微生物法生產肌醇研究進展

黃貞杰，陳由強

（1.泉州醫(yī)學高等專科學校，福建泉州362010；2.福建師范大學生命科學學院，福建福州350108）

微生物法生產肌醇研究進展

黃貞杰1，陳由強2

（1.泉州醫(yī)學高等?？茖W校，福建泉州362010；2.福建師范大學生命科學學院，福建福州350108）

肌醇是一種具有旋光性及生物活性的環(huán)狀糖醇，具有許多重要的生理活性，廣泛應用于醫(yī)藥、食品及飼料等行業(yè)。利用微生物法生產肌醇具有很好的應用前景。文中介紹了肌醇的功能，綜述了肌醇的微生物酶解法和發(fā)酵法生產的研究進展，并對其前景進行了展望。

肌醇，發(fā)酵，微生物催化，釀酒酵母，研究進展

肌醇（inositol）又稱環(huán)己六醇，分子式為C6H12O6，相對分子量是180.16，其外觀為白色結晶粉末，味微甜，易溶于水，微溶于乙醇、冰乙酸、乙二醇、甘油；不溶于氯仿、乙醚等有機溶劑。肌醇在理論上有9種可能的異構體（圖1），都為葡萄糖的同分異構體。通常在自然界中發(fā)現(xiàn)的有4種，分別稱為肌肉肌醇（myoinositol）、D-手性肌醇（D-chiro-inositol）、L-手性肌醇（L-chiro-inositol）和鯊肌醇（scyllo-inositol），廣泛存在的為肌肉肌醇（myo-inositol）。

隨著肌醇的新用途不斷被開發(fā)，市場需求旺盛，肌醇已成為國際市場上緊俏的醫(yī)藥化工和保健產品之一。2013年全球醫(yī)藥級肌醇年需求量達4000余噸，我國是肌醇生產和出口大國，2012年，我國肌醇出口量達4156 t，同比增加19.58%。

肌醇的傳統(tǒng)生產方法可分為水解提取法和化學合成法。目前普遍使用加壓水解法，以脫脂米糠為主要原料生產肌醇，從米糠或麩皮中提取出植酸鈣，再加壓水解制得肌醇，植酸鹽水解后肌醇得率一般在10%左右，肌醇產率約為1%，但由于肌醇的提取要經過浸提制備植酸鹽、植酸鹽水解為肌醇及其溶液的制備等過程，而這些過程中需要耐酸設備，且存在制備過程復雜，生產投入高，污染環(huán)境等缺點。這與現(xiàn)代化學工業(yè)的發(fā)展趨勢矛盾。所以肌醇供求之間的矛盾必須通過其他有效途徑來解決，而用微生物發(fā)酵法生產肌醇正是解決這一矛盾的途徑。以下介紹了肌醇的生物活性作用，歸納了國內外關于肌醇的微生物法生產的研究進展。

圖1　肌醇九種異構體的分子結構式Fig.1　The structures of nine isomers of inositol

1　肌醇生物活性概述

肌醇存在于動植物、微生物體內，具有諸多生理功能，是動物、微生物的生長因子，是細胞膜的組成成分之一，在膜磷脂平衡中扮演著重要的角色。它不僅是胞內第二信使磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）合成的前體，而且對與磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰膽堿（PC）和心磷脂（CL）合成有關的酶類的表達具有調控作用［1］，在鈣平衡和信號傳遞方面起到重要作用［2］，并能夠保持腦細胞的結構完整［3］。1928年Eastcott從生物活素中提成了純凈態(tài)的肌醇，并首次發(fā)現(xiàn)其為酵母菌生長因子［4］。此后，人們對肌醇的生理藥理活性及應用作了更深入的研究。

1.1醫(yī)藥領域

在醫(yī)藥領域中，由于肌醇有類似維生素B1和生物素的功能，作為“生物活素”參與體內的新陳代謝活動，具有促進細胞生長、預防和治療某些疾病等多種作用。因此臨床上肌醇可直接被制成肌醇片，作為藥物輔助治療精神及神經性疾?。?］、維生素缺乏癥、血管硬化、糖尿病、肝硬化等多種疾病。肌醇濃度還被證實與新生兒腦病、阿爾茨海默病、唐氏綜合癥等持續(xù)性神經功能障礙有關［6］。另外，以肌醇為藥物中間體制得的肌醇硒酸酯、氟代肌醇、脈通、煙酸肌醇酯等藥物在治療動脈硬化、糖尿病、膽固醇過高癥、癌癥等方面有很好的療效［7］。Nishino等［8］研究報道口服肌醇對肺癌和肝癌有抑制作用。肌醇的甲基衍生物，如松醇、紅杉醇等同樣具有降血糖的作用［9］。另外，肌醇在胰島素的信號傳遞中發(fā)揮著重要作用，可用于糖尿病的治療［10］。對于糖尿病的治療起作用的主要是D-手性-肌醇（DCI）。Xia等［11］以富含DCI的蕎麥和苦瓜治療糖尿病大鼠，效果顯著。人類缺硒可導致癌癥、心血管疾病并加速衰老，而肌醇硒酸酯可用于制備富硒的抗癌藥物、食品。肌醇還可改善PCOS（多囊卵巢綜合癥）女性的胰島素敏感性和排卵功能，治療婦女代謝綜合癥［12-14］。通過補充肌肉肌醇和D-手性-肌醇（DCI）都可以治療PCOS，且它們屬于不同的信號通路，Unfer V等［15］比較了肌肉肌醇和DCI對患PCOS的不育婦女的治療效果，發(fā)現(xiàn)服用肌肉肌醇組有更好更多的成熟卵子，懷孕的人數(shù)也比服用DCI的更多。Nordio M等用復合的DCI和肌肉肌醇以及單一的肌肉肌醇治療超重的PCOS患者，三個月后復合肌醇組更有效果，降低了患代謝綜合癥的風險［16］。

1.2食品領域

在食品領域，肌醇常作為營養(yǎng)強化劑，美國1987年就推薦含奶嬰兒食品中應加入一定量肌醇。90年代，人們發(fā)現(xiàn)肌醇可與L-肉毒堿結合使用，可使脂肪很快轉化為熱能消耗掉，防止脂肪在人體內特別是心血管內沉積，具有減肥功效［17］。肌醇還具有抗氧化、抗衰老、抗炎功能，DCI和其他的抗氧化物不同，主要對超氧陰離子（·O2-），過氧化氫和羥自由基（·OH）表現(xiàn)出更高的抗氧化活性［18］。

1.3飼料工業(yè)領域

在飼料工業(yè)領域，肌醇主要作為生物促進劑。飼料中加入肌醇，可促進牲畜生長和防止出現(xiàn)毛發(fā)脫落及體內生理活動失去平衡等癥狀。在對蝦及魚類干飼料中，肌醇添加量通常為300～500 mg/kg。否則將發(fā)生肌醇缺乏癥，癥狀為食欲不振、飼料轉化率降低、生長停滯。Hada B等發(fā)現(xiàn)向果蠅飼料里添加DCI和松醇，與對照組相比，通過激活S6K和JKN通路，增加了轉錄因子dFOXO的核定位，最終表現(xiàn)為延長果蠅的壽命［19］。

2　微生物酶催化法產肌醇

微生物酶催化法產肌醇主要是應用微生物產生的植酸酶（phytase）和磷酸酯酶（phosphotase），將植酸及其菲丁水解轉化為肌醇的方法。一般植酸鹽在植酸酶作用下分解為肌醇-2-磷酸，然后肌醇-2-磷酸進一步在磷酸酯酶作用下生成肌醇。另外，也發(fā)現(xiàn)能將植酸直接水解成肌醇的植酸酶。因此，通過篩選等手段獲得大量表達植酸酶和磷酸酯酶的菌種產肌醇；或分離出能將植酸直接水解成肌醇的植酸酶，成為微生物酶催化法產肌醇的途徑。由于酶的反應條件比較溫和，可在常溫常壓下進行，利用酶催化法生產肌醇，能夠提高產品得率、降低生產成本，能耗低、環(huán)境友好，是肌醇生產發(fā)展新趨勢。

2.1植酸酶產生菌

植酸酶屬磷酸單酯水解酶，能夠依次分離植酸分子中的磷，將植酸（鹽）降解為肌醇和無機磷，同時釋放出與植酸（鹽）結合的其他營養(yǎng)物質。植酸酶來源于天然，一種存在于植物體、真菌和細菌中，另一種存在于植物的貯藏器官（如種子、塊莖）中。在產植酸酶的微生物中，特別值得一提的有：黑曲霉（A.niger）、米曲霉（A.oryzoe）、青霉（Penicillium）、毛霉（Mucor）和少孢根霉（Rhizopcos.oligorporus）等真菌；細菌：假單胞菌（Pseudomonassp.）、克雷白桿菌（Klebsiella sp.）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）；酵母：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、熱帶假絲酵母（Candidatropicalis）、球擬酵母（Torulopsis Candida）、漢氏德巴利氏酵母（Debaryomycescastellii）、脆 壁 克 魯 維 酵 母（Kluyveromyces fragilis）等能分泌相對多量的植酸酶。但一般天然植酸酶產生菌菌株生產植酸酶的量較低，每毫升發(fā)酵液只有100～500單位（100～500 U/mL）。中國農業(yè)科學院飼料研究所姚斌研究員小組與生物技術研究中心范云六院士小組經過幾年的努力采用基因工程技術建構的“工程畢赤酵母”（Pichia pastoris），表達的植酸酶能分泌到培養(yǎng)基中，表達產物穩(wěn)定，與天然植酸酶在酶學性質上沒有差異，具有正常的生物學活性，大大提高酶的產率，經5 L發(fā)酵罐實驗，產量達到15000單位/毫升（約每毫升發(fā)酵液收獲5 mg植酸酶蛋白），比原植酸酶產生菌（Aspergillus niger-963）的產量高3000倍以上；比國外報道的“工程菌”（P.pastoris）植酸酶產量高約37倍［20-21］。2010年Gunashree等［22］利用原生質體融合技術提高了菌株植酸酶的活力，固體發(fā)酵培養(yǎng)6～7 d，可達到最大酶活產量為126.2 U/gds。為獲得在低溫環(huán)境中生長良好的植酸酶產生菌，張慶芳等［23］對微生物發(fā)酵生產低溫植酸酶進行研究，將產生植酸酶的微生物逐級低溫馴化后在12～18℃逐級擴大培養(yǎng)，低溫發(fā)酵結束后分離純化植酸酶。低溫植酸酶具有低溫高催化活力和高催化效率；能縮短加工過程的時間并節(jié)省了昂貴的加熱或冷卻費用；在節(jié)能方面具有相當大的優(yōu)勢。

2.2植酸酶和磷酸酯酶催化產肌醇

自然界分離到的能同時分泌植酸酶和磷酸酯酶的微生物很少，而且產酶能力低，肌醇產率低。無花果曲霉能同時分泌植酸酶（E.C.3.1.3.8）和磷酸酯酶（E.C.3.1.3.2），且這兩種酶均具有底物專一性，王建玲等［24］通過對無花果曲霉（A.ficuum A.s3.324）產生植酸酶和磷酸酯酶的條件進行研究，在確定的最佳條件下，植酸酶和磷酸酯酶活力分別達到5.7、0.533 U/mL。用所得發(fā)酵液水解菲丁制備肌醇，使肌醇的轉化率達10.3%，該轉化率與傳統(tǒng)加壓水解法制備肌醇的轉化率接近。

Xingen Lei等［25］通過核酸定點突變獲得多株曲霉植酸酶突變體，提高了植酸酶活力、熱穩(wěn)定性和適宜pH范圍。隨后克隆了Escherichia coli的植酸酶基因phyA和酸性磷酸酶基因appA，分別構建表達載體，轉化酵母菌獲得重組菌，利用重組菌過表達植酸酶和酸性磷酸酶，通過發(fā)酵玉米、大豆粉、麩皮，使植酸水解轉變?yōu)榧〈己蜔o機單磷酸［26］。

2.3高效表達植酸酶催化產肌醇

目前發(fā)現(xiàn)的絕大部分微生物來源的植酸酶分解植酸鹽形成的終產物均是單磷酸肌醇和無機正磷酸，但Mochizuki等從Schwanniomyces occidentalis中分離出的植酸酶可將植酸鹽分解為肌醇和無機磷酸［21］。Melanie等通過疏水層析從漢氏德巴利氏酵母Debaryomyces castellii分離純化得到能將植酸徹底水解成肌醇的植酸酶，并通過基因重組技術過表達這種酶，所得酶的性質與原酶相同［27-28］。

埃萊娜·布茲等［29］對Debaryomyces castellii CBS 2923植酸酶的生物合成進行研究，克隆該菌株植酸酶基因，進行重組過表達，獲得的重組株分別產生100（PIC株）和10（GAP株）倍高于野生型Debaryomyces castellii CBS 2923株的植酸酶，隨后進行了植酸酶組合對植酸水解的協(xié)同效應研究，將酵母Schwanniomyces castellii的植酸酶或酵母Debaryomyces castellii的植酸酶與黑曲霉Natuphos（AN）的植酸酶等組合，用于將植酸水解為無機單磷酸、較低磷酸化水平的肌醇以及游離的肌醇［30］。Ann-Sofie等［31］通過表達和敲除植酸酶相關基因的方法構建了提高植酸酶活力的釀酒酵母基因工程菌株，可以用于發(fā)酵產肌醇磷脂異構體和肌醇。

生物酶催化在實現(xiàn)綠色化工方面具有許多優(yōu)勢：新型、高效率、周期短、選擇性提高、常溫、常壓。酶的反應條件比較溫和，通過避免使用高溫、高壓，避免金屬和有機溶劑的大量消耗，來大大降低單位產品的廢物產生量。由此可見，利用生物酶催化的方法生產肌醇是必要的，具有很好的應用前景。

3　微生物發(fā)酵法產肌醇

3.1自然選育與誘變菌株發(fā)酵產肌醇

微生物發(fā)酵法生產肌醇，主要以混合糖類合成培養(yǎng)基為原料，以釀酒酵母或假絲酵母等為主要生產菌，經一二級發(fā)酵分泌肌醇到發(fā)酵液中，再對發(fā)酵液進行處理，經純化、濃縮、結晶最后得到高純度的肌醇。

早期日本的shirai M團隊對選育產肌醇菌株做了重要的研究，通過誘變選育出3種突變株，其中對葡萄糖代謝拮抗物有抗性的假絲酵母DGR1-14（FERM P-1439或FERMBP-5070等菌種），通氣發(fā)酵34～96 h，肌醇產量在0.4～3 g/L［32-33］。白井真等［34］通過以誘變獲得的博伊丁假絲酵母IP-2發(fā)酵培養(yǎng)向細胞外分泌肌醇，可在細胞外積累1.5 L的肌醇。勾秋芬等［35］研究利用釀酒酵母對苦蕎粉進行發(fā)酵，提高D-手性肌醇含量。正交優(yōu)化及其驗證實驗表明最佳發(fā)酵條件組合是溫度為28℃，發(fā)酵時間為34 h，pH為5.5，料液比為1∶10；D-手性肌醇平均含量可以達到1.82%。

此外，也有研究利用黑曲霉發(fā)酵制取肌醇。劉曉永等［36］以麩皮為原料利用黑曲霉WS-65進行固態(tài)發(fā)酵制取肌醇，優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件下的最高肌醇產量為55 mg/100mL。歐仕益等對利用黑曲霉發(fā)酵麥麩制備阿魏酸、肌醇和低聚糖進行了初步研究，結果表明，黑曲霉能部分釋放麥麩膳食纖維上所束縛的阿魏酸，并將多糖和植酸分別水解成低聚糖和肌醇。不過，由于黑曲酶在釋放這些物質的同時又將它們作為營養(yǎng)源，因此，利用黑曲霉直接發(fā)酵麥麩生產這三種物質是不經濟的，而利用它們產生的酶來生產阿魏酸、肌醇和低聚糖可能是更好的選擇［37］。

3.2基因工程菌發(fā)酵產肌醇

近幾十年來細胞生物學的研究不斷深入，使得酵母菌的肌醇代謝途徑已基本明晰。自然選育的菌株肌醇產率通常較低，因此，采用基因工程和代謝工程技術，針對具有清晰基因組信息以及成熟基因操作工具的酵母菌以及大腸桿菌等菌株進行改造，以獲得高效肌醇生產菌株。主要表現(xiàn)在兩個方面：利用基因高效表達和基因敲除技術改造酵母菌；產肌醇大腸桿菌工程菌的構建。

酵母從葡萄糖開始合成肌醇的生物合成與代謝途徑見圖2［38］。在肌醇的合成過程中，肌醇-3-磷酸合成酶是關鍵酶，該酶的表達受到其產物肌醇的反饋抑制，野生菌株中肌醇-3-磷酸合成酶只在對數(shù)期或缺少肌醇的情況下表達。編碼該酶的基因為ino1，該基因已從酵母菌中克隆得到，并進行了序列分析［39］。ino1基因是酵母中受控制最嚴格的基因之一，Ino1′轉錄子是細胞內轉錄裝置缺陷的敏感元件，如破壞TATA結合蛋白或敲除普遍性轉錄因子TFIIA，都會影響Ino1的激活，導致肌醇營養(yǎng)缺陷體的出現(xiàn)［40］。對ino1基因啟動子的研究發(fā)現(xiàn)，在其基因的啟動子的上游存在一些重復序列，稱之作UASINO元件。有研究［41］指出UASINO是對肌醇敏感的序列，如果培養(yǎng)基中含有肌醇，它會被激活而影響ino1的表達，酵母細胞中的肌醇-3-磷酸合成酶便受到阻遏，酶活力下降，細胞中的肌醇合成停止。ino1的表達需要轉錄激活物Ino2p和Ino4p結合到UASINO元件上，ino2和ino4基因編碼基本的螺旋-環(huán)-螺旋蛋白（basic helix-loop-helixproteins）作為異質二聚體結合在UASINO元件上［42］。J Anthony Graves和Susan A Henry［43］研究發(fā)現(xiàn)ino2或ino4基因缺陷菌株，不能在缺少肌醇的培養(yǎng)基中生長。在含有限肌醇的液體培養(yǎng)基里，opi1、ino4基因缺陷菌株Ino1的表達量要比對照菌株高，但在含有足量肌醇的培養(yǎng)基中生長，Ino1的表達就會受到抑制，因此研究表明Opi1p、Sin3p、和Ino2p/Ino4p復合體會影響Ino1表達的總體水平，但與Ino1對肌醇的反饋應答無關。Rundlett等研究發(fā)現(xiàn)，ume6和rpd3是Ino1的負轉錄調控基因，RPD3是一種組蛋白去乙?；福瑀pd3缺陷菌株Ino1的表達量是野生菌的32倍［44］。Yina Wang等研究分析了新生隱球菌肌醇轉運蛋白基因itr，結果表明itr1a和itr3c是10個候選基因中唯一的兩個itr基因，它們能夠彌補釀酒酵母肌醇轉運蛋白缺陷株的生長。異源表達itr1a或itr3c的釀酒酵母菌株表現(xiàn)出高的肌醇吸收活力，說明Itr1a、Itr3c是主要的肌醇轉運蛋白，因此肌醇的吸收和生物合成途徑對肌醇生成都是極其重要的［45］。Ye C等［46］研究發(fā)現(xiàn)ino1的轉錄受肌醇焦磷酸合成的調控，并提出通過調整肌醇焦磷酸激酶的編碼基因kcs1來合成肌醇焦磷酸，從而調控ino1的轉錄。在早期，shirai M團隊通過以利用葡萄糖為誘導物的啟動子，將釀酒酵母的磷酸酶基因和假絲酵母的肌醇-1-磷酸合成酶基因在假絲酵母中過表達來生產肌醇［47］。Justin AM等在Escherichia coli中過表達擬南芥的磷脂酰肌醇合成酶1，從而發(fā)酵制取肌醇［48］。張厚程等［1］用含有肌醇合成的關鍵酶基因ino1的兩不同質粒對肌醇營養(yǎng)缺陷型粟酒裂殖酵母菌進行轉化，得到兩株肌醇合成能力有巨大差異的菌株。

圖2　酵母肌醇的生物合成與代謝途徑Fig.2　The flow chart of biosynthesis and metabolism of myo-inositol in yeast

以上研究表明，為提高肌醇的高效合成，通過調控肌醇生物合成與代謝途徑中相關基因的表達是非常必要的，特別是肌醇合成過程中的關鍵酶基因ino1。通過基因工程技術直接或間接的調控肌醇合成酶基因的表達，構建高效表達ino1基因的肌醇基因工程菌，從而提高肌醇的產量，為微生物發(fā)酵法產肌醇奠定基礎。

另一方面，Breenberg等采用遺傳工程方法研究揭示了，S.cerevisiaes中至少存在opi1、opi2、opi4三個基因位點，這些基因對肌醇的生物合成關鍵酶的合成起阻遏作用，它們之間及與肌醇合成關鍵酶基因ino1互不連鎖［38］。隨后，White和Henry采用基因工程技術發(fā)現(xiàn)并證明了opi1是磷脂生物合成的一個負調控基因，它編碼的蛋白質是肌醇生物合成的一個負調節(jié)子，Ashburner的研究也指出，opi1基因表達產物是肌醇應答的主要靶目標，能夠抑制Ino2轉錄子決定靶基因的表達程度；在包含gal1-ino2的菌株中，通過敲除opi1基因能夠解除肌醇對目標基因表達的影響［49］。在諸多研究的基礎上，White等通過敲除opi1基因位點獲得了能多產肌醇的基因工程菌YS2（ATCC-74033）等［50］。A grawal.P等［51］利用敲除了opi1基因的野生S.cerrevisae，即基因工程菌YS2（ATCC-74033）和YS3（ATCC-74034）進行發(fā)酵產肌醇。采用含葡萄糖100 g/L、硫酸銨作為氮源的合成營養(yǎng)培養(yǎng)基進行發(fā)酵，肌醇產率是單糖發(fā)酵液中肌醇濃度的10倍。利用杏仁殼浸漬汁的物料進行連續(xù)發(fā)酵實驗，發(fā)酵結束后肌醇含量達9 g/L（接近或超過了化學提取法水平），使肌醇濃度提高50%。從實驗結果分析知，因培養(yǎng)基不同，其發(fā)酵類型表現(xiàn)為一、二型發(fā)酵，較高濃度的葡萄糖對肌醇產生有抑制作用。該團隊隨后研究［52］，發(fā)現(xiàn)了一種從糖類混合發(fā)酵液中純化肌醇的方法。方法中采用不優(yōu)先利用肌醇作為碳源的野生S.cerrevisae（DD2、aDD2）對含糖、肌醇、山梨醇等不同成分的培養(yǎng)基進行發(fā)酵，發(fā)酵后除山梨醇仍有小部分剩余外，其他糖類物質均在38 h內被完全轉化。經DD2、aDD2發(fā)酵處理過的肌醇發(fā)酵液再濃縮結晶后得到了高純度的肌醇結晶產品。因此，加大對培養(yǎng)基等發(fā)酵條件和發(fā)酵液后處理的研究，有利于目標產物肌醇的積累和分離純化，提高肌醇生產效益。

2013年日本再次公布了多篇關于微生物法生產肌醇方面研究的相關專利。KONISHI Kazunobu［53］團隊利用基因重組技術結合使用合成生物學技術，對不具有內源肌醇生物合成途徑的大腸桿菌進行重組改造，得到能夠生產肌醇和肌醇衍生物（1-4-O-β-D-吡喃葡萄糖基-肌-肌醇）的工程菌株，分別是AKC-018菌株和AKC-016-G22菌株。AKC-018菌株在含30 g/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基中發(fā)酵23.5 h，肌醇產量為1.84 g/L。該團隊還研究提供了一步法發(fā)酵生產鯊肌醇的方法，通過構建含有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酶基因、肌肌醇脫氫酶基因、鯊肌醇脫氫酶基因的重組菌株，該菌株在合成培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)68 h后，分離發(fā)酵液上清液，HPLC檢測結果顯示，鯊肌醇含量量高達12.4 g/L［54］。SEMBA Hisashi等［55］通過降低糖酵解酶的活性，高表達肌醇合成酶基因，獲得高產肌醇的釀酒酵母突變株，通氣發(fā)酵培養(yǎng)31.5 h，檢測結果肌醇產量為4.0 g/（L·day）。

此外，Yamaoka M等［56］報道，枯草芽孢桿菌能夠代謝合成肌醇，包括肌肌醇、D-手性肌醇、鯊肌醇等。Kosei Tanaka等［57］研究進一步提高枯草芽孢桿菌內鯊肌醇轉化效率。通過在已敲除相關基因的枯草芽孢桿菌MYI04細胞內過表達肌醇轉化為鯊肌醇代謝途徑中的關鍵酶基因iolG、iolW，工程菌在含有2%（w/v）蛋白胨的培養(yǎng)基中發(fā)酵鯊肌醇生產率為10 g/L·48 h以上。

在肌醇基因工程菌研究方面，作者所在課題組已克隆得到釀酒酵母ino1基因序列全長，構建了超表達ino1基因的整合表達載體［58］，轉化釀酒酵母Y01，獲得重組菌。并研究證實肌醇對酵母細胞生長有調控作用，能夠提高釀酒酵母細胞活力，對酵母耐高乙醇起著重要作用，與Hong ME等研究一致［59］。

4　展望

綜上，微生物法生產肌醇，具有巨大的優(yōu)勢和潛力，發(fā)展和應用生物高新技術，用其推動肌醇生產，提高產品純度，逐步降低產品成本，是肌醇生產研究的趨勢。為適應市場多方面的需求，微生物發(fā)酵工程及其產業(yè)化的發(fā)展是必然趨勢，而獲取優(yōu)化的微生物發(fā)酵肌醇產品的關鍵還在于加強選育高產、高效、優(yōu)質的生產菌種，并保持其在生產過程中的穩(wěn)定性和適應性，因此，如何利用基因工程手段獲得高產率的生產菌株和通過發(fā)酵優(yōu)化實現(xiàn)肌醇的高效生產是未來的研究熱點和重點?？梢詮囊韵聨讉€方面著手：利用基因工程技術進一步改造菌種，對肌醇合成途徑的正負調控同時改造，先過表達肌醇合成酶基因ino1，再敲除對肌醇的生物合成起阻遏作用的基因opi1，并敲除用于篩選用的抗生素抗性基因，最終構建安全無毒害的肌醇基因工程菌株，為工業(yè)化生產奠定基礎。選育葡萄糖結構類似物等抗性高產菌株。深入研究肌醇發(fā)酵機理，實行有效代謝調控方案。優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，以廉價非糧生物質為發(fā)酵底物，降低肌醇發(fā)酵生產的底物利用成本，提高生產效益。上述研究成果正是完成肌醇發(fā)酵法工業(yè)化生產的基礎，鞏固已有的研究成果，繼續(xù)探索和創(chuàng)新，微生物法生產肌醇前景廣闊。

［1］張厚程，池振明.INO1基因在粟酒裂殖酵母中的表達及對蔗糖酶分泌和磷脂合成的影響［J］.山東大學學報：理學版，2002，37（6）：544-547.

［2］Divecha N，Irvine RF.Phospholipid signaling［J］.Cell，1995，80（2）：269-278.

［3］Kim H，McGrath BM，Silverstone PH.A review of the possible relevance of inositol and the phosphatidylinositol second messenger system（PI-cycle）to psychiatric disorders-focus on magnetic resonance spectroscopy（MRS） studies［J］.Human Psychopharmacology：Clinical and Experimental，2005，20（5）：309-326.

［4］Nikawa J-I，Tsukagoshi Y，Yamashita S.Isolation and characterization of two distinct myo-inositol transporter genes of Saccharomyces cerevisiae［J］.Journal of Biological Chemistry，1991，266（17）：11184-11191.

［5］Taylor M，Wilder H，Bhagwagar Z，et al.Inositol for depressive disorders［J］.Cochrane Database of Systematic Reviews，2004，2： CD004049.

［6］Haroon E，Watari K，Thomas A，et al.Prefrontal myo-inositol concentrationandvisuospatialfunctioningamongdiabetic depressed patients［J］.Psychiatry Research：Neuroimaging，2009，171（1）：10-19.

［7］Vucenik I，Shamsuddin AM.Cancer inhibition by inositol hexaphosphate（IP6）and inositol：from laboratory to clinic［J］. The Journal of nutrition，2003，133（11）：3778S-3784S.

［8］Nishino H，Murakoshi M，Masuda M，et al.Suppression of lung and liver carcinogenesis in mice by oral administration of myo-inositol［J］.Anticancer research，1998，19（5A）：3663-3664.

［9］舒向榮.紅杉醇等肌醇類物質降血糖作用機制的研究［D］.長沙：中南大學，2009.

［10］Larner J.D-chiro-inositol-its functional role in insulin action and its deficit in insulin resistance［J］.Experimental Diabetes Research，2002，3（1）：47-60.

［11］Xia T，Wang Q.D-chiro-inositol found in Momordica charantia fruit extract plays a role in reducing blood glucose in streptozotocin-diabetic rats［J］.Journal of food biochemistry，2007，31（4）：551-562.

［12］Genazzani AD，Santagni S，Rattighieri E，et al.Modulatory role of D-chiro-inositol（DCI）on LH and insulin secretion in obese PCOS patients［J］.Gynecological Endocrinology，2014，30（6）：438.

［13］Genazzani AD，Santagni S，Ricchieri F，et al.Myo-inositol modulates insulin and luteinizing hormone secretion in normal weight patients with polycystic ovary syndrome［J］.Journal of Obstetrics and Gynaecology Research，2014，40（5）：1353-1360.

［14］Genazzani AD，Prati A，Despini G，et al.PCOS from Lifestyle to the Use of Inositol and Insulin Sensitizers［M］.Frontiers in Gynecological Endocrinology，Springer International Publishing，2014：59-67.

［15］Unfer V，Carlomagno G，Rizzo P，et al.Myo-inositol rather than D-chiro-inositol is able to improve oocyte quality in intracytoplasmic sperm injection cycles.A prospective，controlled，randomizedtrial［J］.EuropeanReviewforMedicaland Pharmacological Sciences，2011，15（4）：452-457.

［16］Nordio M，Proietti E.The combined therapy with myoinositol and D-chiro-inositol reduces the risk of metabolic disease in PCOS overweight patients compared to myo-inositol supplementation alone［J］.European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2012，16（5）：575-581.

［17］張芹，王芳，陳雅蕾.肌醇生產及應用研究進展［J］.中國稻米，2012，18（3）：19-21.

［18］Coballase-Urrutia E，Pedraza-Chaverri J，Camacho-Carranza R，et al.Antioxidant activity of Heterotheca inuloides extracts and of some of its metabolites［J］.Toxicology，2010，276（1）：41-48.

［19］Hada B，Yoo M-R，Seong KM，et al.D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster［J］.The Journals of Gerontology Series A：Biological Sciences and Medical Sciences，2013，68（3）：226-234.

［20］Yao B，Zhang C，Wang J，et al.Recombinant Pichia pastorisoverexpressing bioactive phytase［J］.Science in China Series C：Life Sciences，1998，41（3）：330-336.

［21］姚斌，范云六.植酸酶的分子生物學與基因工程［J］.生物工程學報，2000，16（1）：1-5.

［22］Gunashree B，Venkateswaran G.Enhanced phytase production through interspecific protoplast fusion of Aspergillus niger CFR 335 and Aspergillus ficuum SGA 01 auxotrophic mutants［J］. Enzyme and microbial technology，2010，46（7）：562-567.

［23］張慶芳，遲乃玉，竇少華.微生物發(fā)酵生產低溫植酸酶的方法：CN，102093987 B［P］.2013-5-1.

［24］王建玲，王敏.利用酶法生產肌醇初步研究［J］.天津輕工業(yè)學院學報，1998（2）：15-19.

［25］Xingen L，Edward JM，Abul HJU.Using mutations to improve aspergillus phytases：WO2004024885 A2［P］.2004-3-25.

［26］Xingen L.Overexpression of phytase genes in yeast systems：EP，1090129 B2［P］.2013-5-1.

［27］Ragon M，Aumelas A，Chemardin P，et al.Complete hydrolysis of myo-inositol hexakisphosphate by a novel phytase from Debaryomyces castellii CBS 2923［J］.Applied microbiology and biotechnology，2008，78（1）：47-53.

［28］Ragon M，Neugnot-Roux V，Chemardin P，et al.Molecular gene cloning and overexpression of the phytase from Debaryomyces castellii CBS 2923［J］.Protein expression and purification，2008，58（2）：275-283.

［29］埃萊娜·布茲.卡氏德巴利酵母植酸酶：CN，101263226 B［P］.2011-8-17.

［30］埃萊娜·布茲.植酸酶組合對植酸水解的協(xié)同效應：CN，101258239 B［P］.2012-12-12.

［31］Ann-Sofie S，Tomas A.Saccharomyces cerevisiae yeast strain with improved phytase activity：EP，1495116 B1［P］.2012-5-30.

［32］YUICHIRO N，TORU Y，MAKOTO S.Production of inositol and production of strain resistant to tertiart amine：JP，9117295（A）［P］.1997-05-06.

［33］MAKOTO S，TETSU Y.Process for production of inositol and microorganism used therefore：USP，5618708（A）［P］.1997-04-08.

［34］白井真，米原徹.肌醇的制備方法以及所用微生物：CN，1118006 A［P］.1996-03-06.

［35］勾秋芬.釀酒酵母發(fā)酵對苦蕎中D-手性肌醇含量的影響［D］.成都：四川師范大學，2009.

［36］劉曉永，錢和，楊天寶.黑曲霉WS—65固態(tài)發(fā)酵生產肌醇的研究［J］.飼料工業(yè)，2003，24（11）：41-43.

［37］歐仕益，陳喜德，符莉，等.利用黑曲霉發(fā)酵麥麩制備阿魏酸，肌醇和低聚糖的研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2003（5）：31-32.

［38］劉文寶，金玉坤，游松.肌醇制備方法的現(xiàn)狀與進展［J］.沈陽藥科大學學報，2012，29（3）：234-240.

［39］Klig LS，Antonsson B，Schmid E，et al.Inositol biosynthesis：Candida albicans and Saccharomyces cerevisiae genes share common regulation［J］.Yeast，1991，7（4）：325-336.

［40］Shirra MK，Arndt KM.Evidence for the involvement of the Glc7-Reg1 phosphatase and the Snf1-Snf4 kinase in the regulation of INO1 transcription in Saccharomyces cerevisiae［J］.Genetics，1999，152（1）：73-87.

［41］Kagiwada S，Zen R.Role of the yeast VAP homolog，Scs2p，in INO1 expression and phospholipid metabolism［J］.Journal of Biochemistry，2003，133（4）：515-522.

［42］Ambroziak J，Henry SA.INO2and INO4gene products，positive regulators of phospholipid biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae，form a complex that binds to the INO1 promoter［J］. Journal of Biological Chemistry，1994，269（21）：15344-15349.

［43］Graves JA，Henry SA.Regulation of the yeast INO1 gene：The products of the INO2，INO4and OPI1 regulatory genes are not required for repression in response to inositol［J］.Genetics，2000，154（4）：1485-1495.

［44］Rundlett，Stephen E，Carmen，et al.Transcriptional repression by UME6 involves deacetylation of lysine 5 of histone H4 by RPD3［J］.Nature，1998，392（6678）：831-835.

［45］Wang Y，Liu Tb，Delmas G，et al.Two major inositol transporters and their role in cryptococcal virulence［J］.Eukaryotic cell，2011，10（5）：618-628.

［46］Ye C，Bandara WMS，Greenberg ML.Regulation of inositol metabolismisfine-tunedbyinositolpyrophosphatesin Saccharomyces cerevisiae［J］.Journal of Biological Chemistry，2013，288（34）：24898-24908.

［47］Yonehara T，Shirai M，Kanai S，et al.Promoter DNA of yeast belonging to genus candida having activity in presence of glucose，recombinant DNA containing the same，transformant and production of inositol using the same：JP，1998-271995［P］. 1998-10-13.

［48］Justin A-M，Kader J-C，Collin S.Synthetic capacity of Arabidopsisphosphatidylinositolsynthase1expressedin Escherichia coli［J］.Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Molecular and Cell Biology of Lipids，2003，1634（1）：52-60.

［49］Ashburner BP，Lopes JM.Regulation of yeast phospholipid biosynthetic gene expression in response to inositol involves two superimposedmechanisms［J］.ProceedingsoftheNational Academy of Sciences，1995，92（21）：9722-9726.

［50］Henry SA，White MJ.Inositol-excreting yeast：US，5599701 A［P］.1997-02-04.

［51］AgrawalP.Microbial method of producing inositol：US，5296364［P］.1994-03-22.

［52］AGRAWAL P，Rabinowitz I.Method of purifying cyclitiol：US，5626847 A［P］.1997-05-06.

［53］KONISHI K.Method for producing myo-inositol and myoinositol derivative：WO，2013073483 A9［P］.2013-07-25.

［54］KONISHI K.Method for producing scyllo-inositol：WO，2013115012 A1［P］.2013-08-08.

［55］Hisashi S，Yusuke M.Microorganism producing inositol with high yield，and method for manufacturing inositol by using same：WO，2013125666 A1［P］.2013-08-29.

［56］Yamaoka M，Osawa S，Morinaga T，et al.A cell factory of Bacillus subtilis engineered for the simple bioconversion of myoinositol to scyllo-inositol，a potential therapeutic agent forAlzheimer’s disease［J］.Microbial cell factories，2011，10：69.

［57］Tanaka K，Tajima S，Takenaka S，et al.An improved Bacillus subtilis cell factory for producing scyllo-inositol，a promising therapeutic agent for Alzheimer’s disease［J］.Microbial Cell Factories，2013，12（1）：124.

［58］黃貞杰，陳玲，張積森，等.ScINO1基因克隆及酵母多基因多拷貝整合表達載體的構建［J］.福建師范大學學報：自然科學版，2012，28（6）：100-105.

［59］Hong M-E，Lee K-S，Yu BJ，et al.Identification of gene targets eliciting improved alcohol tolerance in Saccharomyces cerevisiae through inverse metabolic engineering［J］.Journal of Biotechnology，2010，149（1）：52-59.

Advances in microbial production of inositol

HUANG Zhen-jie1，CHEN You-qiang2
（1.Quanzhou Medical College，Quanzhou 362010，China；2.College of Life Sciences，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350108，China）

Inositol，a kind of cyclic sugar alcohol which has optical activity and biological activity，has significant physiological functions and it is widely used in the fields including medicine，food and feed.Microbial production of inositol had broad application potentials.In this article，the functions of inositol，research development of fermentation and microbial enzymatic hydrolysis ways to produce inositol were described.Furthermore，prospect and tendency of microbial production of inositol were addressed.

inositol；fermentation；microbial catalyzing；Saccharomyces cerevisiae；advances

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0384-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.070

2014－10－28

黃貞杰（1987-），男，碩士，助教，研究方向：應用微生物與發(fā)酵技術，E-mail：hzj887@126.com。

福建省醫(yī)藥衛(wèi)生科研人才培養(yǎng)項目資助計劃（2014-1-87）；泉州醫(yī)學高等?？茖W校“國家骨干院校建設”重點資助科研項目（XJ1317）；國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金資助項目（CARS-20-4-4）。