伍城穎,吳啟南,王 紅,樊修和
(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥質(zhì)量研究室,江蘇南京210028;2.中國中醫(yī)科學(xué)院江蘇分院和江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥代謝組研究室,江蘇南京210028;3.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京210023;4.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京210023)
芡種皮多酚提取物體外抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性研究
伍城穎1,2,吳啟南3,4,*,王紅4,樊修和4
(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥質(zhì)量研究室,江蘇南京210028;2.中國中醫(yī)科學(xué)院江蘇分院和江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥代謝組研究室,江蘇南京210028;3.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京210023;4.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京210023)
通過體外實(shí)驗(yàn)研究了芡種皮多酚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的影響,并考察了其對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制動(dòng)力學(xué),研究結(jié)果顯示:芡種皮多酚提取物在體外具有較強(qiáng)的抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的作用(IC50分別相當(dāng)于生藥濃度0.08 mg/mL和0.30 mg/mL),其抑制作用與濃度之間存在量效關(guān)系,二者的抑制類型均為可逆性的競爭性抑制劑。因此,芡種皮具有開發(fā)成輔助降糖的保健食品或藥品的潛力,有很大的利用價(jià)值。
芡種皮,多酚提取物,α-葡萄糖苷酶,α-淀粉酶,抑制活性
芡(Euryale ferox Salisb.)為睡蓮科(Nymphaeaceae)芡屬(Euryale)唯一的種,在中國中部、南部各省均有種植,其主產(chǎn)區(qū)為江蘇、山東、安徽、湖北、湖南等省[1]。芡種皮,又稱芡實(shí)殼,據(jù)《本草綱目》記載,芡實(shí)殼可與芡實(shí)同用起澀精作用[2]。芡種皮重量約占芡種子重量的一半,在芡的生產(chǎn)過程中多作為燃料焚燒或直接廢棄,對(duì)環(huán)境造成污染,也造成資源的極大浪費(fèi)[3]。芡種皮富含酚類物質(zhì)[4-5],已有研究發(fā)現(xiàn),芡種皮提取物能顯著降低鏈脲佐菌素(STZ)誘發(fā)的糖尿病小鼠的血糖水平和血脂水平[6-8],但尚未報(bào)道其降糖機(jī)制是否與抑制消化酶活性相關(guān)。
α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是影響淀粉等碳水化合物消化和吸收的關(guān)鍵糖苷水解酶,其主要作用是將淀粉、蔗糖等分解成葡萄糖、麥芽糖而被機(jī)體吸收。而α-葡萄糖苷酶抑制劑和α-淀粉酶抑制劑則可減緩淀粉等物質(zhì)的降解,減少糖的吸收,從而降低餐后血糖,常用于二型糖尿病的治療,常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑藥物有阿卡波糖、米格列醇等[9]。由于化學(xué)合成的α-葡萄糖苷酶抑制劑和α-淀粉酶抑制劑有副作用,目前從植物中尋找天然α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制劑已成為研究的熱點(diǎn)。本研究擬對(duì)芡種皮多酚提取物體外對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性進(jìn)行研究,以期為芡種皮的應(yīng)用開發(fā)及芡資源的綜合利用提供參考和依據(jù)。
1.1材料與儀器
芡種皮2011年9月采集自蘇州蔞葑群力村,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳啟南教授鑒定為睡蓮科芡屬芡(Euryale ferox Salisb.)的種皮,置陰涼通風(fēng)處晾干后,粉碎過40目篩,備用;釀酒酵母α-葡萄糖苷酶(26.5 U/mg)和豬胰α-淀粉酶(50 U/mg) 美國Sigma公司;對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG) 上海寶曼生物科技有限公司;可溶性淀粉北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司;阿卡波糖批號(hào):130616,規(guī)格:50 mg/片,杭州中美華東制藥有限公司;其余試劑均為分析純,南京化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)用水實(shí)驗(yàn)室自制超純水。
Sartorius BT 125D型十萬分之一電子分析天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;KQ-500B超聲波清洗儀昆山市超聲儀器有限公司;MH-1型微量振蕩器江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠;DHG-902電熱鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HH-S型水浴鍋鞏義市英峪予華儀器廠;ELX800酶標(biāo)儀和Synergy H1全功能酶標(biāo)儀美國Bio-Tek公司;96孔酶標(biāo)板美國Corning公司;微量移液器芬蘭BIOHIT公司;SAGA-10TY實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1樣品的制備芡種皮多酚提取物參照文獻(xiàn)方法[4-5]制備,用二甲基亞砜(DMSO)溶解,配制成相當(dāng)于生藥3 g/mL的溶液,于4℃儲(chǔ)存。
1.2.2二硝基水楊酸(DNS)試劑的配制準(zhǔn)確稱取3,5-二硝基水楊酸0.63 g于100 mL燒杯中,加少量超純水溶解后,加入2 mol/L的NaOH溶液26.2 mL,再加到50 mL含有18.2 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中(溫度不超過50℃),再加0.5 g苯酚和0.5 g無水亞硫酸鈉,攪拌至溶解完全,冷卻后用超純水轉(zhuǎn)移定容至100 mL棕色容量瓶中,充分混勻,室溫放置一周后使用。
1.2.3α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[10-12]方法并稍有改動(dòng)。將樣品溶液配制成分別相當(dāng)于生藥2.52×10-2、5.04×10-2、0.10、0.20、0.40、0.81 mg/mL的溶液;將阿卡波糖配制成濃度分別為4.69×10-2、9.38× 10-2、1.88×10-1、3.75×10-1、0.75、1.50、3.00、6.00 mg/mL的溶液。分別吸取pH7.0的磷酸鹽緩沖液120 μL和不同濃度的樣品溶液20 μL置于96孔板上,加入0.24 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液20 μL,混勻后于37℃反應(yīng)10 min,再加入2.5 mmol/L的pNPG溶液20 μL,混勻,繼續(xù)37℃反應(yīng)10 min,最后加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液80 μL終止反應(yīng),于405 nm波長處測定吸光度值,計(jì)算抑制率,并用Origin軟件計(jì)算IC50值。以阿卡波糖為陽性對(duì)照,反應(yīng)體系見表1。
表1 α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系Table 1 Reaction system of inhibition activity against α-glucosidase
1.2.4α-淀粉酶活性抑制實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[10,13]方法并稍有改動(dòng)。將樣品溶液配制成分別相當(dāng)于生藥2.93×10-1、5.86×10-1、1.17、2.34、4.69、9.38、18.75 mg/mL的溶液;將阿卡波糖配制成濃度分別為11.72×10-3、23.44×10-3、46.88×10-3、93.75×10-3、18.75×10-2、3.75× 10-1mg/mL的溶液。吸取不同濃度的樣品溶液20 μL分別置于1.5 mL離心管內(nèi),加入3.75 U/mL的α-淀粉酶溶液20 μL,混勻后于37℃預(yù)熱10 min,再加入0.5%的可溶性淀粉溶液40 μL,混勻后于37℃反應(yīng)10 min,加入80 μL的DNS溶液終止反應(yīng),反應(yīng)液置沸水浴中加熱5 min后取出,于冰水浴中迅速冷卻,測定540 nm波長處的吸光度值,計(jì)算抑制率,并用Origin軟件計(jì)算IC50值。以阿卡波糖為陽性對(duì)照,反應(yīng)體系見表2。
表2 α-淀粉酶活性抑制實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系Table 2 Reaction system of inhibition activity against α-amylase
1.2.5對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法[10]并稍有改動(dòng)。酶濃度不變(0.24 U/mL),設(shè)置6個(gè)底物pNPG濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mmol/L),樣品設(shè)置0.1 mg/mL和0.2 mg/mL兩個(gè)濃度,分別吸取pH7.0的磷酸鹽緩沖液120 μL和不同濃度樣品20 μL置于96孔板上,加入0.24 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液20 μL,混勻后于37℃反應(yīng)10 min,再分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mmol/L的pNPG溶液20 μL,混勻,37℃下反應(yīng),每隔5 min在405 nm波長條件下檢測吸光度值,以底物濃度的倒數(shù)(1/S)為橫坐標(biāo),以反應(yīng)速度的倒數(shù)(1/V)為縱坐標(biāo),采用Excel軟件繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線,確定樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型。
為判斷芡種皮多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用是否可逆,樣品設(shè)0.1、0.2、0.4 mg/mL三個(gè)濃度,分別加入0.24 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液0、20、40、60、80、100 μL,補(bǔ)加pH7.0的磷酸鹽緩沖液至等體積,再加入等量的底物pNPG反應(yīng),405 nm波長條件下檢測吸光度值,以酶液的體積為橫坐標(biāo),以反應(yīng)速率為縱坐標(biāo),采用Excel軟件繪制芡種皮多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線。
1.2.6對(duì)α-淀粉酶抑制作用的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法[10]并稍有改動(dòng)。酶濃度不變(3.75 U/mL),設(shè)置3個(gè)底物淀粉濃度(0.5%、1.0%、2.0%),樣品設(shè)46.88 mg/mL和93.75 mg/mL兩個(gè)濃度,吸取不同濃度樣品20 μL分別置于1.5 mL離心管內(nèi),各加入3.75 U/mL的α-淀粉酶溶液20 μL,混勻后于37℃預(yù)熱10 min,再分別加入0.5%、1.0%、2.0%的可溶性淀粉溶液40 μL,混勻后于37℃反應(yīng),每隔5 min各濃度取出1支試管,加入80 μL的DNS溶液終止反應(yīng),反應(yīng)液置沸水浴中加熱5 min后取出,于冰水浴中迅速冷卻,測定540 nm波長處的吸光度值,以底物濃度的倒數(shù)(1/S)為橫坐標(biāo),以反應(yīng)速度的倒數(shù)(1/V)為縱坐標(biāo),采用Excel軟件繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線,確定樣品對(duì)α-淀粉酶的抑制類型。
為了判斷芡種皮多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制作用是否可逆,樣品設(shè)46.88、93.75、187.50 mg/mL三個(gè)濃度,分別加入濃度為0、3.75、7.5、15 U/mL的α-淀粉酶溶液,再加入等量的淀粉溶液,反應(yīng)后于540 nm波長條件下檢測吸光度值,以酶液的濃度為橫坐標(biāo),以反應(yīng)速率為縱坐標(biāo),采用Excel軟件繪制芡種皮多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線。
2.1芡種皮多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性
不同濃度的芡種皮多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響如圖1所示,提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。2.52×10-2mg/mL芡種皮多酚的抑制率為10.90%,隨著芡種皮多酚濃度的升高,其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性也隨之增加,當(dāng)濃度為0.81 mg/mL時(shí),抑制活性可達(dá)100%,其IC50為相當(dāng)于生藥0.08 mg/mL。從圖2可以看出,陽性對(duì)照阿卡波糖在濃度為4.69×10-2mg/mL時(shí),對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為7.01%,在6.00 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到84.93%,其IC50為0.52 mg/mL。因此,芡種皮多酚是較好的α-葡萄糖苷酶抑制劑,芡種皮多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性強(qiáng)于阿卡波糖。
圖1 芡種皮多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.1 Inhibitory effects of Euryale ferox polyphenols extracts from seed coat on α-glucosidase
圖2 阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.2 Inhibitory effects of acarbose on α-glucosidase
圖3 芡種皮多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制活性Fig.3 Inhibitory effects of Euryale ferox polyphenols extracts from seed coat on α-amylase
圖4 阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶的抑制活性Fig.4 Inhibitory effects of acarbose on α-amylase
2.2芡種皮多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制活性
不同濃度的芡種皮多酚對(duì)α-淀粉酶活性的影響如圖3所示,提取物對(duì)α-淀粉酶具有抑制作用。2.93× 10-1mg/mL芡種皮多酚的抑制率為48.90%,隨著芡種皮多酚濃度的升高,其對(duì)α-淀粉酶的抑制活性也隨之增加,當(dāng)濃度為18.75 mg/mL時(shí),抑制率可達(dá)99.11%,提示芡種皮多酚具有較好的α-淀粉酶抑制活性。由圖4可知,陽性對(duì)照阿卡波糖在濃度為11.72×10-3mg/mL時(shí),對(duì)α-淀粉酶的抑制率為34.47%,在3.75×10-1mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到96.17%。阿卡波糖抑制α-淀粉酶活性的IC50為0.02 mg/mL,芡種皮多酚提取物抑制α-淀粉酶活性的IC50為相當(dāng)于生藥濃度0.30 mg/mL,芡種皮多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制活性弱于阿卡波糖。
2.3芡種皮多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的類型
為確定芡種皮多酚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型,在其他反應(yīng)條件一定、改變底物濃度、添加不同濃度芡種皮多酚的條件下,測定酶促反應(yīng)速率,以1/[S]為橫坐標(biāo),以1/V為縱坐標(biāo),得到α-葡萄糖苷酶在不同濃度芡種皮多酚存在時(shí)的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線,見圖5。結(jié)果顯示,加入不同濃度芡種皮多酚時(shí),所得直線在縱軸上交于一點(diǎn),即縱軸截距相等,隨著樣品濃度的增加,反應(yīng)速率Vmax值基本保持不變;橫軸截距隨芡種皮多酚濃度的增加而增大,即米氏常數(shù)Km值增大,符合酶競爭抑制劑的作用特點(diǎn),因此推測芡種皮多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型為競爭性抑制。
圖5 不同濃度樣品與α-葡萄糖苷酶反應(yīng)的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.5 Lineweaver-Burk plots of the reactions of α-glucosidase with samples
由圖6可以看出,在測定酶活性體系中加入不同濃度的芡種皮多酚提取物后,所得的直線均通過原點(diǎn),且直線的斜率隨著芡種皮多酚濃度的增加而減少,說明芡種皮多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的[14]。
圖6 樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線Fig.6 Kinetics curves of inhibition of α-glucosidase
2.4芡種皮多酚對(duì)α-淀粉酶抑制作用的類型
為確定芡種皮多酚提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制類型,在其他反應(yīng)條件一定、改變底物濃度、添加不同濃度芡種皮多酚的條件下,測定酶促反應(yīng)速率,以1/[S]為橫坐標(biāo),以1/V為縱坐標(biāo),得到α-淀粉酶在不同濃度芡種皮多酚存在時(shí)的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線,見圖7。結(jié)果顯示,加入不同濃度芡種皮多酚時(shí),所得直線在縱軸上的截距相等,隨著樣品濃度的增加,反應(yīng)速率Vmax值基本保持不變;橫軸截距隨芡種皮多酚濃度的增加而增大,即米氏常數(shù)Km值增大,符合酶競爭抑制劑的作用特點(diǎn),因此推斷芡種皮多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制作用為競爭性抑制。
圖7 不同濃度樣品與α-淀粉酶反應(yīng)的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.7 Lineweaver-Burk plots of the reactions of α-amylase with samples
由圖8可知,在測定酶活性體系中加入不同濃度的芡種皮多酚提取物后,所得的直線均通過原點(diǎn),且直線的斜率隨著芡種皮多酚濃度的增加而減少,說明芡種皮多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制作用是可逆的[14]。
圖8 樣品對(duì)α-淀粉酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線Fig.8 Kinetics curves of inhibition of α-amylase
本研究從資源利用的角度出發(fā),對(duì)芡種皮多酚提取物進(jìn)行了體外抑制消化酶活性的研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,芡種皮多酚提取物具有較好的體外α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性,并且其活性與濃度有較好的量效關(guān)系,其抑制作用類型均為可逆性的競爭性抑制。芡種皮具有開發(fā)成輔助降糖的保健食品或藥品的潛力,但其體內(nèi)機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果為芡種皮開發(fā)功能食品或藥品提供了一定的理論基礎(chǔ),對(duì)于提高芡的附加值和芡資源的有效利用具有重要意義。
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In vitro inhibitory effects of polyphenol extracts from Euryale ferox seed coat on α-glucosidase and α-amylase activities
WU Cheng-ying1,2,WU Qi-nan3,4,*,WANG Hong4,F(xiàn)AN Xiu-he4
(1.Department of Pharmaceutical Analysis,Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210028,China;2.Department of Metabolomics,Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese Medicine and Jiangsu Branch of China Academy of Chinese Medical Sciences,Nanjing 210028,China;3.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization,Nanjing 210023,China;4.School of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China)
The inhibitory effects of total polyphenols extracts from Euryale ferox seed coat against α-glucosidase and α-amylase were studied through the in vitro testing of inhibition rate and inhibition kinetics.The results showed that the total polyphenols exhibited strong inhibitory effects against α-glucosidase and α-amylase in vitro with dose-effect relationship and the IC50were 0.08 mg/mL and 0.30 mg/mL,respectively.The inhibition type was reversible and competitive inhibitor.In conclusion,Euryale ferox seed coat would be a potential source for a hypoglycemic functional food or medicine.
Euryale ferox Salisb.;polyphenol extracts;α-glucosidase;α-amylase;inhibitory effects
TS255.1
A
1002-0306(2015)16-0091-05
10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.010
2014-10-14
伍城穎(1979-),女,博士,研究方向:中藥資源開發(fā)與品質(zhì)評(píng)價(jià),E-mail:fangfeng1979@163.com。
吳啟南(1963-),男,教授,研究方向:中藥資源生產(chǎn)與品質(zhì)評(píng)價(jià),E-mail:qnwyjs@163.com。
“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI04B06);江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目;江蘇省高等學(xué)?!爸兴庂Y源化學(xué)研究”優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2011)項(xiàng)目;江蘇省2013年度普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(CXLX13_600)。