重樓葉多糖改善D-半乳糖衰老模型小鼠脾臟免疫功能和抗氧化能力

劉功成，王作偉，李亭亭，杜金瑩，杜小剛，曹曉涵，曾憲垠

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院原子能農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究室，四川雅安625014）

重樓葉多糖改善D-半乳糖衰老模型小鼠脾臟免疫功能和抗氧化能力

劉功成，王作偉，李亭亭，杜金瑩，杜小剛，曹曉涵，曾憲垠*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院原子能農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究室，四川雅安625014）

采用D-半乳糖注射誘導(dǎo)衰老模型，探討了重樓葉多糖（PPLPs）對(duì)小鼠脾臟免疫功能和抗氧化的影響。分別對(duì)小鼠D-半乳糖、D-半乳糖和PPLPs、D-半乳糖和VC以及生理鹽水處理，持續(xù)42 d。結(jié)果顯示：與模型組相比，灌胃PPLPs或VC均能顯著增加小鼠脾臟指數(shù)（p＜0.05），顯著上調(diào)脾臟免疫相關(guān)基因（T-bet、GATA、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4和IL-10）mRNA表達(dá)水平（p＜0.05），也顯著增強(qiáng)了脾臟總超氧化物歧化酶（T-SOD）、銅鋅超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性（p＜0.05）；同時(shí)，灌胃PPLPs或VC顯著降低了脾臟丙二醛（MDA）含量（p＜0.05）。結(jié)果表明，PPLPs可增強(qiáng)脾臟免疫功能并提高小鼠的抗氧化活性。

重樓多糖，衰老，免疫，抗氧化，脾臟

目前，我國(guó)已進(jìn)入人口老齡化的快速發(fā)展階段。2010年，全國(guó)60歲以上的老年人口已接近2億，預(yù)計(jì)到21世紀(jì)中葉，將達(dá)到4.5億，約占總?cè)丝诘?/3［1］。免疫學(xué)理論認(rèn)為免疫功能的衰退是造成機(jī)體衰老的重要因素。另外，新陳代謝會(huì)產(chǎn)生活性氧（ROS），如超氧負(fù)離子自由基（O2-·）、過(guò)氧化氫（H2O2）和羥基自由基（·OH-）等。ROS可參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，但過(guò)多的ROS會(huì)擾亂機(jī)體正常氧化/抗氧化平衡，損害與免疫相關(guān)細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸，從而破壞了免疫細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降［2］。因此，機(jī)體ROS含量與衰老可能存在著密切的關(guān)系。

多糖分布于植物、動(dòng)物、微生物和藻類中，是維持生命機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)的基本物質(zhì)之一。研究表明，多糖具有免疫調(diào)節(jié)［3］、抗氧化［4］等功能，且由于多糖對(duì)細(xì)胞幾乎沒有毒副作用，現(xiàn)在越來(lái)越受到當(dāng)今醫(yī)藥與食品行業(yè)的關(guān)注。重樓是一種傳統(tǒng)中藥，廣泛分布于中國(guó)西南地區(qū)，具有消腫、緩解疼痛、有效治療蛇蟲咬傷及跌打損傷等作用［5］，并作為抗菌劑和止痛劑應(yīng)用于臨床［6-7］，但對(duì)于重樓多糖免疫調(diào)節(jié)作用的研究鮮見報(bào)道。

為此，本實(shí)驗(yàn)擬研究重樓多糖對(duì)小鼠脾臟免疫功能和抗氧化活性的影響，為尋找和開發(fā)新的安全、有效的免疫增強(qiáng)劑和天然抗氧化劑提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

昆明小白鼠成都達(dá)碩生物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（川）2013-24；重樓多糖四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院植物學(xué)系提供［8］；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒寶生物工程（大連）有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽還原酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA） 南京建成生物工程研究所。

CFX96熒光定量PCR儀百樂科技有限公司；UV-1100紫外可見分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司；ST16R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)北京聯(lián)合科力科技有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋常州國(guó)華電器有限公司；DGG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海齊欣科學(xué)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組和處理實(shí)驗(yàn)選取7～8周體重25～30 g的健康雌性昆明小白鼠，40只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組10只。其中第Ⅰ組，每天皮下注射0.2 mL生理鹽水（0.9%）和灌胃0.25 mL蒸餾水，為正常對(duì)照組（Normal）；第Ⅱ組，每天皮下注射0.2 mL D-半乳糖［120 mg/（kg·d）］和灌胃0.25 mL蒸餾水，為模型組（Model）；第Ⅲ組，每天皮下注射0.2 mL D-半乳糖［120 mg/（kg·d）］和灌胃0.25 mL VC［200 mg/（kg·d）］，為陽(yáng)性對(duì)照組（VC）；第Ⅳ組，每天皮下注射0.2 mL D-半乳糖［120 mg/（kg·d）］和灌胃0.25 mL重樓多糖［200 mg/（kg·d）］，為多糖處理組（PPLPs）。實(shí)驗(yàn)處理持續(xù)42 d，第43 d起禁食24 h，稱重后脫頸處死所有實(shí)驗(yàn)鼠，收集小鼠脾臟組織，稱重。將一部分脾臟組織進(jìn)行勻漿、離心取均漿上清液（10 mg/mL），待測(cè)；另一部分脾臟組織液氮研磨，通過(guò)苯酚-氯仿法提取組織總RNA，電泳檢測(cè)RNA以檢測(cè)其完整性以及是否污染。

1.2.2脾臟指數(shù)的測(cè)定采用如下公式：脾臟指數(shù)（mg/g）=脾臟質(zhì)量/小鼠體重［9］，計(jì)算小鼠脾臟指數(shù)。

1.2.3脾臟免疫功能相關(guān)基因的檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠脾臟免疫功能（T-bet、GATA、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10）相關(guān)基因的表達(dá)量。所提取出來(lái)的RNA采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，相關(guān)操作嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書進(jìn)行。然后以cDNA為模板在特定引物下進(jìn)行定量檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。PCR程序?yàn)椋?5℃，10 s；然后進(jìn)行40循環(huán)的PCR：95℃變性5 s，58～61℃退火+延伸25 s，最后進(jìn)行溶解曲線以監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計(jì)算。待檢測(cè)基因及基因檢測(cè)所采用的引物序列見表1。

表1　免疫功能相關(guān)基因及內(nèi)參基因引物序列Table 1　The primer sequences of immunity-related and reference genes

1.2.4脾臟抗氧化酶及MDA含量測(cè)定總超氧化物歧化酶（T-SOD）和銅鋅超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）：采用黃嘌呤氧化酶法；過(guò)氧化物酶（CAT）及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）：采用紫外分光光度法；丙二醛（MDA）：采用硫代巴比妥酸法。脾臟蛋白含量采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定。以上測(cè)定均按照相應(yīng)的試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中ANOVA對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析，采用LSD法進(jìn)行數(shù)據(jù)間多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，p＜0.05表示數(shù)據(jù)差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1小鼠體重及脾臟指數(shù)

脾臟是人體最大的淋巴器官和外周免疫器官，含有大量B細(xì)胞和T細(xì)胞，能產(chǎn)生與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的活性物質(zhì)，是研究免疫系統(tǒng)的一個(gè)極其重要的組織［11-12］。如表2所示，與正常對(duì)照組相比，連續(xù)注射D-半乳糖顯著降低了小鼠體重和脾臟指數(shù)（p＜0.05）。與模型組相比，連續(xù)灌胃PPLPs或VC均顯著提高小鼠體重和脾臟指數(shù)（p＜0.05），且將脾臟指數(shù)維持在正常對(duì)照組水平（p＞0.05）。PPLPs組小鼠脾臟指數(shù)與VC組相比差異不顯著（p＞0.05）。說(shuō)明PPLPs和VC可以改善D-半乳糖引起的脾臟萎縮，明顯提高D-半乳糖衰老模型小鼠脾臟指數(shù)，這與前人研究結(jié)果一致［13-14］。

表2　小鼠體重及脾臟指數(shù)（±s，n=10）Table 2　The body weights and spleen indices of mice（±s，n=10）

表2　小鼠體重及脾臟指數(shù)（±s，n=10）Table 2　The body weights and spleen indices of mice（±s，n=10）

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（p＜0.05）。

組別　　體重（g）　　脾臟指數(shù)（mg/g）正常對(duì)照組　31.89±1.13b　4.13±1.09b模型對(duì)照組　29.02±1.67a　2.69±0.87aVC組　31.32±1.19b　4.08±0.92bPPLPs組　32.55±1.31b　3.96±1.13b

2.2小鼠脾臟免疫基因mRNA表達(dá)水平

小鼠脾臟免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平如圖1所示。與正常對(duì)照組相比，連續(xù)注射D-半乳糖顯著下調(diào)小鼠脾臟T-bet、GATA-3、IL-2、IL-10、IL-4和TNF-α及INF-γ mRNA表達(dá)水平（p＜0.05）。而連續(xù)注射D-半乳糖的同時(shí)灌胃VC或PPLPs，均能顯著上調(diào)小鼠脾臟組織T-bet、GATA-3、IL-2、IL-10、IL-4、TNF-α及INF-γ mRNA表達(dá)水平（p＜0.05），且VC組與PPLPs組的T-bet、GATA-3、IL-2、IL-10、IL-4、TNF-α及INF-γ mRNA表達(dá)水平均無(wú)顯著差異（p＞0.05）。上述結(jié)果說(shuō)明，重樓多糖能通過(guò)提高體液免疫和細(xì)胞免疫作用而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。這與封海波等報(bào)道的川牛膝多糖可以提高小鼠免疫功能相關(guān)基因表達(dá)水平的研究結(jié)果相一致［4］。

2.3小鼠脾臟抗氧化酶活性

小鼠脾臟組織抗氧化酶活性如圖2所示。與正常對(duì)照組相比，連續(xù)注射D-半乳糖顯著降低小鼠脾臟組織中T-SOD、CuZn-SOD、CAT和GSH-Px酶活（p＜0.05）。在連續(xù)注射D-半乳糖的同時(shí)灌胃PPLPs或VC均能顯著提高小鼠脾臟T-SOD、CuZn-SOD、CAT、GSH-Px酶活（p＜0.05）。灌胃PPLPs與灌胃VC相比，除GSH-Px酶活無(wú)顯著差異外（p＞0.05），灌胃VC組TSOD、CuZn-SOD、CAT酶活都顯著高于灌胃PPLPs組（p＜0.05）。這些結(jié)果表明PPLPs可以通過(guò)提高抗氧化相關(guān)酶的活性，提高其抗氧化作用。這與李俊麗等的研究結(jié)果一致［15-16］。

圖1　小鼠脾臟T-bet、GATA-3、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及INF-γ mRNA表達(dá)水平Fig.1　The mRNA expression levels of T-bet，GATA-3，IL-2，IL-4，IL-10，TNF-α and INF-γ in spleen tissue of mice

圖2　小鼠脾臟T-SOD、CuZn-SOD、GSH-Px和CAT酶活Fig.2　Total superoxide dismutase and Cu，Zn superoxide dismutase in spleen tissue of mice

圖3　小鼠脾臟MDA含量Fig.3　MDA contents in spleen tissue of mice

2.4小鼠脾臟MDA含量

D-半乳糖屬生理性營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)入機(jī)體后，在半乳糖酶的作用下，生成醛糖和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫過(guò)量會(huì)使細(xì)胞膜的組成成分不飽和脂肪酸分解產(chǎn)生MDA，從而破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能［17］。小鼠脾臟MDA含量如圖3所示，與正常對(duì)照組相比，連續(xù)注射D-半乳糖顯著增加小鼠脾臟組織MDA含量（p＜0.05），說(shuō)明大量自由基的產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷機(jī)體，導(dǎo)致丙二醛（MDA）的產(chǎn)生和積累。與模型組相比，連續(xù)灌胃PPLPs或VC均顯著降低小鼠脾臟組織MDA含量（p＜0.05），且PPLPs組與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異（p＞0.05）。PPLPs組與VC組間小鼠脾臟組織MDA含量無(wú)顯著差異（p＞0.05）。表明VC可以抑制脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。以上結(jié)果表明，重樓多糖可能通過(guò)抑制機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化，減輕對(duì)機(jī)體組織造成的氧化損傷，這與前人研究結(jié)果一致［16，18］。

3　結(jié)論與討論

衰老的免疫學(xué)假說(shuō)認(rèn)為免疫功能的衰退是造成機(jī)體衰老的重要原因，免疫系統(tǒng)從根本上參與了機(jī)體的衰老過(guò)程［19］。目前衰老研究的模型中，D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠模型較為公認(rèn)［20-21］，衰老的代謝學(xué)說(shuō)認(rèn)為衰老是機(jī)體代謝性障礙的結(jié)果。連續(xù)給動(dòng)物注射D-半乳糖，在醛糖還原酶的催化下，還原成半乳糖醇，這種物質(zhì)不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響正常的滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂，最終導(dǎo)致衰老的發(fā)生［22］。故本實(shí)驗(yàn)以重樓多糖為研究材料，探討了其對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老模型小鼠脾臟免疫功能和抗氧化能力的影響。

初始T細(xì)胞分化為Th1或Th2的過(guò)程是受轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3蛋白調(diào)控的。T-bet誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為Thl細(xì)胞；GATA-3只在Th2型細(xì)胞中表達(dá)并調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子的分泌［21］。在分子免疫學(xué)上，Th1型細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α，主要是通過(guò)細(xì)胞因子作用于巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、CTL等細(xì)胞，提高其吞噬活性，發(fā)揮細(xì)胞免疫反應(yīng)。Th2型細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-4和IL-10，主要通過(guò)CK可刺激B淋巴細(xì)胞增殖并產(chǎn)生抗體，故其主要功能為輔助體液免疫反應(yīng)［23］。連續(xù)42 d給雌性小鼠皮下注射D-半乳糖顯著（p＜0.05）降低小鼠脾臟T-bet、GATA-3以及免疫相關(guān)基因（IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10）mRNA的表達(dá)。灌胃VC和PPLPs均可提高小鼠脾臟中T-bet、GATA-3以及免疫功能相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平，這可能是PPLPs增強(qiáng)小鼠脾臟免疫功能的機(jī)理之一。

動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)包括抗氧化酶（SOD、CAT）和GSH等抗氧化劑，它們可以及時(shí)清除體內(nèi)多余的自由基，防止自由基對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷［24］。連續(xù)42 d給雌性小鼠灌胃D-半乳糖顯著（p＜0.05）降低小鼠脾臟抗氧化物酶（T-SOD、CuZn-SOD、GSH-Px、CAT）活性，說(shuō)明D-半乳糖在半乳糖酶作用下分解，產(chǎn)生過(guò)量自由基嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物—丙二醛（MDA）的產(chǎn)生。注射D-半乳糖的同時(shí)給小鼠灌胃VC，小鼠脾臟抗氧化酶活性、MDA含量保持在正常對(duì)照組小鼠水平，給小鼠注射D-半乳糖的同時(shí)灌胃PPLPs與灌胃抗氧化劑VC效果相當(dāng)。因而推測(cè)重樓多糖可能通過(guò)提高超氧化物歧化酶活性，增強(qiáng)其對(duì)自由基的清除能力，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，降低丙二醛含量，從而減輕對(duì)機(jī)體組織的損傷以延緩衰老。

綜上所述，重樓多糖能顯著增強(qiáng)小鼠脾臟免疫功能及抗氧化能力，可作為天然抗氧化劑的重要來(lái)源。

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Effect of polysaccharides from the leaves of Paris polyphylla on immune function and antioxidant capacities of mouse spleen tissue in a D-galactose-induced aging mouse model

LIU Gong-cheng，WANG Zuo-wei，LI Ting-ting，DU Jin-ying，DU Xiao-gang，CAO Xiao-han，ZENG Xian-yin*
（Isotope Research Laboratory，College of Life Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

In the present study，the protective effects of polysaccharides from the leaves of Paris polyphylla（PPLPs）against aging in an accelerated aging mice model induced by D-galactose were investigated.A group of 2-month-old C57BL/6J mice were treated daily with D-galactose，D-galactose combined with PPLPs，D-galactose combined with vitamin C（VC），and control buffer for 42 d.The results showed that compared with the model group，oral administration of D-galactose-induced aging mice with either PPLPs or VCboth significantly increased spleen indices（p＜0.05），the mRNA expression levels of immune function related genes（T-bet，GATA，IFN-γ，IL-2，TNF-α，IL-4，and IL-10）（p＜0.05）and the total superoxide dismutase（T-SOD），CuZn superoxide dismutase（CuZn-SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px）and catalase（CAT）in spleen tissue were significantly higher in both PPLPs and VCgroup than those in the model group（p＜0.05）；besides，the malondialdehyde（MDA）concentrations were decreased in PPLPs and VCgroup compared to those in the model group（p＜0.05）.The results indicated that PPLPs was able to enhance the immune function and improve the antioxidant capacities of mouse spleen tissue.

PPLPs；aging；immunity；antioxidantation；spleen

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0366-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.066

2015-01-16

劉功成（1988-），男，碩士研究生，研究方向：分子生物物理學(xué)，E-mail：liugongcheng@126.com。

曾憲垠（1966-），男，博士，研究員，研究方向：動(dòng)物生理與生殖免疫調(diào)控，E-mail：xyzeng1966@163.com。