)及維生素等［3］。其中三萜酸是枇杷葉的主要活性成分，包含熊果酸、齊墩果酸、科羅索酸、樺木脂酸以及馬斯里酸等［4-5］，本研究的目標組分是枇杷葉中的三萜酸，是一類天然的弱酸性五環(huán)三萜類化合物，難溶于水和石油醚，但可溶于乙醇、甲醇和丙酮等有機溶劑中［6］。臨床藥理研究發(fā)現(xiàn)，三萜酸具有抗炎鎮(zhèn)痛［7］、保肝護肝［8］、降低血糖［9］、抗氧化［10］、抗抑郁［11］和抗腫瘤［12］等多種藥理作用，具有很大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。

目前，三萜酸的提取方法主要有溶劑萃取法、熱回流法、索氏提取法、生物酶提取法、超臨界CO2提取法、超聲輔助提取法和微波輔助提取法［13］等。傳統(tǒng)的中藥提取方法具有提取時間長、效率低和成本高等缺點。筆者所采用的微波輔助超聲提取法，可以有效地將微波的選擇性加熱、受熱均勻和熱效率高的特點［14］與超聲的空化作用、機械作用［15］結(jié)合起來，在枇杷葉三萜酸的提取過程中可以顯著縮短提取時間，提高提取效率，從而有望得到得率更高的三萜酸產(chǎn)品，以有力推進中藥新型提取方法聯(lián)用的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要原料與試劑

枇杷葉（產(chǎn)地浙江），購于上海華宇藥業(yè)有限公司；熊果酸對照品（純度≥98%），購于上海同田生物有限公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸和無水乙醇，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

UV1900PC型紫外分光光度計，上海市亞研電子有限公司；ER-692型微波提取裝置，中國電子器件工業(yè)總公司；SK3310HP型超聲提取裝置，上海市科導(dǎo)超聲儀器有限公司；HH-4型智能數(shù)顯恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限公司；101-0型恒溫干燥箱，滬南電爐烘箱廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取方法

精密稱定枇杷葉3.00 g置于250mL三口燒瓶，加入乙醇溶液，在微波裝置中間歇提取，采用冷凝回流裝置和空氣鼓泡器進行冷卻和攪拌，冷卻后再置于超聲波裝置中提取，冰浴冷卻后，減壓抽濾，取濾液待測。

1.2.2 分析方法

采用香草醛-高氯酸比色法對枇杷葉中的總?cè)扑岷窟M行分析。精密稱取熊果酸標準品，配制成質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的熊果酸標準品溶液。分別吸取熊果酸標準品和枇杷葉提取液，置于10mL具塞刻度試管中，揮去溶劑，加入體積分數(shù)5%香草醛-冰醋酸溶液0.5mL和高氯酸2.0mL，在60℃下加熱15min后冷卻，用冰醋酸定容至10mL，置于紫外-可見分光光度計中進行波長掃描，確定三萜酸的檢測波長為545nm。

1.2.3 計算方法

依據(jù)1.2.2節(jié)中的分析方法對枇杷葉中總?cè)扑嵛镔|(zhì)進行檢測，得到相應(yīng)的吸光度值A(chǔ)，并利用標準曲線的回歸方程計算出總?cè)扑釢舛?，從而進一步計算得率

式中：ρ為樣品中三萜酸的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取溶劑用量，mL；m為枇杷葉的質(zhì)量，g；n為溶液稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線的建立

采用熊果酸標準品溶液，以相應(yīng)顯色試劑作空白對照，在545nm的波長下進行檢測，并以熊果酸質(zhì)量濃度（ρ）為橫坐標、吸光值（A）為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 熊果酸標準曲線Fig.1 The standard curve of ursolic acid

由圖1可知：其線性回歸方程為A=42.947ρ+ 0.011 8，線性濃度范圍為 0.001 04～0.018 72 mg/mL，R2=0.999 5，說明熊果酸（總?cè)扑幔┵|(zhì)量濃度ρ與吸光值A(chǔ)具有良好的線性關(guān)系。并且經(jīng)過實驗考察，具有良好的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

2.2 提取條件的影響

2.2.1 提取方式的考察

不同的提取方式?jīng)Q定了有效成分的溶出效果，對單獨微波、單獨超聲、先微波后超聲和先超聲后微波4種提取方式進行比較研究，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出：微波與超聲聯(lián)用技術(shù)的提取效率優(yōu)于單項技術(shù)，并且先微波后超聲的提取效果優(yōu)于先超聲后微波。造成這種現(xiàn)象的原因可能是，雖然微波強烈的熱效應(yīng)和超聲波的空化效應(yīng)均會對細胞結(jié)構(gòu)造成一定的破壞，但是前者的破壞作用強于后者，所以先進行微波提取有助于有效成分在后續(xù)提取過程中的進一步溶出，從而進一步提高總?cè)扑岬牡寐省?/p>

圖2 不同提取方式對總?cè)扑岬寐实挠绊慒ig.2 Effect of extraction methods on yield of the total triterpenic acid

2.2.2 浸泡時間的影響

中藥飲片一般為干燥的動植物組織，因其細胞失水而不利于藥效成分的溶出，而對藥材的浸泡在一定程度上可以有助于藥效成分的溶出和提取?？疾旖輹r間對總?cè)扑岬寐实挠绊懀Y(jié)果如圖3所示。

圖3 浸泡時間對枇杷葉總?cè)扑岬寐实挠绊慒ig.3 Effects of soaking time on yield of the total triterpenic acid

由圖3可知：單獨浸泡時，浸出藥液的三萜酸得率隨時間延長先顯著增大，而后趨于平緩；若先浸泡后提取，三萜酸的得率沒有明顯變化，相對標準偏差（RSD）＜5%。表明在單獨浸泡時，一段時間的浸泡可以有助于目標產(chǎn)物的溶出。但在微波-超聲提取法時，在提取之前的浸泡對于提高得率幫助不大，可能原因是微波輔助超聲的提取方法對于枇杷葉三萜酸具有非常好的提取效果，相比之下，浸泡的效果則不是很明顯。因此，本實驗采取無浸泡、直接提取的方式。

2.2.3 乙醇體積分數(shù)的影響

在不同體積分數(shù)的乙醇溶液中，乙醇分子和水分子以不同強度的氫鍵締合，這種締合狀態(tài)會影響藥效成分的溶解度，從而影響其提取效果，考察乙醇體積分數(shù)對總?cè)扑岬寐实挠绊?，結(jié)果如圖4所示。

圖4 乙醇體積分數(shù)對枇杷葉總?cè)扑岬寐实挠绊慒ig.4 Effect of ethanol concentration on yield of the total triterpenic acid

由圖4可知：枇杷葉總?cè)扑岬牡寐孰S著乙醇體積分數(shù)的升高先增大后減小，在乙醇體積分數(shù)為75%時，三萜酸得率達到最大值，原因可能是三萜酸具有明顯的親脂性，所以不易溶于低濃度乙醇溶液；但是由于高體積分數(shù)乙醇會使胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，形成傳質(zhì)阻力，不利于提取過程的進行。因此，本實驗采用75%乙醇作為提取溶劑。

2.2.4 超聲功率的影響

選擇合適的超聲功率有助于提高枇杷葉三萜酸的提取效率。筆者在SK3310HP型超聲波清洗器可允許的超聲功率范圍內(nèi)，考察了超聲功率對三萜酸得率的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出：當超聲功率小于144 W時，總?cè)扑岬寐孰S超聲功率的增加而顯著增大；當超聲功率大于144 W時，三萜酸的得率基本不再增加。由此可知，超聲功率的增大可促使三萜酸的提取速度加快，但是當超聲功率達到一定值時，總?cè)扑岬寐什辉僭黾?。因此，本實驗選取144 W的超聲功率用于枇杷葉的提取實驗。

2.2.5 液固比的影響

液固比決定著液-固兩相之間傳質(zhì)動力的大小，從而影響提取效率。分別考察不同液固比對三萜酸得率的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖5 超聲功率對枇杷葉總?cè)扑岬寐实挠绊慒ig.5 Effect of ultrasonic power on yield of the total triterpenic acid

由圖6可知：隨著液固比的增大，提取溶劑的增加，三萜酸的得率先增大后減小，在液固比為25mL/g時達到最大值，原因可能是液固比的增大提高了提取溶劑與物料內(nèi)部的濃度差，有利于有效成分的擴散和溶出，但當液固比過大時，降低了傳熱速率，過量的提取液也會增加生產(chǎn)成本，不利于提取液后續(xù)處理。因此，本實驗采用的液固比為25mL/g。

圖6 液固比對枇杷葉總?cè)扑岬寐实挠绊慒ig.6 Effect of liquid-solid ratio on yield of the total triterpenic acid

2.2.6 微波時間的影響

微波輻射時間的作用效果與藥材質(zhì)量、溶劑體積和微波功率密切相關(guān)，筆者在微波功率為650 W的條件下，分別考察不同微波輻射時間對三萜酸得率的影響，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知：在一定范圍內(nèi)三萜酸得率隨著微波輻射時間的延長而顯著增加，當微波時間超過180 s時，三萜酸得率不再增加，超過210 s時，三萜酸得率開始下降。這表明，適當延長微波時間有利于加快三萜酸的溶出，但過長的微波時間又會使藥液中的三萜酸分解。因此，本提取過程中的微波輻射時間為180 s。

圖7 微波時間對枇杷葉總?cè)扑岬寐实挠绊慒ig.7 Effect of microwave time on yield of the total triterpenic acid

2.2.7 超聲時間的影響

超聲時間也是影響三萜酸提取效率的重要因素，筆者分別對超聲時間為15、30、45、60、75、90和105min的三萜酸提取效果進行考察，結(jié)果如圖8所示。

由圖8可知：三萜酸的得率隨著超聲時間的延長先增大而后減小，原因可能是隨著超聲時間的增加，三萜酸發(fā)生了一定程度的分解，并且過長的提取時間也會增加雜質(zhì)的溶出，不利于后續(xù)純化過程的進行。因此，本實驗所選擇的最佳超聲時間為75min。

圖8 超聲時間對枇杷葉總?cè)扑岬寐实挠绊慒ig.8 Effect of ultrasonic time on yield of the total triterpenic acid

2.3 不同提取工藝的比較研究

將微波輔助超聲提取三萜酸的工藝與其他提取方法進行比較，分別從提取時間、能源消耗和得率三方面進行考察，結(jié)果見表1。

通過表1中的比較可知：微波輔助超聲提取枇杷葉三萜酸的得率最高，比單獨超聲提取高2.966%，比熱回流提取高0.577%，比索氏提取高0.360%；而提取時間和能耗分別是單獨超聲提取的86.7%和98.4%，是熱回流和索氏提取的43.3%和20.2%。綜合考慮產(chǎn)品得率、提取效率與能耗，微波輔助超聲提取工藝與其他方法相比具有較大的優(yōu)勢。

表1 不同提取方法的比較Table 1 The comparison of different extraction methods

3 結(jié)論

1）通過對枇杷葉總?cè)扑岬奈⒉ㄝo助超聲提取工藝的考察可知：選擇先微波后超聲的提取方式，以切碎的枇杷葉為提取體系，以75mL的75%乙醇溶液為提取溶劑，對枇杷葉進行直接提取，先在微波發(fā)生裝置中提取180 s，再置于功率為144 W、溫度為60℃的超聲提取裝置中提取75min，三萜酸得率為9.994%。

2）通過對不同三萜酸提取方法的比較發(fā)現(xiàn)：由微波輔助超聲提取所得的枇杷葉三萜酸得率分別比超聲提取、熱回流提取和索氏提取法提高2.966%、0.577%和0.360%，超聲提取所需的時間是微波輔助超聲提取法的1.2倍，而傳統(tǒng)的提取方法（熱回流提取和索氏提?。┧璧奶崛r間和能耗分別是該方法的2.3和4.9倍。因此表明，微波輔助超聲提取法具有高效、省時和低能的優(yōu)點。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［M］.2010版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：19.

［2］李笑然.中藥學(xué)［M］.蘇州：蘇州大學(xué)出版社，2004.

［3］陳劍，李維林，吳菊蘭，等.枇杷葉的化學(xué)成分［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報，2006，15（4）：67-68.

［4］Li C，Li L，Wang C，et al.A new ursane-type nor-triterpenoid from the leaves of Eucommia ulmoides oliv［J］.Molecules，2012，17（2）：13960-13968.

［5］Caligiani A，Malavasi G，Palla G，et al.A simple GC-MS method for screening of betulinic，corosolic，maslinic，oleanolic and ursolic acid contents in commercial botanicals used as food supplement ingredients［J］.Food Chem，2013，136（2）：735-741.

［6］劉柯彤，陶亮，馬雄，等.熊果酸的生物活性及其提取工藝的研究進展［J］.化工技術(shù)與開發(fā)，2010，39（8）：41-44.

［7］Kim S H，Hong J H，Lee Y C.Ursolic acid，a potential PPARY agonist，suppresses ovalbumin-induced airway inflammation and Penh by down-regulating IL-5，IL-13，and IL-17 in a mouse model of allergic asthma［J］.Eur J Pharmacol，2013，701（1/2/3）：131-143.

［8］Gupta A，Sheth N R，Pandey S，et al.Determination of ursolic acid in fractionated leaf extracts of Ocimum gratissimum Linn and in developed herbalhepatoprotective tabletby HPTLC［J］. Pharmacognosy J，2013，5（4）：156-162.

［9］Lee J，Yee S T，Kim J J，et al.Ursolic acid ameliorates thymic atrophy and hyperglycemia in streptozotocin-nicotinamide-induced diabetic mice［J］.Chem Biol Interact，2010，188（3）：635-642.

［10］Ramachandran S，Prasad N R.Effect of ursolic acid，a triterpenoid antioxidant，on ultraviolet-B radiation-induced cytotoxicity，lipid peroxidation and DNA damage in human lymphocytes［J］.Chem Biol Interact，2008，176（2/3）：99-107.

［11］Machado D G，Neis V B，Balen G O，et al.Antidepressant-like effect of ursolic acid isolated from Rosmarinus officinalis L.in mice：evidence for the involvement of the dopaminergic system［J］.Pharmacol Biochem Behavior，2012，103（2）：204-211.

［12］劉毅敏，張定林，肖湘，等.熊果酸抗腫瘤作用及其機制研究進展［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2012，41（4）：398-400.

［13］Mandai Vivekanada，Mandai Subhash C，et al.Design and performance evaluation of a microwave based low carbon yielding extraction technique for naturally occurring bioactive triterpenoid：oleanolic acid［J］.Biochem Eng J，2010，50（1/2）：63-70.

［14］Zhang Huafeng，Zhang Xiang，Yang Xiaohua，et al.Microwave assisted extraction offlavonoidsfrom cultivated Epimedium sagittatum：Extraction yield and mechanism，antioxidant activity and chemical composition［J］.Ind Crops Prod，2013，50：857-865.

［15］項昭保，霍丹群，任紹光.超聲波在中草藥化學(xué)成分提取中的應(yīng)用［J］.自然雜志，2001，23（5）：289-291.

（責(zé)任編輯 周曉薇）

Microwave and ultrasound-assisted extraction of total titerpenic acid from Eriobobotryae Folium

LIU Xi，HUANG Bojun，HAN Wei
（Engineering Center for Tradition Chinese Medicine Modernization，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

Micronave and ultrasound-assisted extraction was developed to extract total triterperic acid in Eriobobotryae japonica.Standard curve was established with ultraviolet-visible spectrophotometry as detection method.Extraction methods，soaking time，ethanol concentration，extraction time，liquid-solid ratio and ultrasonic power were studied.The extraction process was optimized as follows：microwaveassisted extraction followed with ultrasonic extraction without soaking was chosen with ethanol concentration at 75%and liquid-solid ratio of 25mL/g.Microwave duration time was set to 180 s，and ultrasonic power at 144 W for 75min.The yield of the total triterpenic acid reached 9.994%.

Eriobobotryae Folium；triterpenic acid；microwave-assisted extraction；ultrasonic extraction

R284.2

A

1672-3678（2015）05-0052-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.010

2014-05-04

劉 曦（1989—），女，內(nèi)蒙古包頭人，碩士研究生，研究方向：中藥制藥工程；韓 偉（聯(lián)系人），教授，E-mail：whan@ecust.edu.cn