ELISA操作注意事項及不確定度分量分析

張偉傅溥博高宏偉魏海燕梁新苗劉建禮劉來福*

（1.北京出入境檢驗檢疫局 北京 100026；2.山東出入境檢驗檢疫局）

ELISA操作注意事項及不確定度分量分析

張偉1傅溥博1高宏偉2魏海燕1梁新苗1劉建禮1劉來福1*

（1.北京出入境檢驗檢疫局 北京 100026；2.山東出入境檢驗檢疫局）

對ELISA的具體操作過程進行了梳理，討論了操作過程中的注意事項。根據測量不確定度規(guī)范性文件的要求，結合要素的注意事項對ELISA檢測過程中的不確定度分量進行了初步分析。

ELISA；注意事項；不確定度

1 前言

酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA）是目前在很多領域廣泛應用的一種試驗方法，其基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。依其測定抗原和抗體的不同，ELISA可分為直接法、間接法、雙抗體夾心法（直接、間接）、競爭抑制法（直接、夾心等）、捕獲法等。在測定抗原時，蛋白質大分子抗原測定多用雙抗體夾心法，而只有單個抗原表位的小分子則常使用競爭抑制法；對抗體的測定通常使用間接法、雙抗原夾心法、競爭抑制法和捕獲法等［1］。在實際操作過程中，ELISA會出現(xiàn)一些常見的問題，問題的產生涉及試劑的選擇、操作流程及不當操作等。本研究從ELISA檢測的常見的問題出發(fā)，系統(tǒng)梳理影響ELISA試驗結果的因素，根據測量不確定度規(guī)范性文件的要求與指南的指導對ELISA測定中的不確定度分量進行了歸納與分析。

2 ELISA檢測中常見的問題分析

ELISA方法具有敏感度高、特異性強、自動化程度高等諸多優(yōu)點，但此方法操作步驟較多，對實驗室環(huán)境、溫度、人員操作有較高要求，試驗過程中每個操作環(huán)節(jié)不規(guī)范都會對試驗產生影響，得到錯誤結果［2］。

2.1試劑

試劑本身以及在使用過程中的問題都會導致試驗結果不準確，造成結果偏差。如，使用過期試劑或不同試劑盒組分混用；試劑盒未按規(guī)定保存或保存溫度較高；標準品中可能不含強陽性標本；廠家試劑質量的變化等［3］。試劑、樣品用前未平衡至室溫；蒸餾水質有問題；待檢樣品放置時間過長或受到污染；試劑在使用過程中受到污染或反復使用；濃縮洗滌液使用時有結晶，未完全溶解；標記物使用不正確或者已經變質；移液吸頭重復使用、未洗凈或消毒不完全等。

2.2加樣

加樣過程中的錯加、漏加試劑，或底物加量不足、順序顛倒，或混合后加入；移液器計量不準，吸頭內水分太多或不清潔；樣品離心不完全；反應孔內發(fā)生凝血或殘留細胞成分；加樣時交叉污染；樣品數量較多，加樣時間過長，加樣后未混勻等。這些情況會出現(xiàn)白板（顯色步驟結束后，酶標反應板所有孔均無顯色）、顯色弱、靈敏度低、假陽性、重復性差等現(xiàn)象。

2.3溫育

在溫育過程中，培養(yǎng)箱溫度過高或過低；溫育時未按要求貼封片或加蓋，使樣品或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗徹底；人為延長或縮短樣品在培養(yǎng)箱中的溫育時間，導致非特異性結合緊附于反應孔周圍，難以清洗徹底。這些情況會出現(xiàn)顯色弱（高）、靈敏度低（高）、重復性差等。

2.4洗板

洗滌液添加過多，使孔與孔之間的液體交叉混合，造成反應板的污染；洗滌液用量不足或稀釋倍數不符合要求，洗滌時沖擊力太大，浸泡時間過長或不夠；反應板數量過多造成洗板等待時間長（在室溫較高時），人為地增加了反應時間；洗液量不足；洗板針堵塞，抽吸不完全：洗板不暢等［4］。這些情況會出現(xiàn)白板、顯色弱（高）、靈敏度低（高）、假陽性、重復性差等現(xiàn)象。

2.5讀板

讀板時如果儀器參數設定不正確，濾光片不匹配，計算公式不正確，板底不清潔，酶標儀重復性差等，會導致靈敏度低、假陽性、重復性差等現(xiàn)象［5］。

2.6操作不當

任何不當操作都會影響結果。

2.7本底偏高及假陽性產生

在ELISA檢測過程中，本底偏高甚至造成假陽性的結果是比較嚴重的問題。這主要可能是由以下幾種原因造成：樣品分離不完全；樣品嚴重溶血或脂血；加樣時間過長；樣品與稀釋液未充分混勻；酶標抗體（抗原）吸附于孔壁或表面；反應與顯色時未加蓋封口膜；溫育時間（反應時間、顯色時間）過長或溫度過高；洗滌液污染或洗滌不徹底；工作環(huán)境溫度過高。

2.8本底偏低及假陰性產生的原因

本底偏低及假陰性產生的原因主要包括：試劑未平衡至室溫；加樣量不足或樣品過度稀釋；加樣時有氣泡；抗原、抗體反應時間或顯色時間不夠；過度洗滌；環(huán)境溫度過低；試劑盒過期等。

綜上所述，ELISA檢測技術是一種敏感性高、特異性強、重復性好的實驗診斷方法，其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡便，結果判斷客觀等，已廣泛應用在各領域的免疫學檢驗中。然而，在ELISA操作過程中，常會因試劑、樣品及操作技術等可控因素而影響結果的判讀。因此，在試驗操作中，操作者必須熟練掌握其基本操作，嚴格進行試劑、樣品的核查，以確保檢查結果的準確性和可靠性。只有加強各個環(huán)節(jié)的質量控制才能充分發(fā)揮其方法學的優(yōu)點，保證檢測結果的可靠性。

3 ELISA測定中不確定度分量的確定與分析

ELISA的主要操作過程：樣品準備（含溶液配制、稀釋等操作））→ELISA檢測（標準品校準、陰性對照、陽性對照、加樣、溫育、計時等）→酶標儀讀數→結果計算。

根據操作流程，結合操作注意事項的分析，按照測量不確定度規(guī)范文件的要求及應用具體指南中的分析要點，分析ELISA測定中不確定度的分量，如圖1所示。

圖1　不確定度分量的主要構成

ELISA測定中不確定度的來源主要由以下要素構成：

移液器（包括體積校準和溫度校準）、酶標儀、溫育溫度、溫育時間、重復性、陽性對照（包括吸光度值、平均值、體積及濃度）、陰性對照（包括吸光度值、平均值、體積及濃度）、樣品（包括吸光度值、平均值及體積）、液層厚度、底物體積、終止液體積等。

根據《測量不確定度的要求》、《測量不確定度表示指南》、《測量不確定度要求的實施指南》、《檢測和校準實驗室能力的通用要求》、《測量不確定度評定與表示》等指導性文件的計算和統(tǒng)計要求［6-11］，結合國內外的ELISA測量不確定度的分析方法，本文選取陽性對照吸光度值P進行分析，以期為ELISA檢測不確定度的研究提供分析思路與方法［12-19］。

P是指在某個特定波長下的吸光度值，根據朗伯-比爾定律（A=εbc），吸光度值與吸光系數（ε），液層厚度（b）和陽性質控對照液濃度（C0）成正比。對于某一特定的顯色反應來說，ε是個常數，因此P的不確定度主要由b和C0提供。

3.1液層厚度（b）

在ELISA試驗中，吸收光從酶標板上方垂直通過液層，因此影響b的主要因素就是溶液層的最終體積，即100 μL底物溶液（V3）+100 μL終止液（V4）。由于在試驗中使用的是同樣的加樣器，因此產生的不確定度是相同的，而影響加樣器體積的不確定度主要因素是加樣器的校準（C）和溫度效應（T），它們都屬于B類不確定度。

（1）C產生的不確定度u（C）

根據試劑盒說明書的要求，使用100 μL的加樣器其準確度為±2%，按矩形分布處理，校準引入的標準不確定度為：u（C）=±2%/=1.15（μL）；

（2）T產生的不確定度u（T）

容量器皿的校準在20℃下進行，假設實驗室的溫度為20℃±4℃，水的膨脹系數為2.1×10-4/℃，按矩形分布100 μL加樣器由溫度效應引入的標準不確定度為：u（T）=100×4×2.1×10-4=0.084（μL）；

（3）V3引起的標準合成不確定度u（V3）

由于校準和溫度效應是2個相互獨立的分量，因此V3引起的標準合成不確定度u（V3）=

（4）V4所引起的標準合成不確定度u（V4）

同理由100 μL終止液（V4）所引起的標準合成不確定度u（V4）=u（V3）=1.153（μL）；

因為u（V4）和u（V3）是兩個相互獨立的兩個分量，所以b的標準合成不確定度分量u（b）=

需要說明的是b的影響需要辨證地看，因為溶液體積變化的同時也會使溶液濃度發(fā)生變化，即體積增大，厚度增大，吸光度增大；同時濃度減小，吸光度下降。為了降低風險，濃度的影響可忽略。

3.2陽性對照液濃度（C0）

C0取決于陽性對照液量（V0）的大小，因此取決于100 μL加樣器的準確度。同3.1，影響加樣器的體積不確定度的主要因素是C和T，它們都屬于B類不確定度。

u（C）=1.15（μL）；u（T）=0.084（μL）；

因此，u（V0）=u（V3）=u（V4）=1.153（μL）。

因為影響C0的僅有V0一個分量，因此C0的標準不確定度u（C0）=u（V0）=1.153（μL）。

3.3合成P的不確定度

因為b和C0是2個相互獨立的分量，又是相乘的關系，根據公式：

對于P進行n次平行測定，其結果如表1所示。

表1　陽性對照（P）的n次重復測定結果

那么P的合成標準不確定度u（P）計算如下：

酶聯(lián)免疫吸附試驗過程復雜，涉及的不確定度的分量較多，每個分量都要根據自身特點進行分析與計算，形成合成不確定度。

4 結論

本研究結合具體的ELISA實際操作流程和關鍵環(huán)節(jié)，分析了ELISA檢測中出現(xiàn)的主要問題及產生的原因，確定了ELISA檢測過程中的不確定度分量。根據質量體系對測量不確定的要求，結合國內外的分析方法，選取陽性對照吸光度值P進行分析，以期為ELISA檢測不確定度的研究提供分析思路與方法。

［1］Crowther J R.The ELISA Guidebook［M］.PubMed Commons，2000.

［2］崔秀華.ELISA操作及常見問題分析［J］.德州學院學報，［3］朱風辰.ELISA檢測中常見問題的分析［J］.職業(yè)與健康，2007，23（12）：1004-1005.

2011，27（8）：66-69.

［4］黃劍鋒.ELISA抗體檢測中常見問題及解決方法［J］.畜禽業(yè)，2013，10：47.

［5］詹文輝.酶聯(lián)免疫吸附試驗中常見問題的產生原因及解決辦法［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2013，35（4）：36-37.

［6］CNAS-CL07：2011測量不確定度的要求［S］.

［7］ISO/IEC指南98-3測量不確定度表示指南［S］.

［8］CNAS-GL05：2011測量不確定度要求的實施指南［S］.

［9］GB/T15481-2000檢測和校準實驗室能力的通用要求［S］.

［10］JJF1059-1999測量不確定度評定與表示［S］.

［11］國家質量技術監(jiān)督局計量司組.測量不確定度評定與表示指南［M］.第一版.北京：中國計量出版社.

［12］S Populaire，E C Gimenez.A simplified approach to the estimation of analytical measurement uncertainty［J］.Accred Qual Assur，2006，10：485-493.

［13］L Borg，J Kristiansen，J M Christensen，et al.Evaluation of accuracy and uncertainty of ELISA assays for the determination ofinterleukin-4，interleukin-5，interferon-γandtumor necrosis factor-α［J］.Clin Chem Lab Med，2002，40（5）：509-519.

［14］M Suchanek，P Robouch.Measurement uncertainty of test kit results-the ELISA example［J］.Clin Chem Lab Med，2009，47（7）：808-810.

［15］Y Hayashi，R Matsuda，T Maitani，et al.Precision，Limit of detection and range of quantitation in competitive ELISA［J］. Anal Chem，2004，76：1295-1301.

［16］JFToussaint，PAssam，BCaij，etal.Uncertaintyof measurement for competitive and indirect ELISAs［J］.Rev sci tech off int Epiz，2007，26（3）：649-656.

［17］王治國，王薇，李小鵬.測量不確定度及其在臨床檢驗中應用［J］.中國衛(wèi)生統(tǒng)計，2005，22（2）：85-86.

［18］趙春城，趙曉聯(lián)，蔡正森，等.應用酶聯(lián)免疫吸附法的實驗不確定度分析［J］.飼料研究，2004，11：31-33.

［19］盧利軍，趙慶松，程秀吉，等.ELISA法檢測人體血清中HIV-1+ 2型抗體結果不確定度評定［J］.中國艾滋病性病，2004，10（6）：407-409.

Analysis of Operational Consideration and Uncertainty of ELISA

Zhang Wei1，F(xiàn)u Pubo1，Gao Hongwei2，Wei Haiyan1，Liang Xinmiao1，Liu Jianli1，Liu Laifu1*
（1.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing，100026；2.Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau）

Afteranalyzing thedetailedoperatingproceduresofELISAmethodssystematically，the operational considerations of ELISA are discussed.According to the requirements of normative documents ofmeasurementuncertainty，thecomponentsofELISAuncertaintypreliminarilybasedonthe consideration factors are analyzed.

ELISA；Operational Consideration；Uncertainty

R446.61

E-mail：zhangwei.cau@163.com；*通訊作者E-mail：liulf@bjciq.gov.cn

國家質檢總局科技計劃項目（2013IK306）

2015-06-09