食品中熒光假單胞菌的危害及其快速檢測方法研究進展

高　　琳，陳萬義，任　　婧，*

（1.光明乳業(yè)股份有限公司光明乳業(yè)研究院，乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，上海200436；2.上海海洋大學食品學院，上海201306）

食品中熒光假單胞菌的危害及其快速檢測方法研究進展

高琳1，2，陳萬義1，任婧1，*

（1.光明乳業(yè)股份有限公司光明乳業(yè)研究院，乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，上海200436；2.上海海洋大學食品學院，上海201306）

熒光假單胞菌（Pseudomonas Fluorescens）隸屬于假單胞菌屬，是食品中常見的一種嗜冷致病微生物。它能夠產(chǎn)生極其耐熱的蛋白酶和脂肪酶，這些酶在高溫處理后仍有殘留，并在食品儲藏過程中繼續(xù)分解其中的脂肪和蛋白質，導致產(chǎn)品的風味和質地發(fā)生變化。因此，研發(fā)出一種既快速又實用的熒光假單胞菌檢測方法成為食品行業(yè)關注的焦點。本文對食品中熒光假單胞菌的危害特點及國內外的一些快速檢測方法，如聚合酶鏈式反應（PCR）、熒光定量PCR、熒光原位雜交、流式細胞術等方法進行了綜述，比較各方法的優(yōu)缺點并展望了熒光假單胞菌快速檢測方法的發(fā)展趨勢。

熒光假單胞菌，危害，快速檢測方法，食品

食品安全問題是當今國際社會的熱點話題，食源性疾病的發(fā)病率處于各類疾病發(fā)病率的前列，嚴重影響公共健康。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的日益提高，我國的食品安全問題也越來越受重視。

熒光假單胞菌（Pseudomonas Fluorescens）是屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）的嗜冷微生物，它是一種環(huán)境污染菌，廣泛存在于水和土壤當中。它能夠在低溫環(huán)境下生長繁殖，冷藏的牛奶、高蛋白以及脂類豐富的食品一旦被熒光假單胞菌感染，該菌便會大量繁殖，逐漸演變?yōu)閮?yōu)勢菌群［1-2］。雖然經(jīng)過巴氏殺菌（72℃，15 s）以及超高溫滅菌（UHT）可以殺死熒光假單胞菌，但其產(chǎn)生和分泌的蛋白酶和脂肪酶非常耐熱，即使是巴氏殺菌和UHT處理也不能使這些酶完全失活。殘留的酶會導致牛奶的物理品質和感官品質發(fā)生變化。有臨床研究表明，熒光假單胞菌自溶后會釋放內毒素，內毒素中的磷脂成分若污染了血液制品，會導致病人輸血后產(chǎn)生不可逆的休克［3］。隨著人類社會電冰箱的普及，冷凍食品在人類的飲食構成中占據(jù)了極大的比例，嗜冷的熒光假單胞菌對于人類而言便是一種潛在的威脅。目前尚未有關于熒光假單胞菌導致食品中毒事件的報道，但是隨著人們生活質量的提高，食品安全越來越引起人們的重視，如何能夠快速的檢測出食品中的熒光假單胞菌這一難題便被提上食品安全的日程。

1　熒光假單胞菌的生物學特征

熒光假單胞菌在分類學上屬于假單胞菌屬，菌體細胞為直的短桿狀，大小為0.7～0.8×2.3～2.8 μm，兩端圓形，無菌毛，不產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色陰性［4］。有數(shù)根極生鞭毛，利用鞭毛運動。熒光假單胞菌是好養(yǎng)或者兼性厭氧的，進行嚴格的呼吸型代謝，以氧為最終電子受體，但能以硝酸鹽為替代的電子受體進行厭氧呼吸。其化能營養(yǎng)為異養(yǎng)，不需要有機生長因子。在酸性環(huán)境下幾乎所有的種都不能生長。熒光假單胞菌不產(chǎn)膿青酶，氧化酶陽性，接觸酶陽性，甲基紅實驗陽性，精氨酸雙水解酶陽性，V.P實驗陰性。熒光假單胞菌的生長溫度范圍為4～37℃，在4℃時繁殖最快，在42℃時就會停止生長，超過70℃，只需數(shù)秒即可被殺死。

熒光假單胞菌在自然界中分布廣泛，土壤、水、植物［5］及動物活動環(huán)境中均能生存，在海洋環(huán)境中也普遍存在。常大量寄生在魚類、兩棲類、爬行類動物甚至一些昆蟲的體內，其成員對動植物以及人類均具有致病性。熒光假單胞菌［6］常常存在于人的膿液、痰液、尿液、血液、胸腔積液和膽汁等，也是存在于人類腸道的正常細菌，但對正常人群不具有致病性。

2　熒光假單胞菌的流行病學特征

在臨床上熒光假單胞菌最主要的危害是侵染血液及血制品。早在二十世紀五十年代，Pittman［7］和Brande［8］曾先后通過分析庫存血液的污染菌，指出假單胞菌屬（Pseudomonas）是最常見的污染菌。賀許華等［9］曾報道過獻血者因攜帶熒光假單胞菌而污染庫存血液的案例。熒光假單胞菌對正常人不具有致病性，但其一旦進入人體血液，可導致諸如敗血癥、感染性休克以及血管內凝血等嚴重后果。曾有報道指出，在2004～2006年，由于用于癌癥病人的肝素化鹽清洗液被污染，導致超過80人被感染了熒光假單胞菌［10］。

熒光假單胞菌的致病性主要歸因于其釋放的內毒素，內毒素的磷脂成分可以引起細菌性休克以及彌漫性血管內凝血［11］。它能導致先天性或者獲得性免疫缺陷癥的病人罹患骨髓炎、敗血癥、化膿性關節(jié)炎、泌尿道及肺部感染等多種疾病。此外，熒光假單胞菌也是水生經(jīng)濟動物的條件致病菌，可引發(fā)草魚、青魚、鯉魚、鯽魚等大多數(shù)淡水魚類的赤皮病，也能引起熱帶魚、鮭科魚類和多種魚類的細菌性敗血病和赤皮病［12］。

3　熒光假單胞菌對食品的危害

從低溫冷藏條件下的原料乳中分離出的嗜冷菌以熒光假單胞菌為主［13］，通過對鮮乳中易污染的嗜冷菌進行分離鑒定與相關研究，已經(jīng)成功分離出熒光假單胞菌［14］。張陽旸等［15］經(jīng)過一年的采樣與篩選，發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)原料乳分離出的嗜冷菌中，假單胞菌屬細菌占了58%，其中熒光假單胞菌是牧場檢出率最高以及檢出月份最多的嗜冷菌。這些從冷藏原料乳中分離出的嗜冷熒光假單胞菌會產(chǎn)生胞外堿性蛋白酶，該酶會導致牛乳黏度增加、凝集以及乳清析出，牛乳品質顯著下降［16］，雖然通常巴氏殺菌工藝（72℃，15 s）可以將熒光假單胞菌殺死，但是熒光假單胞菌分泌的胞外耐熱性蛋白酶可以耐受超高溫瞬時滅菌（137℃，4 s）而存活，通常情況下大約會有10%的殘留。這些殘留將在奶制品儲藏過程中再次被激活，分解蛋白質和脂肪，從而導致乳制品物理品質和感官品質發(fā)生變化［17］，如出現(xiàn)苦味、腐敗味、脂肪氧化味或老化產(chǎn)生膠凝等一系列質量問題。這些品質變化明顯縮短乳品的保質期，不僅嚴重阻礙乳品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，而且會導致經(jīng)濟損失。

4　檢測方法概述

熒光假單胞菌不僅危害人類及動物的健康，而且會縮短食品的貨架期，造成經(jīng)濟損失。因此能夠快速并準確的檢測出食品中的熒光假單胞菌具有良好的實踐意義。

4.1傳統(tǒng)檢測方法

通常研究熒光假單胞菌在周圍的分布，主要采用電鏡掃描（SEM）、綠色熒光蛋白（GFP）標記細胞以及免疫化學的方法［18］。魚類熒光假單胞菌的傳統(tǒng)診斷方法包括病原分離培養(yǎng)和血清學檢測，但這些檢測方法無法快速并準確的檢測出食品中的熒光假單胞菌。

目前國內對熒光假單胞菌的檢測鑒定仍然以傳統(tǒng)培養(yǎng)方法為標準。在食品工業(yè)，檢測和鑒別熒光假單胞菌的方法主要是傳統(tǒng)的生理生化分析，基本步驟大致為樣品前處理、選擇性増菌、選擇性平板分離以及生理生化特征實驗等，實驗周期最少為4 d，檢測時間長，重復性低［19］，而且生化分析檢測范圍小，僅限于檢測幾個品種［20］，該方法雖然具有實用性和準確性，但是生化診斷法常常依賴于熒光假單胞菌的表型表達，其表型表達的特點是隨著環(huán)境的不同而表現(xiàn)出不同的表型，從而導致生理生化診斷的誤判［21］。隨著食品工業(yè)的發(fā)展及對高通量快速監(jiān)測技術的追求，傳統(tǒng)的檢測方法顯然不能適合當今科研和生產(chǎn)實踐等工作要求。

4.2現(xiàn)代分子生物學檢測方法

近些年，隨著基因組學和分子生物學的發(fā)展，一些新型快速檢測方法如聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR），實時定量PCR，熒光原位雜交，流式細胞技術［22］等技術已經(jīng)得到開發(fā)和應用。其中熒光原位雜交，流式細胞等技術能快速檢測嗜冷的熒光假單胞菌，并能對活菌進行計數(shù)，可以達到和傳統(tǒng)檢測方法一致的結果。

4.2.1PCR檢測方法聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。PCR反應自問世以來，因其具有特異性強、靈敏度高、操作簡便且省時等特點而深受學者們的青睞，并已被廣泛應用在食源性致病微生物的檢測領域。

PCR方法是現(xiàn)階段檢測熒光假單胞菌最快速最有效的方法［23］。由于熒光假單胞菌的PCR檢測尚處于起步階段，且假單胞菌屬是一個很大的群體，可以分為5個生物變型［24］，因此PCR檢測過程中特異性引物很難設計［2，25］。檢測靶點是分子檢測法的關鍵，目前已經(jīng)報道的檢測靶點包括16S rRNA基因［26-27］、apr基因［28-29］、gyrB基因［20，30］以及國內鄧顯文等報道的16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列［31］（ITS1，intergenic spacer）。

4.2.2多重PCR結合微陣列熒光顯色法DNA微陣列（DNA Microarray）也叫寡核苷酸陣列（Oligonucleitide array），它是在核酸雜交（Northern、Southern）的基礎上發(fā)展起來的一項新技術，是生物芯片中的一種。其原理是在固體表面上集成已知序列的基因探針，被測生物細胞或組織中大量標記的核酸序列與上述探針陣列進行雜交，通過檢測相應位置雜交探針，實現(xiàn)基因信息的快速檢測。DNA宏陣列（macroarray）是微陣列的技術基礎，通過使用兩組多重PCR技術進行顯色宏陣列體系，可以快速檢測出牛奶或肉類中的熒光假單胞菌。CHIANG Y等［32］通過設計DNA探針以及PCR引物，從牛奶及肉類食品中快速檢測出了李斯特菌、金黃色葡萄球菌以及熒光假單胞菌等細菌。這種宏陣列體系包括兩個步驟，首先是多重PCR引物實驗，然后是顯色DNA宏陣列，通過使用兩組多重PCR系統(tǒng)和包含對熒光假單胞菌特異性探針的宏陣列，為檢測出熒光假單胞菌，CHIANG Y等建立的特異的雜交模式，可以在18 h內檢測出熒光假單胞菌，此法不需使用瓊脂糖凝膠電泳，避免了瓊脂糖凝膠電泳不能識別出分子量接近的PCR產(chǎn)物的不足。宏陣列法檢測食品中的熒光假單胞菌精確快速且省時，可行性高。

4.2.3熒光定量PCR檢測法熒光定量PCR（realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR）是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程。通過結合相應的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。熒光定量PCR技術［33］在理論上優(yōu)于常規(guī)PCR方法，檢測速度更快，特異性更強，靈敏度更高，且可以實現(xiàn)對待測樣品的定量檢測。

近年來，熒光定量PCR方法已逐步取代常規(guī)PCR，成為食品安全與科學研究中PCR檢測的研究趨勢，廣泛應用于各類病原菌的快速檢測中。楊一林［23］選取gyr B基因為檢測靶點，建立了常規(guī)PCR和熒光定量PCR檢測體系，并進行了系統(tǒng)評價，經(jīng)過特異性、靈敏度以及抗干擾能力評價，證實了建立的熒光定量PCR體系可快速、準確的檢測食品樣品中熒光假單胞菌的存在。但是RQ-PCR［34］這一技術的局限之處在于無法區(qū)分樣品中的DNA是來自于活細胞還是死細胞。通過在DNA提取和擴增之前加入一種可以破壞死細胞完整性和DNA的染料，如EMA和PMA，從而抑制死細胞DNA的擴增。

4.2.4熒光原位雜交技術熒光原位雜交技術［35］（Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）是根據(jù)已知微生物不同分類級別上種群特異的DNA序列，以利用熒光標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，基于堿基互補配對原則，與環(huán)境基因組中DNA分子雜交。通過識別雜交位點的熒光信號來對特定核苷酸序列進行定性、定量以及定位分析。相較于其他檢測方法，F(xiàn)ISH檢測過程中無核酸提取及擴增過程，因而被認為是快速檢測食品中微生物的重要方法之一。隨著FISH技術的逐漸成熟，多色熒光原位雜交技術［36］（Multicolor Fluorescence In Situ Hybridization，MFISH）應運而生。Yamaguchi等［37］使用該技術在7 h內從牛奶中檢測出了熒光假單胞菌。FISH技術的不足之處在于其熒光信號的強弱取決于染色體含量的高低，一旦染色體含量較低，則會導致假陰性的檢測結果。此外，雜交探針的特異性也會對實驗結果造成影響，特異性不足，則會導致假陽性現(xiàn)象。

4.2.5流式細胞術流式細胞術［34］（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是能夠用來快速檢測液相中懸浮粒子多種物理特性的一種現(xiàn)代分析方法。它是以流式細胞儀為工具，將懸浮液中的待測細胞熒光染色，通過強激光照射被染色的細胞，產(chǎn)生的光信號經(jīng)光電分析器接受分析后轉變?yōu)閿?shù)學信號，從而對待測細胞進行定量分析［38］。Ruger等［39］利用流式細胞儀術從混合細菌中檢測出熒光假單胞菌。此法的優(yōu)點在于不需要對DNA進行提取和擴增，并且快速、靈敏且分析量大，在乳制品微生物的檢測中應用廣泛。但FCM的檢測結果也受多種因素影響，如乳制品中存在的大顆粒物質如蛋白質、脂肪球等，這些大分子物質會干擾流式細胞儀的定位。為了提升檢測靈敏度，可以在檢測之前將這些大分子顆粒清除。

5　結論與展望

存在于食品中的熒光假單胞菌不僅影響食品的質量，造成經(jīng)濟損失，而且能夠危害人類的健康。如何能夠快速高通量的檢測出食品中的熒光假單胞菌是食品安全領域迫切需要解決的問題。傳統(tǒng)的檢測方法不僅工作量大，耗時長，而且常常因為檢測結果不準確而出現(xiàn)“假陽性”或者“假陰性”現(xiàn)象，導致資源浪費或者有害食品流入市場。利用分子生物學技術檢測食品中的熒光假單胞菌克服了上述諸多問題，得到了越來越多學者的青睞。但是現(xiàn)代分子生物學方法依然存在各自的不足之處，隨著食品工業(yè)的發(fā)展，迫切的需要建立出一種更加快速、靈敏度高且成本低廉的快速檢測方法。只有更深入的研究，運用分子生物學方法快速檢測出食品中的熒光假單胞菌才會成為可能。

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表3　角鯊烯對小鼠肝臟MDA、GSH含量的影響（±s，n=10）Table 3　Effect of squalene on MDA and GSH contents in mouse live（r±s，n=10）

表3　角鯊烯對小鼠肝臟MDA、GSH含量的影響（±s，n=10）Table 3　Effect of squalene on MDA and GSH contents in mouse live（r±s，n=10）

組別　　劑量（mg/kg）MDA（nmol/g）GSH（μmol/g）正常組　34.0±10.4　0.915±0.396模型組　74.9±27.9##　0.586±0.247#陽性組　350　46.1±26.4*　0.853±0.283*角鯊烯高劑量組　500　22.82±7.0**　0.896±0.375*角鯊烯中劑量組　250　44.6±24.1*　0.878±0.296*角鯊烯低劑量組　125　68.1±20.5　0.759±0.283

3　結論與討論

短時期大量攝入酒精可引起急性酒精性肝損傷，研究表明氧化應激和脂質過氧化作用對酒精性肝損傷的發(fā)生、發(fā)展起著關鍵作用［8-9］。酒精進入人體后，大部分在十二指腸和空腸吸收，在體內代謝過程中產(chǎn)生過量的自由基，可導致肝細胞膜的脂質過氧化及體內GSH的耗竭［10］。在體內氧化還原系統(tǒng)中，GSH則是體內最主要的抗氧化成分；而MDA是脂質過氧化反應的終產(chǎn)物，其含量的多少直接反映了機體脂質過氧化損傷的程度。本研究結果顯示，模型組小鼠肝組織MDA含量極顯著（p＜0.01）增加，GSH水平顯著（p＜0.05）降低，而角鯊烯能明顯拮抗一次性大量攝入乙醇的小鼠肝臟MDA含量升高以及GSH水平的降低，其中以角鯊烯500 mg/kg的作用最為明顯。過度攝入酒精可造成α-磷酸甘油增加，從而加強TG合成，導致TG蓄積，使血清TG水平升高［11-12］。本實驗中急性酒精肝損傷模型能顯著（p＜0.05）升高小鼠的TG含量，角鯊烯可有效降低因急性酒精肝損傷引起的TG含量升高，且高劑量作用明顯。ALT、AST主要存在于肝細胞內，是人體代謝過程中必不可少的“催化劑”，當肝細胞發(fā)生炎癥、壞死等損傷時可釋放到血液中，致使血清中的水平升高，因此ALT、AST是反應肝細胞損傷的敏感指標。角鯊烯可顯著抑制急性酒精肝損傷引起的血清ALT、AST升高，且呈一定的劑量依賴性。

綜上可知，角鯊烯對急性酒精性肝損傷具有顯著的保護效果，其機制可能與角鯊烯抑制乙醇導致的肝細胞膜脂質過氧化，阻止MDA形成，避免肝功能的損害等有關。

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Research progress of hazards and rapid methods for detection of Pseudomonas Fluorescen in foods

GAO Lin1，2，CHEN Wan-yi1，REN Jing1，*
（1.StateKeyLaboratoryofDairyBiotechnology，DairyResearchInstitute，BrightDairy&FoodCo.，Ltd.，Shanghai200436，China；2.College of Food Science&Technolgy，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Pseudomonas Fluorescens belongs to Pseudomonas.It was a very common psychrotrophic pathogenic microorganisms in foods.It could produce some cellular enzymes with high thermal stability such as lipases and proteases.After treated at high temperature，these enzymes were still active and continue to decompose the fat and protein in foods.Therefore，recently more and more researchers focus the attention on the rapid and exact detection of Pseudomonas Fluorescens in foods.Some rapid detection methods were discussed in this paper，such as polymerase chain reaction（PCR），realtime fluores-cence quantitative PCR，fluorescence In situ hybridization and flow cytometry，and their advantages and disvantages were compared.At last，the research direction of Pseudomonas Fluorescens was discussed.

Pseudomonas Fluorescens；hazard；rapid detection method；food

TS207.4

A

1002-0306（2015）16-0373-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.068

2015－01－04

高琳（1991－），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品安全，E-mail：wangyiIrene@163.com。

任婧（1980－），博士，高級工程師，研究方向：食品安全及微生物分子生物學，E-mail：animalrain@hotmail.com。

國家“十二五”科技支撐計劃課題（2012BAD12B08，2012BAK17B14）。