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    羊肚菌菌絲體鋅多糖的體內(nèi)、體外抗氧化作用

    2018-07-23 08:23:30李佳桐范麗娟龐士磊劉文玲陳濤濤
    食品科學(xué) 2018年13期
    關(guān)鍵詞:羊肚菌絲體自由基

    冮 潔,王 艷,李佳桐,范麗娟,曹 蕾,龐士磊,劉文玲,陳濤濤

    (大連民族大學(xué) 生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116600)

    鋅是人體必需的微量元素,能促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育和增強(qiáng)人體免疫機(jī)能[1]。全球近1/3的人口面臨著缺鋅引起的健康問題,缺鋅已成為影響人類健康的主要因素之一[2]。在我國(guó),約50%的兒童表現(xiàn)出輕微的缺鋅癥狀,而在以谷類作物為主食的北方尤其是偏遠(yuǎn)地區(qū),這種情況更為嚴(yán)重。鋅有“兒童生長(zhǎng)素”之稱,缺鋅可致免疫力低下、佝僂病、貧血、營(yíng)養(yǎng)不良及反復(fù)呼吸道感染,不同程度影響兒童生長(zhǎng)發(fā)育[3-4],甚至導(dǎo)致出現(xiàn)異食癖[5]。食用菌具有較強(qiáng)的富鋅能力,通過將鋅攝入食用菌菌絲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化,將無機(jī)鋅結(jié)合到大分子活性物質(zhì)(如多糖和蛋白質(zhì))上,形成有機(jī)鋅多糖和鋅蛋白,可以避免無機(jī)鋅的缺點(diǎn),并更有利于有機(jī)鋅的免疫功能和食藥用菌的抗病功能的發(fā)揮[6]。鋅多糖作為第三代的補(bǔ)鋅產(chǎn)品,能被人體更高效、更安全地吸收利用。鋅多糖具有抗氧化的功效,陳宏偉等[7]研究蛹蟲草胞外鋅多糖的抗氧化能力時(shí)發(fā)現(xiàn)鋅多糖對(duì)超氧陰離子自由基()、羥自由基(?OH)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基的清除能力與空白對(duì)照組相比分別提高了7.05%、23.50%和17.49%,胞外鋅多糖對(duì)自由基的清除能力與多糖質(zhì)量濃度呈正向關(guān)系,實(shí)驗(yàn)證明鋅多糖具有明顯的抗氧化功效。李正鵬等[8]研究發(fā)現(xiàn),樹舌胞外鋅多糖質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 g/L時(shí),對(duì)油脂過氧化物的抑制、?OH的清除、DPPH自由基和?的清除能力比對(duì)照組分別提高了12.50%、26.83%、30.00%、20.00%,胞外鋅多糖抗氧化活性與多糖質(zhì)量濃度呈顯著的量效關(guān)系。劉芳[9]在研究金針菇中的鋅多糖抗氧化活性時(shí)發(fā)現(xiàn),多糖質(zhì)量濃度相同的條件下,鋅含量與抗氧化活性有一定的正相關(guān)性。目前,研究較多是鋅多糖體外抗氧化活性,對(duì)體內(nèi)抗氧化活性研究的較少。羊肚菌(Morchella esculenta),是一種名貴的大型食藥兼用真菌,羊肚菌多糖是其主要的活性成分之一,能夠保護(hù)肝臟損傷[10]、延緩細(xì)胞衰老[11]、減少脂褐質(zhì)的沉積[12],對(duì)胃潰瘍[13]和胃黏膜有保護(hù)作用[14],對(duì)輻射危害有輔助保護(hù)功能[15],具有抗氧化、抗炎癥和抗腫瘤的作用[16-18]。目前,羊肚菌沒有實(shí)現(xiàn)大規(guī)模人工栽培[19],主要采用菌絲體的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法[20],適合生產(chǎn)的工業(yè)化,且深層液體發(fā)酵培養(yǎng)的食用菌菌絲體與其子實(shí)體在化學(xué)組成、生理功能上都很相似[21]。液態(tài)培養(yǎng)提取出的羊肚菌胞外多糖有較明顯的抑制腫瘤、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[22-23]。本課題組在已經(jīng)研究了羊肚菌菌絲體液體富鋅條件[24]和羊肚菌菌絲體硒多糖抗氧化活性的基礎(chǔ)上[25],對(duì)羊肚菌菌絲體鋅多糖體內(nèi)、外抗氧化性進(jìn)行了研究,以期闡明羊肚菌菌絲體鋅多糖抗氧化、抗衰老的功效,為食用菌鋅多糖的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物、材料與試劑

    昆明種小鼠,雄性,(15±2)g,5~6 周齡,由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。羊肚菌(M. esculenta)菌種由遼寧朝陽食用菌研究所提供。

    DPPH、氮藍(lán)四唑、二硫蘇糖醇 美國(guó)Sigma-Aldirch公司;乙二胺四乙酸、Tris-HCl、硫酸亞鐵銨、鄰二氮菲、VC、鄰苯三酚、D-半乳糖、乙醇、HNO3、苯酚、硫酸、核黃素、聚乙烯吡咯烷酮、H2O2、硫代巴比妥酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Z-2000火焰原子吸收光譜儀 日本日立公司;BS223S精密電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;ZHJH-C2112B超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司;UV-2000紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;HYG-3多功能搖床 金壇市杰瑞爾電器有限公司;GRP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;MLS-3750高壓滅菌鍋 日本三洋公司;TDZ5-WS離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 羊肚菌菌絲體液體培養(yǎng)

    斜面培養(yǎng)基(綜合PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO41.5 g、MgSO41.0 g、瓊脂粉20 g、水1 000 mL,pH值自然。菌種液體發(fā)酵采用不加瓊脂的綜合PDA培養(yǎng)基。

    菌種活化:將保存菌種用接種針接入斜面培養(yǎng)基中,25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。

    菌種液體培養(yǎng):將活化的斜面菌種4 塊(黃豆粒大?。┙臃N到裝有100 mL液體PDA綜合培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,25 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5 d。

    菌絲體液體培養(yǎng):將PDA液體培養(yǎng)基中的菌液按體積分?jǐn)?shù)10%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)5~7 d。發(fā)酵培養(yǎng)液5 000 r/min離心20 min,菌絲沉淀用蒸餾水洗滌3 次,菌絲體60 ℃干燥,測(cè)定其菌絲體多糖含量和鋅含量。富鋅組在培養(yǎng)基中加入600 mg/L硫酸鋅。不加鋅的為空白組。

    1.3.2 多糖的提取及測(cè)定

    采用熱水浸提法提取菌絲體多糖,料液比為1∶10(m/V),80 ℃水浴3 h,水浴浸提后過濾,濾液濃縮,加入無水乙醇溶液使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%,靜置于4 ℃冰箱內(nèi)醇沉12 h。取出后5 000 r/min離心15 min,沉淀用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液重復(fù)洗滌3 次,然后60 ℃干燥。

    多糖含量的測(cè)定:采用苯酚-硫酸比色法[26]。菌絲體鋅含量的測(cè)定:采用微波消解-火焰原子吸收光譜法測(cè)定,富鋅率根據(jù)式(1)計(jì)算[24]。

    式中:w為富鋅菌絲體鋅含量/(μg/g);w0為空白菌絲體鋅含量/(μg/g);ρ為培養(yǎng)基內(nèi)富鋅菌絲體質(zhì)量濃度/(μg/100 mL);ρ0為培養(yǎng)基內(nèi)鋅質(zhì)量濃度/(μg/100 mL)。

    1.3.3 體外抗氧化性實(shí)驗(yàn)

    1.3.4 體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)

    小鼠10 只為一組,正常飼養(yǎng)的為空白組;用每天腹腔注射D-半乳糖(100 mg/(kg?d))誘導(dǎo)致衰老小鼠作對(duì)照組;將羊肚菌菌絲體多糖溶于小鼠飲用水中,以每只小鼠飲用量為320 mg/(kg?d)進(jìn)行喂養(yǎng),喂養(yǎng)羊肚菌菌絲體多糖組小鼠為實(shí)驗(yàn)多糖組,喂養(yǎng)羊肚菌菌絲體鋅多糖組小鼠為實(shí)驗(yàn)富鋅組。小鼠喂養(yǎng)條件:自然晝夜,節(jié)律光照,溫度(18±5)℃,相對(duì)濕度40%~60%。自然采食,連續(xù)喂養(yǎng)30 d后,空腹12 h期間只供給飲水,之后摘除眼球取血,4 ℃、3 000 r/min離心10 min取血清,-20 ℃保存待用。脫臼處死,取肝和腎,用生理鹽水清洗,勻漿,4 ℃、3 000 r/min離心10 min,取上清液,-20 ℃保存待用。

    1.3.5 抗氧化酶活力和MDA含量的測(cè)定

    超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力采用氮藍(lán)四唑光化還原法測(cè)定[27];過氧化氫酶(catalase,CAT)活力測(cè)定采用紫外分光光度法[28];丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法[29]。

    1.3.6 小鼠臟器系數(shù)

    臟器系數(shù)根據(jù)式(2)計(jì)算。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 羊肚菌菌絲體多糖提取及富鋅率

    采用液體深層發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行羊肚菌菌絲體富鋅培養(yǎng),其菌絲體多糖提取和富鋅率計(jì)算結(jié)果如表1所示。

    表1 羊肚菌菌絲體多糖提取結(jié)果和富鋅率Table1 Extraction yield and zinc enrichment percentage of polysaccharides from Morchella esculenta mycelium

    由表1可知,羊肚菌菌絲體不加鋅培養(yǎng),菌絲體中多糖含量為641.10 mg/g;而添加了鋅源培養(yǎng)的菌絲體中多糖含量為695.40 mg/g。說明添加鋅能促進(jìn)羊肚菌菌絲體多糖的合成。羊肚菌菌絲體具有較強(qiáng)的富鋅能力,富鋅率可達(dá)18.20%,提取的粗多糖中鋅含量可達(dá)0.860 mg/g。

    2.2 羊肚菌菌絲體多糖體外抗氧化作用

    2.2.1 羊肚菌菌絲體多糖?OH清除率

    圖1 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)?OH清除率Fig. 1 Scavenging effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on hydroxyl free radicals

    通過測(cè)定VC、羊肚菌菌絲體鋅多糖和沒添加鋅源的菌絲體多糖對(duì)鄰苯三酚的自氧化抑制作用來表明它們清除活性,結(jié)果如圖2所示。

    圖2 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)?的清除率Fig. 2 Scavenging effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on superoxide anion free radicals

    0.48 mg/mL;未加鋅的羊肚菌菌絲體多糖的回歸方程為y=70.5x+6.77(R2=0.991),IC50為0.61 mg/mL;VC的回歸方程為y=79.835x+19.544(R2=0.986 1),IC50為0.38 mg/mL。對(duì)?清除作用大小為:VC>羊肚菌菌絲體鋅多糖>羊肚菌菌絲體多糖。羊肚菌菌絲體鋅多糖清除活性比羊肚菌菌絲體多糖提高27.08%。

    2.2.3 羊肚菌菌絲體多糖DPPH自由基清除率

    圖3 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)DPPH自由基的清除率Fig. 3 Scavenging effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on DPPH free radicals

    由圖3可得,羊肚菌菌絲體鋅多糖清除DPPH自由基的回歸方程為y=36.47x+28.317(R2=0.988 1),IC50為0.59 mg/mL;未加鋅的羊肚菌菌絲體多糖的回歸方程為y=49.415x+16.792(R2=0.993),IC50為0.67 mg/mL;VC的回歸方程為y=67.51x+34.876(R2=0.970 1),IC50為0.22 mg/mL。對(duì)DPPH自由基清除作用大小為:VC>羊肚菌菌絲體鋅多糖>羊肚菌菌絲體多糖。羊肚菌菌絲體鋅多糖清除DPPH自由基活性比羊肚菌菌絲體多糖提高13.56%。

    2.3 羊肚菌菌絲體多糖體內(nèi)抗氧化作用

    2.3.1 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

    表2 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響Table2 Effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on visceral organ indices in mice

    對(duì)照組小鼠臟器系數(shù)變小,說明小鼠臟器發(fā)生萎縮或其他退行性改變,即小鼠衰老模型建模成功。羊肚菌菌絲體多糖組和羊肚菌菌絲體鋅多糖組小鼠臟器系數(shù)均大于對(duì)照組,說明羊肚菌菌絲體多糖和羊肚菌菌絲體鋅多糖對(duì)衰老小鼠臟器萎縮均有抑制作用,羊肚菌菌絲體鋅多糖的抑制作用更強(qiáng)。

    2.3.2 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠體內(nèi)SOD活力的影響

    由表3可見,羊肚菌菌絲體多糖組、羊肚菌菌絲體鋅多糖組和對(duì)照組小鼠SOD活力具有顯著性差異(P<0.05),其中以肝臟最為顯著。與對(duì)照組相比,羊肚菌菌絲體鋅多糖使肝臟中SOD活力提高51.52%、血清SOD活力提高16.65%、腎臟SOD活力提高6.43%;未富鋅的羊肚菌菌絲體多糖使肝臟中SOD活力提高38.60%、血清SOD活力提高12.09%、腎臟SOD活力提高4.08%。羊肚菌多糖組小鼠體內(nèi)的SOD活力明顯高于對(duì)照組,羊肚菌多糖可明顯提高SOD活力,從而達(dá)到抗氧化作用。而羊肚菌鋅多糖組小鼠體內(nèi)的SOD活力與羊肚菌菌絲體多糖組小鼠體內(nèi)的SOD活力具有顯著性差異,說明羊肚菌鋅多糖抗衰老效果更佳。

    表3 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠體內(nèi)SOD活力的影響Table3 Effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on SOD activity in mice U/mg

    2.3.3 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠體內(nèi)CAT活力的影響

    表4 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠體內(nèi)CAT活力的影響Table4 Effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on catalase activity in mice

    表4結(jié)果表明,小鼠肝臟中,羊肚菌菌絲體多糖組和對(duì)照組無明顯差異,但羊肚菌菌絲體鋅多糖組與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。羊肚菌菌絲體鋅多糖使肝臟中CAT活力提高81.08%,腎臟CAT活力提高75.56%;未富鋅的羊肚菌菌絲體多糖使肝臟中CAT活力提高32.43%,腎臟CAT活力提高42.22%。羊肚菌菌絲體多糖可明顯提高小鼠體內(nèi)CAT活力,而羊肚菌菌絲體鋅多糖組小鼠體內(nèi)的CAT活力明顯高于羊肚菌多糖組,說明羊肚菌菌絲體鋅多糖抗衰老效果更佳。多糖通過提高機(jī)體內(nèi)SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶等的活力,間接清除自由基[25]。

    2.3.4 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠體內(nèi)MDA含量的影響

    表5結(jié)果表明,羊肚菌菌絲體多糖組、羊肚菌菌絲體鋅多糖組和對(duì)照組小鼠MDA具有顯著性差異(P<0.05),其中以肝臟最為顯著。羊肚菌菌絲體鋅多糖使肝臟中MDA含量下降58.50%,血清MDA含量下降44.57%,腎臟MDA含量下降76.69%;未富鋅的羊肚菌菌絲體多糖使肝臟中MDA含量下降20.86%,血清MDA含量下降29.03%,腎臟MDA含量下降46.63%。羊肚菌菌絲體多糖組小鼠體內(nèi)的MDA含量明顯低于對(duì)照組,說明羊肚菌多糖可明顯減少小鼠體內(nèi)MDA含量,從而達(dá)到抗氧化作用。而羊肚菌鋅多糖組小鼠體內(nèi)的MDA含量與羊肚菌菌絲體多糖組也有顯著性差異,說明羊肚菌菌絲體鋅多糖抗衰老效果更佳。

    表5 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠體內(nèi)MDA含量的影響Table5 Effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on MDA content in mice nmol/mg

    3 結(jié) 論

    羊肚菌菌絲體具有較強(qiáng)的富鋅能力,通過液體深層培養(yǎng)其菌絲體富鋅率可達(dá)18.20%,提取的粗多糖中鋅含量可達(dá)0.86 mg/g。清除?OH、和DPPH自由基的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了羊肚菌菌絲體多糖具有較強(qiáng)的體外抗氧化性,而通過富鋅培養(yǎng)獲得的羊肚菌菌絲體鋅多糖比羊肚菌菌絲體多糖具有更強(qiáng)的體外抗氧化活性。羊肚菌菌絲體多糖和羊肚菌富鋅菌絲體多糖能夠顯著提高D-半乳糖致衰老小鼠肝臟、腎臟和血清中的SOD和CAT活力,降低MDA含量(P<0.05)。并且,羊肚菌菌絲體鋅多糖比羊肚菌菌絲體多糖具有更強(qiáng)的抗衰老作用。

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