石榴皮多酚對(duì)糖尿病小鼠腎臟抗氧化防御功能的影響

唐遠(yuǎn)謀，許麗佳，蔣衛(wèi)東，李　尊

（1.成都大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川成都610106；2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065；3.成都大學(xué)，四川成都610106）

石榴皮多酚對(duì)糖尿病小鼠腎臟抗氧化防御功能的影響

唐遠(yuǎn)謀1，2，許麗佳3，蔣衛(wèi)東3，李尊3

（1.成都大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川成都610106；2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065；3.成都大學(xué)，四川成都610106）

探究石榴皮多酚對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠輔助調(diào)節(jié)血糖功能及腎臟抗氧化能力的影響。用低、中、高劑量的石榴皮多酚灌胃糖尿病小鼠6周后，觀(guān)察其血糖、體重變化和腎臟的抗氧化能力變化。結(jié)果表明：石榴皮多酚能有效的降低糖尿病小鼠的血糖濃度，體重相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；石榴皮多酚組小鼠與糖尿病組比較，MDA含量、NO含量和GSH-Px水平降低，CAT和GSH含量增加，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05或p＜0.01），表明石榴皮多酚能提高糖尿病小鼠腎臟抗氧化酶的活性，減少糖尿病小鼠腎臟組織的氧化應(yīng)激；而石榴皮多酚組小鼠與糖尿病組比較，NOS含量、SOD含量和GST含量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。石榴皮多酚具有輔助調(diào)節(jié)糖尿病小鼠血糖功能和減少其腎臟組織的氧化應(yīng)激，增強(qiáng)腎臟的抗氧化能力。

石榴皮，多酚，糖尿病小鼠，腎臟，抗氧化

石榴皮多酚是一類(lèi)具有多酚羥基化合物的總稱(chēng)，存在游離態(tài)和結(jié)合態(tài)［1］，富含安石榴苷、鞣花酸、綠原酸、槲皮素和表兒茶素等多種有機(jī)化合物，因其結(jié)構(gòu)中的共軛不飽和鍵及酚羥基賦予其一系列的化學(xué)性質(zhì)，如具有還原性和捕獲自由基的特性、能與蛋白質(zhì)結(jié)合抑制自由基催化酶的活性等，使多酚類(lèi)物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性。在體外，石榴皮多酚的抗氧化作用主要體現(xiàn)為清除常見(jiàn)的自由基［2-4］、抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用［5］等。

自由基生物學(xué)和醫(yī)學(xué)是近幾十年迅速發(fā)展起來(lái)的新興學(xué)科，人體內(nèi)自由基產(chǎn)生過(guò)多或清除過(guò)少，就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激造成對(duì)組織的傷害，如介導(dǎo)細(xì)胞物質(zhì)的損傷，引起癌癥、心血管疾病、局部缺血/再灌輸損傷、炎癥、糖尿病、神經(jīng)性病變和衰老等各種疾病的發(fā)生和惡化。研究表明，在糖尿病及其并發(fā)癥中，由于氧化應(yīng)激帶來(lái)的臟器損傷可能是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制的主要通道［6］，氧化應(yīng)激可能影響清除自由基的各種抗氧化酶的活性及表達(dá)，致使體內(nèi)自由基水平升高，從而損傷腎臟組織［7］，糖尿病腎臟病變是其最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。石榴皮提取物能減少機(jī)體的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化作用，增加某些抗氧化酶活性，對(duì)糖尿病具有一定的輔助治療作用［8］，而關(guān)于石榴皮多酚對(duì)糖尿病腎臟抗氧化防御作用尚未見(jiàn)報(bào)道。由此，本文通過(guò)研究石榴皮多酚對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠輔助調(diào)節(jié)血糖作用及其腎臟抗氧化防御能力的影響，為石榴皮作為一種天然抗氧化劑和糖尿病輔助調(diào)節(jié)劑提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

清潔健康屏蔽級(jí)雄性昆明種小鼠4周齡左右，體重約為28～30 g左右，具備合格證號(hào)（醫(yī)動(dòng)字第24101106號(hào)）；石榴皮成都中藥飲片公司；鏈脲佐菌素Streptozotocin（STZ）美國(guó)Sigma公司；丙二醛MDA試劑盒、超氧化物歧化酶SOD試劑盒、過(guò)氧化氫酶CAT試劑盒、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶GST試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GSH-Px試劑盒、谷胱甘肽GSH試劑盒、一氧化氮NO試劑盒、一氧化氮合酶NOS試劑盒、組織蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒南京建成生物研究所；其他試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用試劑，分析純，成都科龍化工試劑廠(chǎng)，均在實(shí)驗(yàn)前新鮮配制。

GT-1640型血糖測(cè)試儀、GLUCOCARD II型血糖試紙日本京都公司；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)；冷凍低溫離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司；UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海尤尼柯儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1石榴皮多酚的制備參照蒲博等［9］的實(shí)驗(yàn)方法制備石榴皮多酚，石榴皮干燥粉粹，過(guò)80～100目篩，采用微波輔助提取，以水為提取溶劑，料液比為1∶30（g/mL），提取溫度為75℃，提取時(shí)間為140 s，得到的提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，冷凍干燥得石榴皮粗提取物，此時(shí)，石榴皮多酚含量為49.31%。而后采用D101大孔樹(shù)脂進(jìn)行石榴皮多酚的純化，石榴皮溶液進(jìn)柱質(zhì)量濃度為10 mg/mL，流速為2 BV/h，清洗用水5 BV，乙醇洗脫劑的體積分?jǐn)?shù)為70%，用量為5.5 BV；純化后石榴皮多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.64%。

1.2.2實(shí)驗(yàn)小鼠的分組及處理清潔健康屏蔽級(jí)雄性昆明種小鼠（mus musculus，4周齡左右），適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，選取體重為28～30 g左右的小鼠，飲水不限，禁食12 h后按照體重75 mg/kg腹腔注射1%的鏈脲佐菌素（STZ），2 d后再加強(qiáng)注射1次，注射后小鼠自由進(jìn)食，飲水不限，5 d后測(cè)其體重，空腹取尾血測(cè)其血糖值，血糖濃度大于10 mmol/L的確定為糖尿病小鼠［10］，同時(shí)用正常小鼠做對(duì)照。

將糖尿病模型小鼠按照空腹血糖水平和體重隨機(jī)分成4組，分別為糖尿病模型組（DM組）、模型+石榴皮多酚低劑量組（DM+L）、模型+石榴皮多酚中劑量組（DM+M）、模型+石榴皮多酚高劑量組（DM+H），每組8只，同時(shí)用正常小鼠做對(duì)照（NC組，8只）。石榴皮多酚低、中和高劑量組動(dòng)物分別按各自體重以0.2、0.4、0.8 g/kg灌胃石榴皮多酚，糖尿病模型組和對(duì)照組（NC）按體重給予蒸餾水（20 mL/kg）灌胃，每天1次。

1.2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)環(huán)境所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水，動(dòng)物室內(nèi)凈化空氣流動(dòng)換氣，房間溫度保持在20～28℃，濕度控制在50%～70%，明暗時(shí)間各12 h。

1.2.4觀(guān)察指標(biāo)及測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每周稱(chēng)重，用血糖試紙檢測(cè)空腹血糖值，連續(xù)給藥28 d后，稱(chēng)重，測(cè)定空腹血糖濃度。第6周末斷頸處死動(dòng)物，稱(chēng)取部分腎臟組織，加冷的生理鹽水，冰浴條件下，制成10%的組織勻漿，4℃下3000 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒上的檢測(cè)方法測(cè)定不同組別小鼠腎臟MDA、SOD、CAT、GST、GSH-Px、GSH、NO、NOS及組織蛋白質(zhì)水平。

表1　各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血糖及體重情況比較（±s）Table 1　The comparison of different blood glucose and weight in each group（±s）

表1　各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血糖及體重情況比較（±s）Table 1　The comparison of different blood glucose and weight in each group（±s）

注：與DM相比，*p＜0.05，**p＜0.01；表2、表3同。

組別　n　　初期血糖濃度（mmol/L）　　末期血糖濃度（mmol/L）　　初期體重（g）　　末期體重（g）NC　8　6.66±0.67**　7.48±0.69**　29.79±2.21　39.64±2.94 DM　8　23.55±3.47　27.01±2.87　29.36±2.12　32.69±2.74 DM+L　8　20.86±2.91　21.02±2.75　29.50±1.76　33.61±2.10 DM+M　8　21.51±2.81　21.26±1.16*　29.88±2.60　34.03±2.41 DM+H　8　22.00±4.39　18.88±1.28*　29.74±2.08　34.13±2.52

2　結(jié)果與分析

2.1各組小鼠血糖及體重情況比較

由表1可知，與DM組比較，石榴皮多酚組初期血糖濃度無(wú)差異，NC組血糖明顯較低，與DM組相比有極顯著差異（p＜0.01）。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诟鹘M小鼠血糖濃度，與DM組比較，石榴皮多酚組均降低，其中石榴皮中劑量組和高劑量組小鼠血糖有顯著差異（p＜0.05），說(shuō)明石榴皮多酚具有輔助降低糖尿病小鼠血糖的作用。實(shí)驗(yàn)初期，各組小鼠體重?zé)o差異；實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，與NC組相比，DM組和石榴皮多酚組小鼠體重降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。石榴皮多酚小鼠體重均比DM組高，但二者相比也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。

2.2石榴皮多酚對(duì)糖尿病小鼠腎臟MDA、SOD、CAT、GST的影響

由表2可知，與DM組比較，石榴皮多酚組小鼠MDA含量明顯降低，與DM組比較，均具有極顯著差異（p＜0.01）；石榴皮多酚組小鼠CAT含量增加，其中中劑量組和高劑量組與DM組比較，均有顯著差異（p＜0.05），說(shuō)明石榴皮多酚能有效減少糖尿病小鼠腎臟組織的氧化應(yīng)激；與DM組比較，石榴皮多酚組小鼠SOD含量均有所增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；其GST含量的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。

2.3石榴皮多酚對(duì)糖尿病小鼠腎臟GSH-Px、GSH、NO、NOS的影響

由表3可知，與DM組比較，石榴皮多酚組小鼠GSH含量明顯增加，石榴皮多酚劑量組GSH水平與DM組比較均有極顯著差異（p＜0.01）；石榴皮多酚組小鼠GSH-Px和NO含量明顯減少，石榴皮多酚高劑量組GSH-Px水平與DM組比較有顯著差異（p＜0.05）；與DM組比較，石榴皮多酚中劑量組和高劑量組NO含量均有極顯著差異（p＜0.01），說(shuō)明石榴皮多酚能有效的減少糖尿病小鼠腎臟組織的氧化應(yīng)激；而石榴皮多酚組小鼠NOS含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2　石榴皮多酚對(duì)糖尿病小鼠腎臟MDA、SOD、CAT、GST的影響（±s）Table 2　Effect of pomegranate peel polyphenol on the MDA、SOD、CAT、GST in kidney of diabetic mice（±s）

表2　石榴皮多酚對(duì)糖尿病小鼠腎臟MDA、SOD、CAT、GST的影響（±s）Table 2　Effect of pomegranate peel polyphenol on the MDA、SOD、CAT、GST in kidney of diabetic mice（±s）

組別　n　MDA含量（nmol/mg prot）　SOD含量（U/mg prot）　CAT含量（U/g prot）　GST含量（μmol/g prot）NC　8　0.88±0.56**　97.64±14.39*　384.84±29.90**　0.33±0.98 DM　8　1.66±0.13　53.26±9.00　224.32±15.54　0.20±0.09 DM+L　8　1.11±0.05**　63.81±8.23　236.64±25.59　0.24±0.07 DM+M　8　1.03±0.04**　66.53±11.72　265.04±7.02*　0.14±0.07 DM+H　8　0.95±0.38**　62.59±6.64　261.92±6.83*　0.19±0.06

表3　石榴皮多酚對(duì)糖尿病小鼠腎臟GSH-Px、GSH、NO、NOS的影響（±s）Table 3　Effect of pomegranate peel polyphenol on the GSH-Px、GSH、NO、NOS in kidney of diabetic mice（±s）

表3　石榴皮多酚對(duì)糖尿病小鼠腎臟GSH-Px、GSH、NO、NOS的影響（±s）Table 3　Effect of pomegranate peel polyphenol on the GSH-Px、GSH、NO、NOS in kidney of diabetic mice（±s）

組別　n　GSH-Px（U/g prot）　GSH（mg/g prot）　NO（μmol/g prot）　NOS（U/mg prot）NC　8　52.99±8.62*　18.79±4.41*　0.87±0.13*　0.61±0.16* DM　8　83.71±3.31　9.26±1.66　1.65±0.23　0.32±0.13 DM+L　8　72.56±5.34　16.73±4.42**　1.55±0.18　0.26±0.10 DM+M　8　75.27±6.61　20.73±5.14**　1.45±0.11**　0.36±0.07 DM+H　8　62.59±7.25*　19.33±4.28**　1.40±0.13**　0.31±0.10

3　討論與結(jié)論

糖尿病是一種常見(jiàn)的慢性代謝紊亂性疾病，由于其長(zhǎng)期的高血糖引發(fā)機(jī)體心、肝、腎、眼、神經(jīng)等多種器官并發(fā)癥，其中糖尿病腎病是最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致患者死亡的主要原因［11］。糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展與機(jī)體自由基引發(fā)的氧化損傷和機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)清除自由基能力的失衡密切相關(guān)［12］。科學(xué)研究中，STZ的注入可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胰島β細(xì)胞嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致胰島素分泌不足，促使血糖升高［13］。本實(shí)驗(yàn)中，STZ誘導(dǎo)的DM組初期血糖濃度達(dá)（23.55±3.47）mmol/L，可認(rèn)為成功誘導(dǎo)成糖尿病小鼠模型。STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中，其組織多個(gè)器官均出現(xiàn)氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是指機(jī)體反應(yīng)性氧生成的增加或清除降低，過(guò)量的自由基水平升高，引起細(xì)胞和機(jī)體的損傷，其在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型鼠腎組織中糖代謝紊亂及氧化應(yīng)激的存在，腎組織中抗氧化酶發(fā)生糖化或氧化，影響腎組織中抗氧化酶活性及氧化產(chǎn)物的水平，測(cè)定組織中這些指標(biāo)，能間接反映機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平［6，8］。

近來(lái)年，石榴皮多酚由于其具有抗氧化、抗癌、抗菌、降血脂等多種生物學(xué)功能，引起了廣大科研者的興趣，已成為目前的研究熱點(diǎn)。歐、美、日等國(guó)家科研工作者對(duì)石榴皮提取物在抗氧化方面展開(kāi)了大量的研究，并已證實(shí)石榴皮提取物具有較高的抗氧化活性，這與石榴皮中富含多酚類(lèi)物質(zhì)直接相關(guān)［14］。Morsy等的研究表明，減少機(jī)體氧化應(yīng)激水平和改善抗氧化系統(tǒng)，可以減輕糖尿病所引起的腎臟損害［15］。李建科等［16］利用灌胃法研究石榴皮多酚對(duì)正常小鼠的血液、肝臟和腦組織中抗氧化指標(biāo)的影響，結(jié)果揭示石榴皮多酚能提高小鼠血液、肝臟及腦組織中SOD活性和小鼠血液、肝臟中CAT活性，降低小鼠血液、肝臟及腦組織中MDA含量。本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察石榴皮多酚對(duì)糖尿病小鼠腎臟氧化應(yīng)激的影響，所選動(dòng)物模型為糖尿病小鼠，與正常實(shí)驗(yàn)中小鼠模型相比，其體內(nèi)氧化應(yīng)激更為明顯［6］，采用石榴皮多酚灌胃糖尿病小鼠，體內(nèi)抗氧化研究目的更為明確。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與DM組比較，石榴皮多酚組小鼠MDA含量降低，CAT含量增加，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05或p＜0.01），這與李建科等［16］對(duì)小白鼠的血液、肝臟和腦組織研究中抗氧化指標(biāo)較為一致；石榴皮多酚組小鼠SOD活性也有所提高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。另外，本實(shí)驗(yàn)中石榴皮多酚組小鼠NO含量和GSH-Px水平降低，GSH含量增加，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05或p＜0.01），說(shuō)明石榴皮多酚提高糖尿病小鼠腎臟的抗氧化應(yīng)激能力，降低腎臟組織氧化損傷，對(duì)減輕糖尿病腎臟損傷具有重要的意義；而石榴皮多酚組小鼠與糖尿病組比較，NOS含量無(wú)明顯變化，但NO含量降低，可能是因?yàn)镹O含量的變化受底物利用度、NOS活性、表達(dá)水平或其他構(gòu)成亞型NOS酶活性共同作用的影響［17］。GST含量也無(wú)明顯變化，可能是因?yàn)镚ST主要存在于肝臟內(nèi)［18］，腎臟中含量甚少所致。

總之，本研究的結(jié)果揭示石榴皮多酚具有輔助調(diào)節(jié)糖尿病小鼠血糖功能和減少其腎臟組織的氧化應(yīng)激，增強(qiáng)腎臟的抗氧化能力。同時(shí)，石榴皮多酚具有輔助調(diào)節(jié)血糖功能，能改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型鼠糖代謝，進(jìn)一步研究可開(kāi)發(fā)成糖尿病輔助調(diào)節(jié)劑保健食品。

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Effect of pomegranate peel polyphenols on kidney antioxidant defense function in diabetic mice

TANG Yuan-mou1，2，XU Li-jia3，JIANG Wei-dong3，LI Zun3
（1.School of Clinical Medical of Chengdu University，Chengdu 610106，China；2.College of Light Industry，Textile and Food Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China；3.School of Chengdu University，Chengdu 610106，China）

The effects of pomegranate peel polyphenols（PPP）on the regulation of blood glucose and kidney antioxidant defense function in diabetic mice（DM）were studied in this paper.The diabetic mice were fed with low，medium，high doses of PPP for 6 weeks，the blood glucose，body weight and the kidney antioxidant ability were observed.The results indicated that the PPP could reduce blood glucose levels effectively in diabetic mice，which with no significant difference in body weight.Compared with the DM group，the MDA，NO and GSH-Px in the PPP fed mice were reduced，the CAT and GSH were increased（p＜0.05 or p＜0.01），but there was no statistical significance in the NOS，SOD and GST of the PPP fed mice（p＞0.05）.The conclusion was that the PPP had the functions of regulating blood glucose and reduced the oxidative stress of kidney in diabetic mice，which strengthened the kidney antioxidant capacity.

pomegranate peel；polyphenols；diabetic mice；kidney；antioxidant

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0370-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.067

2014-11-13

唐遠(yuǎn)謀（1986-），男，博士研究生，講師，研究方向：生物降解與轉(zhuǎn)化，E-mail：tym860320@163.com。

成都大學(xué)校青年基金項(xiàng)目（2014XJZ12）；藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（10Y201404）。