活性炭對(duì)魷魚皮酶解液脫色效果的研究

劉振鋒，戴圣佳，黃小鳴，呂衛(wèi)金，陳士國(guó)，葉興乾，*

（1.浙江宇翔生物科技有限公司，浙江杭州310024；2.浙江藍(lán)色海洋生物科技有限公司，浙江舟山316000；3.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

活性炭對(duì)魷魚皮酶解液脫色效果的研究

劉振鋒1，2，戴圣佳1，黃小鳴1，呂衛(wèi)金1，陳士國(guó)3，葉興乾3，*

（1.浙江宇翔生物科技有限公司，浙江杭州310024；2.浙江藍(lán)色海洋生物科技有限公司，浙江舟山316000；3.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

本文優(yōu)化了魷魚皮蛋白酶解液的脫色工藝。選用14種國(guó)內(nèi)不同廠家的活性炭對(duì)酶解液進(jìn)行脫色，以脫色率和蛋白質(zhì)損失率為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化活性炭的脫色效果。結(jié)果表明：8號(hào)活性炭脫色效果較優(yōu)且蛋白質(zhì)損失率較低，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)表明，各因素對(duì)于脫色率的影響順序?yàn)椋夯钚蕴坑昧浚久撋珪r(shí)間＞pH＞脫色溫度，對(duì)于蛋白質(zhì)損失率的影響順序?yàn)椋夯钚蕴坑昧浚久撋珳囟龋緋H＞脫色時(shí)間。綜合考慮確定最佳工藝條件：活性炭用量0.3%，pH4.5，溫度45℃，時(shí)間60 min，此時(shí)，脫色率達(dá)到86.78%，蛋白質(zhì)損失率為17.94%。

活性炭，魷魚皮蛋白酶解液，正交實(shí)驗(yàn)，脫色

魷魚加工是我國(guó)重要的水產(chǎn)品加工業(yè)之一，然而，魷魚在加工過(guò)程中產(chǎn)生了許多副產(chǎn)物，其中魷魚皮占8%～13%左右［1-2］，魷魚皮中膠原蛋白含量豐富，約占質(zhì)量的37%［3-4］，因此，可以作為一種新型的膠原蛋白資源。

魷魚皮蛋白經(jīng)酶解后得到的酶解液呈紫黑色，影響最終產(chǎn)品蛋白肽粉的色澤和風(fēng)味［5］。活性炭作為一種脫色劑在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，用活性炭對(duì)酶解液進(jìn)行吸附脫色在魚肉、魚皮脫色研究中已取得了滿意的效果［6-9］。活性炭來(lái)源廣泛，制作技術(shù)簡(jiǎn)單，比表面積大（300～1800 m2/g）［10］，選擇性高，在脫色的同時(shí)，還可有效地除嗅、除味［11-12］?；钚蕴坑辛詈头蹱顑煞N，粉狀吸附能力大，而粒狀機(jī)械強(qiáng)度大，在使用活性炭脫色時(shí)，必須根據(jù)具體脫色要求來(lái)選擇活性炭和脫色方法［13］。但是，活性炭在脫色的同時(shí)會(huì)造成蛋白質(zhì)的損失，因此，尋找一種既能高效脫色，又減少蛋白質(zhì)損失的活性炭是蛋白質(zhì)提取工藝中的迫切需要。

國(guó)內(nèi)外對(duì)活性炭脫色效果的研究較多［14-15］，但是利用活性炭對(duì)魷魚皮蛋白酶解液進(jìn)行脫色的研究較少，同時(shí)，將國(guó)內(nèi)不同廠家的活性炭集中起來(lái)比較脫色效果的研究較少。本文選取14種國(guó)內(nèi)不同廠家生產(chǎn)的活性炭對(duì)魷魚皮蛋白酶解液進(jìn)行脫色處理，以脫色率和蛋白質(zhì)損失率為指標(biāo)，并且對(duì)脫色效果最優(yōu)的8號(hào)活性炭脫色條件予以優(yōu)化，以期找到適合工業(yè)化生產(chǎn)的最優(yōu)工藝，為魷魚皮蛋白酶解液脫色的生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

魷魚皮購(gòu)于舟山魷魚加工廠，清洗瀝干后貯藏于-20℃冰箱；堿性蛋白酶（2.4 AU/g）天津市（中國(guó)）諾維信生物制藥有限公司；風(fēng)味蛋白酶（500 LAPU/g） 天津市（中國(guó)）諾維信生物制藥有限公司；木瓜蛋白酶（20萬(wàn)U/g） 廣西南寧龐博生物工程有限公司；活性炭購(gòu)自國(guó)內(nèi)14家活性炭公司；硫酸銅、濃硫酸、硫酸鉀、氫氧化鈉等杭州捷成生物科技有限公司。

HH2型數(shù)顯恒溫水浴鍋國(guó)華電器有限公司；UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)日本SHIMADZU公司；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)美國(guó)Thermo Scientific公司；Milli-Q超純水裝置美國(guó)MILLIPORE公司；Kjeltec 2300全自動(dòng)凱氏定氮儀瑞典FOSS公司；DELTA 320 pH計(jì)瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1魷魚皮蛋白酶解液的制備

1.2.1.1魷魚皮預(yù)處理將魷魚皮解凍后放入0.5% NaOH（1∶5，w/v）浸泡過(guò)夜，之后用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，瀝干，以去除雜蛋白。用絞碎機(jī)將浸泡后的魷魚皮絞碎。

1.2.1.2酶解絞碎的魷魚皮稱重，以1∶4（w/v）比例加入蒸餾水，一步酶解條件：堿性蛋白酶用量0.3%，pH10.0，溫度50，時(shí)間3 h，酶解完之后煮沸10 min滅酶。二步酶解條件：木瓜蛋白酶用量0.2%，風(fēng)味蛋白酶0.1%，pH7.5，溫度52.5℃，時(shí)間3 h，酶解完之后煮沸10 min滅酶［16-18］。

1.2.1.3離心將滅酶后的酶解液以4000 r/min離心10 min，取上清液，即為魷魚皮蛋白酶解液。

1.2.2蛋白酶解液的活性炭脫色

1.2.2.1不同活性炭脫色效果的比較將14種不同種類的活性炭（12種粉末狀和2種顆粒狀）編號(hào)，以0.5%（w/v）分別加入150 mL蛋白酶解液中，調(diào)pH至4.0，于恒溫電熱振蕩水槽中在45℃，200 r/min振蕩60 min，然后以6000 r/min離心15 min，取上清液，測(cè)A350和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算脫色率和蛋白質(zhì)損失率。

1.2.2.2單因素分析選取脫色效果最好的8號(hào)活性炭，對(duì)其脫色條件進(jìn)行單因素分析。因素包括活性炭用量、pH、脫色溫度和脫色時(shí)間。

活性炭用量對(duì)脫色效果的影響：選取活性炭用量分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%（w/v），將魷魚皮蛋白酶解液在pH4、溫度45℃條件下，水浴脫色60 min，比較不同活性炭用量的脫色效果。

pH對(duì)脫色效果的影響：選取活性炭用量0.4%，將魷魚皮蛋白酶解液在不同的pH為3、3.5、4、4.5、5于 45℃條件下，水浴脫色60 min，比較不同pH下活性炭的脫色效果。

脫色溫度對(duì)脫色效果的影響：選取活性炭用量為0.4%，pH為4，將魷魚皮蛋白酶解液分別在35、40、45、50、55℃溫度條件下，水浴脫色60 min，比較活性炭在不同脫色溫度下的脫色效果。

脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響：選取活性炭用量為0.4%，pH為4，溫度45℃，將魷魚皮蛋白酶解液分別脫色30、40、50、60、70 min，考察不同脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響。

1.2.2.3正交實(shí)驗(yàn)選取活性炭用量、pH、脫色溫度、脫色時(shí)間四因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素三個(gè)水平，選擇L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以脫色率和蛋白質(zhì)損失率為考察指標(biāo)，正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1　正交實(shí)驗(yàn)水平表Table 1　Factors and levels of the orthogonal array design

1.2.3脫色率的測(cè)定將魷魚皮蛋白酶解液稀釋后進(jìn)行了紫外-可見(jiàn)光波長(zhǎng)（200～800 nm）掃描，發(fā)現(xiàn)在320～380 nm范圍內(nèi)吸光值最高，所以選定350 nm作為判別酶解液色澤變化的測(cè)定波長(zhǎng)。

脫色率（%）=（脫色前A350-脫色后A350）/脫色前A350×100

1.2.4蛋白質(zhì)損失率的測(cè)定蛋白質(zhì)總氮含量通過(guò)凱氏定氮法（GB/T 5009.5-2003）測(cè)定。

蛋白質(zhì)損失率（%）=（脫色后蛋白含量-脫色前蛋白含量）/脫色前蛋白含量×100

1.2.5數(shù)據(jù)分析文中數(shù)據(jù)為3次平行測(cè)定值的平均值。采用Origin 7.5繪圖，顯著性分析采用SPSS 18.0的單因素方差分析（One-Way ANOVA，Turkey）在顯著性水平p＜0.05下進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)。

2　結(jié)果與分析

2.1不同種類活性炭對(duì)脫色效果的影響

不同廠家的活性炭對(duì)魷魚皮蛋白酶解液的脫色效果如表2所示，其中1～12號(hào)活性炭為粉末狀活性炭，13、14號(hào)為顆粒狀活性炭。由表2可知，粉末狀比顆粒狀活性炭脫色效果好，這與宗緒巖等［19］的研究結(jié)果一致。原因可能是粉狀活性炭顆粒小、脫色吸附比表面積大，所以吸附色素的能力更強(qiáng)［20］。但是活性炭在脫色的同時(shí)，蛋白質(zhì)也會(huì)有不同程度的損失，因此在選擇活性炭時(shí)應(yīng)綜合考慮兩種指標(biāo)。在12種粉末狀活性炭中，8號(hào)活性炭和1號(hào)活性炭的脫色效果最佳，脫色率分別達(dá)到84.42%和78.07%，而兩者的蛋白質(zhì)損失率分別為17.16%和16.54%，8號(hào)活性炭的脫色率比1號(hào)高了8.13%，而蛋白質(zhì)損失率比1號(hào)活性炭?jī)H高出3.75%，說(shuō)明在同等條件下，8號(hào)活性炭的脫色效果更佳。因此，選取8號(hào)活性炭作為本實(shí)驗(yàn)魷魚皮蛋白酶解液的脫色劑，并且對(duì)其脫色條件進(jìn)行優(yōu)化研究。

表2　不同活性炭對(duì)魷魚皮蛋白酶解液的脫色效果Table 2　Decoloring effect of different activated carbon for hydrolysis of squid skin protein

2.2活性炭用量對(duì)脫色效果的影響

由圖1可知，隨著活性炭用量的增加，脫色率也隨之增加，活性炭用量為0.4%、0.5%、0.6%時(shí)脫色率分別達(dá)到79.15%、83.49%和85.77%，但是從顯著性分析可知，這三種活性炭添加量對(duì)脫色效果差異不顯著（p＞0.05）。而蛋白質(zhì)損失率隨著活性炭用量的增加而增加，在0.4%以后蛋白質(zhì)損失率顯著增加，0.5%和0.6%的活性炭用量下，蛋白質(zhì)損失率分別達(dá)到23.09%和25.20%，而0.4%用量時(shí)蛋白質(zhì)損失率僅為17.00%（p＜0.05），可能的原因是較高濃度的活性炭在吸附色素的同時(shí)，也吸附了酶解液中部分具有極性的多肽類物質(zhì)和氨基酸等，而使得蛋白質(zhì)含量降低［21-22］。從工業(yè)和成本的角度綜合考慮，選取活性炭用量0.4%較為合適，此時(shí)脫色效果較好，且蛋白質(zhì)損失率也較低。

圖1　活性炭用量對(duì)脫色率和蛋白質(zhì)損失率的影響Fig.1　The effect of activated carbon content on decoloring rate and loss ratio of protein

2.3pH對(duì)脫色效果的影響

由圖2可知，脫色率隨pH的上升而下降，說(shuō)明活性炭在酸性條件下脫色效果較好，這可能是由于氫離子能夠改變色素大分子的結(jié)構(gòu)或電荷性質(zhì)，從而使其易于被活性炭吸附［23］。但是pH過(guò)低，蛋白質(zhì)的損失也較大，pH3和pH3.5蛋白質(zhì)損失率達(dá)到31.0%和27.7%，最終影響產(chǎn)品得率。而當(dāng)pH為4時(shí)，脫色率達(dá)到81.2%，同時(shí)蛋白質(zhì)損失率較小，綜合考慮蛋白質(zhì)損失率、脫色率以及pH過(guò)低影響后續(xù)工藝等因素，確定pH為4。

圖2　pH對(duì)脫色率和蛋白質(zhì)損失率的影響Fig.2　The effect of pH on decoloring rate and loss ratio of protein

2.4脫色溫度對(duì)脫色效果的影響

由圖3可知，隨著脫色溫度的升高，脫色率和蛋白質(zhì)損失率均呈現(xiàn)先上升后趨于平緩的趨勢(shì)。Sessa等［24］研究表明，活性炭脫色是一個(gè)吸熱的過(guò)程，屬于物理吸附，液體粘度會(huì)隨溫度的升高而降低，從而有利于溶液中色素分子的擴(kuò)散，使其與活性炭顆粒充分接觸，提高脫色效果［25］。但是，在溫度升高的同時(shí)，蛋白質(zhì)等大分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，活性炭在吸附色素的同時(shí)，也會(huì)吸附部分蛋白質(zhì)，造成蛋白質(zhì)損失率增加。當(dāng)溫度升高到45℃左右時(shí)，活性炭的吸附和解吸作用達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，蛋白質(zhì)損失率不再增加，但是當(dāng)溫度繼續(xù)升高，脫色率增加不明顯，原因可能是溫度升高活性炭的脫附作用增強(qiáng)［26］。綜合考慮溫度過(guò)高對(duì)酶解產(chǎn)物的影響，以及溫度升高能耗隨之增大，確定脫色溫度為45℃。

圖3　溫度對(duì)脫色率和蛋白質(zhì)損失率的影響Fig.3　The effect of temperature on decoloring rate and loss ratio of protein

2.5脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響

由圖4可知，反應(yīng)初期，脫色效果隨著脫色時(shí)間的增加而增加，而脫色時(shí)間為60 min后，脫色率變化平緩，說(shuō)明此時(shí)活性炭吸附基本達(dá)到飽和狀態(tài)［27］，繼續(xù)增加脫色時(shí)間會(huì)降低生產(chǎn)效率，因此，選擇脫色時(shí)間為60 min。

圖4　時(shí)間對(duì)脫色率和蛋白質(zhì)損失率的影響Fig.4　The effect of time on decoloring rate and loss ratio of protein

2.6正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，由表3可知，比較四個(gè)因素的極差，對(duì)脫色率影響大小為：活性炭用量＞脫色時(shí)間＞pH＞脫色溫度，最佳工藝條件為：A3B1C2D2，即活性炭用量為0.5%，pH為3.5，脫色溫度為45℃，脫色時(shí)間為60 min。對(duì)蛋白質(zhì)損失率影響大小為：活性炭用量＞脫色溫度＞pH＞脫色時(shí)間，最佳工藝條件為：A1B3C2D2，即活性炭用量為0.3%，pH為4.5，脫色溫度為45℃，脫色時(shí)間為60 min。

表3　正交實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析Table 3　Orthogonal experiment and result analysis

由表4和表5可以看出，活性炭用量對(duì)脫色效果和蛋白質(zhì)損失率的影響均達(dá)到極顯著水平（p＜0.05），pH和脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響呈顯著水平（p＜0.1），脫色溫度對(duì)兩個(gè)指標(biāo)均無(wú)顯著影響（p＞0.1）。

表4　脫色率方差分析Table 4　Variance analysis of decoloring rates

表5　蛋白質(zhì)損失率方差分析Table 5　Variance analysis of loss ratio of protein

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，比較活性炭用量發(fā)現(xiàn)，活性炭用量為0.4%時(shí)蛋白質(zhì)損失率最大，所以考慮活性炭用量為0.5%和0.3%，但用量0.5%時(shí)的脫色率比用量為0.3%時(shí)提高6.57%，同時(shí)蛋白質(zhì)損失率也提高了5.30%，考慮生產(chǎn)成本和蛋白質(zhì)回收率，選擇0.3%作為活性炭用量。酸度增大會(huì)提高脫色效果，但是pH過(guò)低，在調(diào)回中性時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的鹽分，給脫鹽工藝帶來(lái)困難，而反應(yīng)在pH4.5下的脫色率與pH4.0比較并無(wú)差異，但是蛋白質(zhì)損失率明顯比pH4.0低，因此，綜合考慮選擇pH4.5作為脫色的pH。溫度對(duì)脫色率與蛋白質(zhì)損失率的影響均不顯著，溫度在45℃時(shí)脫色率最高且蛋白質(zhì)損失率最低，并且溫度過(guò)高會(huì)對(duì)多肽品質(zhì)產(chǎn)生不利影響，因此脫色溫度選擇45℃。脫色時(shí)間對(duì)脫色率影響顯著而對(duì)蛋白質(zhì)損失率無(wú)顯著影響，按照正交最優(yōu)工藝條件，選擇脫色率最高且蛋白質(zhì)損失率最低的60 min作為最佳脫色時(shí)間。綜合分析考慮，最終確定最佳工藝條件為A1B3C2D2，即活性炭用量0.3%，pH4.5，脫色溫度45℃，脫色時(shí)間60 min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到酶解液的脫色率達(dá)到86.78%，蛋白質(zhì)的損失率為17.94%。

3　結(jié)論

以脫色率和蛋白質(zhì)損失率為考察指標(biāo)，對(duì)國(guó)內(nèi)14種不同廠家生產(chǎn)的活性炭進(jìn)行脫色效果的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8號(hào)粉末狀活性炭脫色效果最佳，且蛋白質(zhì)損失率較低。并且以此活性炭為脫色劑，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。各因素對(duì)脫色率影響大小為：活性炭用量＞脫色時(shí)間＞pH＞脫色溫度；對(duì)蛋白質(zhì)損失率影響大小為：活性炭用量＞脫色溫度＞pH＞脫色時(shí)間。最終確定最佳工藝條件為：活性炭用量0.3%，pH4.5，脫色溫度45℃，脫色時(shí)間60 min，此時(shí)，脫色率達(dá)到86.78%，蛋白質(zhì)的損失率為17.94%。本實(shí)驗(yàn)為魷魚皮蛋白酶解液的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

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Effect of activated carbon on decolorization of squid skin protein hydrolysate

LIU Zhen-feng1，2，DAI Sheng-jia1，HUANG Xiao-ming1，LV Wei-jin1，CHEN Shi-guo3，YE Xing-qian3，*
（1.Zhejiang Yuxiang Biotech Co.，Ltd.，Hangzhou 310024，China；2.Zhejiang Lansehaiyang Biotech Co.，Ltd.，Zhoushan 316000，China；3.School of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

This study aims at optimizing the decolorization conditions for hydrolysis of squid skin protein.14 activated carbons from different companies were selected to decolorize the squid skin protein hydrolysate.The decoloring condition of activated carbon was optimized with orthogonal test on the basis of single factor test，according to the decoloring rate and loss rate of protein.The results showed that active carbon-8 had the best decoloring effect and lower loss rate of protein.The sequences of every factors for decolorization rate were activated carbon content＞time＞pH＞temperature，and for loss rate of protein were activated carbon content＞temperature＞pH＞time.The optimum decoloring conditions were activated carbon 0.3%（w/v），pH4.5，temperature 45℃and time 60 min.The decoloring rate reached 86.78%and the loss rate of protein was 17.94%under the optimal conditions.

activated carbon；squid skin protein hydrolysate；orthogonal test；decolorization

TS209

B

1002-0306（2015）16-0261-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.045

2014-09-23

劉振鋒（1980-），男，博士，研究方向：海洋生物資源開(kāi)發(fā)與利用，E-mail：zhf00318@zju.edu.cn。

葉興乾（1962-），男，博士，教授，研究方向：食品科學(xué)與工程，E-mail：psu@zju.edu.cn。

杭州市“雛鷹計(jì)劃”（20131131k132）；富陽(yáng)市科研攻關(guān)專項(xiàng)（20140432B72）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31301417）。