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    全自動酶免分析儀校驗方法的建立

    2015-10-31 02:27:28馬澤芹王靜劉建禮張猛韓玉田
    質(zhì)量安全與檢驗檢測 2015年4期
    關(guān)鍵詞:實驗系統(tǒng)

    馬澤芹王靜劉建禮張猛韓玉田*

    (1.煙臺艾德康生物科技有限公司山東煙臺264006;2.北京出入境檢驗檢疫局)

    全自動酶免分析儀校驗方法的建立

    馬澤芹1王靜1劉建禮2張猛1韓玉田1*

    (1.煙臺艾德康生物科技有限公司山東煙臺264006;2.北京出入境檢驗檢疫局)

    為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,建立了一套全自動酶免分析儀全面校驗方法,對加樣系統(tǒng)、孵育系統(tǒng)、洗板系統(tǒng)、讀數(shù)系統(tǒng)和全局分別采取模塊式和整體式方法進(jìn)行校驗,從而保證各個模塊的準(zhǔn)確性和整體的可靠性。

    全自動酶免分析儀;校驗方法;加樣系統(tǒng);孵育系統(tǒng);洗板系統(tǒng);讀數(shù)系統(tǒng)

    1 前言

    全自動酶免分析儀是運(yùn)用ELISA測定的基本原理,集加樣系統(tǒng)、孵育系統(tǒng)、洗板系統(tǒng)和讀數(shù)系統(tǒng)為一體的綜合檢測系統(tǒng),可以全自動完成ELISA實驗,目前全自動酶免分析儀越來越多地應(yīng)用于各大醫(yī)院、血站、計生站和科研單位,它能有效減輕操作人員的勞動強(qiáng)度,并提高檢驗的準(zhǔn)確性和可靠性。但不當(dāng)?shù)牟僮骱途S護(hù)以及長時間使用可能造成實驗結(jié)果的較大偏差,因此定期進(jìn)行全自動酶免分析儀的校驗非常必要[1,2]。以下介紹全自動酶免分析儀校驗方法的建立。

    2 材料與方法

    2.1材料

    2.1.1加樣系統(tǒng)

    萬分之一天平:用于測定加樣純水的質(zhì)量;帶板條的干凈酶標(biāo)板:用于盛放加樣時的純水;干凈密封性容器:用于盛裝純化水;無粉手套:實驗過程中需要全程戴手套,以防手上的汗?jié)n、灰塵等對實驗結(jié)果的影響。

    2.1.2孵育系統(tǒng)

    PT1000的溫度計:測量孵育系統(tǒng)的溫度變化,需要經(jīng)過國家質(zhì)檢部門的校驗,并提供校驗報告。

    2.1.3洗板系統(tǒng)

    萬分之一天平:用于測定洗板前酶標(biāo)板的質(zhì)量和洗板后酶標(biāo)板的質(zhì)量;帶板條的干凈酶標(biāo)板:用于全自動酶免分析儀進(jìn)行洗板過程;無粉手套:實驗過程中需要全程戴手套,以防手上的汗?jié)n、灰塵等對稱量結(jié)果的影響。

    2.1.4讀數(shù)系統(tǒng)

    標(biāo)準(zhǔn)比色片組:吸光度分別為0.2A、0.5A、1.0A、1.5A,不確定度≤0.01;比色片證書編號:01268-15-0;廠家編號:MB1-043。

    2.1.5整體性能

    酶標(biāo)板:5塊,乙肝每個項目一塊微孔板;試管:96個,放置實驗過程中使用的校準(zhǔn)品和血清;蒸餾水:在實驗過程中代替校準(zhǔn)品、血清、酶等試劑和洗滌液。

    2.2方法

    2.2.1加樣系統(tǒng)校驗

    全自動酶免分析儀的加樣系統(tǒng)需要定期的校驗,以確保加樣量和測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。加樣系統(tǒng)校驗采用稱量法,此方法操作簡單,也適用于對全自動加樣系統(tǒng)的日常校正[3]。

    2.2.1.1加樣量的精密度

    使用純水,每次使用對應(yīng)的加樣頭加樣,加樣量100 μL,密封性容器。在實驗?zāi)J竭x擇中,稱量容器質(zhì)量,加注純水后用精密天平稱重,求算加樣純水的質(zhì)量,重復(fù)實驗6次,計算6次加樣量的變異系數(shù)(CV值,%)。為了試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,每個加樣通道均進(jìn)行校驗。

    2.2.1.2加樣量的準(zhǔn)確性

    使用純水,每次選擇對應(yīng)的加樣頭加樣,加樣量100 μL,密封性容器。在實驗?zāi)J竭x擇中,稱量容器質(zhì)量,加注純水后用精密天平測量,求算加樣純水的質(zhì)量,重復(fù)實驗6次,計算6次加樣量的平均值,換算為測定時對應(yīng)溫度下純水的體積,計算測試平均值與相對誤差。為了試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,每個加樣通道均進(jìn)行校驗。

    2.2.1.3加樣系統(tǒng)精密度

    利用全自動酶免分析儀的加樣系統(tǒng),加100 μL檸檬黃溶液至96孔酶標(biāo)板內(nèi)。此檸檬黃液體需要按特定的比例配制,要求配置的液體用酶標(biāo)儀測試時的讀數(shù)在1.0-1.5之間。加樣系統(tǒng)自動分液100 μL/孔后,使用酶標(biāo)儀雙波長測量加樣后酶標(biāo)板的OD值,記錄并分析加樣96孔酶標(biāo)板的精密性。

    2.2.2孵育系統(tǒng)校驗

    利用全自動酶免分析儀的控制軟件,開啟孵育器的溫度,溫度設(shè)定在待測溫度。將PT1000溫度計貼在孵育器上面,待溫度相對穩(wěn)定在待測溫度后,分別記錄孵育器5個點(周圍4點和中間的1點)的溫度測定值。在1 h內(nèi)連續(xù)測定5次并記錄,取平均值與標(biāo)示值之差(即偏差),最大值與最小值之差的一半為波動性。全自動酶免分析儀的孵育系統(tǒng)是獨(dú)立的控溫孵育器組成,所以每個獨(dú)立的孵育模塊均要進(jìn)行溫度的校驗。

    2.2.3洗板系統(tǒng)校驗

    取96孔酶標(biāo)板稱重并記錄酶標(biāo)板質(zhì)量,全自動酶免分析儀利用軟件控制對酶標(biāo)板用蒸餾水進(jìn)行板式洗滌1次后再稱重并記錄酶標(biāo)板的質(zhì)量,將洗滌后酶標(biāo)板的質(zhì)量減去洗滌前酶標(biāo)板的質(zhì)量,然后換算成體積單位,除以96為每孔殘液量,洗板機(jī)的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)為每孔≤2 μL[4]。

    2.2.4讀數(shù)系統(tǒng)校驗

    讀數(shù)系統(tǒng)的校驗是依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)《酶標(biāo)分析儀檢定規(guī)程》(JJG861-2007)進(jìn)行[5]。在校驗酶標(biāo)儀時,需先將酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min。

    2.2.4.1示值穩(wěn)定性(漂移)

    選用450 nm、630 nm,標(biāo)稱1.0的標(biāo)準(zhǔn)濾光片放置到空微板架,以空氣做參比讀數(shù),測量并記下儀器初始值,5 min后記錄儀器示值,10 min后再次記錄儀器示值,求出兩次吸光度示值的最大值,按照公式(1)計算示值穩(wěn)定性。示值穩(wěn)定性的校驗標(biāo)準(zhǔn)≤±0.005。

    式中:Ai-第i次測量的吸光度值;

    A初始-儀器的初始值。

    2.2.4.2吸光度示值誤差(準(zhǔn)確度)

    選用450 nm、630 nm中性濾光片放到空微板架上,以空氣做參比連續(xù)讀3次。依次記錄儀器示值,并計算平均值。示值誤差ΔA按照公式(2)進(jìn)行計算:

    式中:Ai-第i次測量的吸光度值;

    As-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)值。

    儀器吸光度示值誤差結(jié)果的報告以450 nm、630 nm下,通過測量計算得到的吸光度示值誤差的最大值得出。吸光度示值誤差的校驗標(biāo)準(zhǔn)為≤±0.03。

    2.2.4.3吸光度重復(fù)性的測量

    選用450 nm、630 nm波長,將吸光度標(biāo)稱值為0.5或者1.0的光譜中性濾光片放到空微板架上,以空氣為參比,于固定的某一孔位測量6次,記錄儀器示值,并計算平均值,按照公式(3)計算RSD值,以實驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值(RSD值)表示儀器吸光度值的重復(fù)性。RSD的校驗標(biāo)準(zhǔn)為≤1%。

    其中:xi-第i次測量的結(jié)果;

    xˉ-n次測量結(jié)果的吸光度平均值;

    n-測量的次數(shù)。

    2.2.4.4通道差異的測定

    選用450 nm、630 nm波長,將吸光度為1.0的光譜中性濾光片放在空的酶標(biāo)板架上,先后置于每個通道相應(yīng)的位置上,以空氣作為參比,測量并記錄每個通道至少6次的吸光度值。多個通道的差異結(jié)果報告用全部測量數(shù)據(jù)的極差表示按照公式(4)計算通道差異δA。

    式中:Amax-多個通道測量結(jié)果的吸光度最大值;

    Amin-多個通道測量結(jié)果的吸光度最小值;

    δA-通道差異。

    2.2.5整體性能

    全自動酶免分析儀的整體性能通過用水模擬實驗過程的方式進(jìn)行校驗。以乙肝五項的實驗方法進(jìn)行整體性能的校驗,在全自動酶免分析儀軟件上編輯乙肝五項的實驗方法,準(zhǔn)備實驗用一次性加樣頭、校準(zhǔn)品和血清(用蒸餾水代替)、酶等試劑和洗滌液(用蒸餾水代替)、酶標(biāo)板。然后利用全自動酶免分析儀同時運(yùn)行乙肝五項的實驗方法。其中實驗過程中的孵育時間可以設(shè)置成5 min。

    3 結(jié)果

    3.1加樣系統(tǒng)

    3.1.1加樣量的精密度

    結(jié)果見表1。測試4個加樣通道的加樣量,其加樣量的變異系數(shù)分別為0.5%、0.6%、0.6%、0.5%。

    3.1.2加樣量的準(zhǔn)確性

    結(jié)果見表1。通道1測試6次平均值與100 μL之間的差異為1.1 μL,其他3個通道的差異為0.5 μL、1.0 μL、1.0 μL。

    表1 加樣量精密度和準(zhǔn)確性

    3.1.3加樣系統(tǒng)精密度

    結(jié)果見表2。利用4通道加樣系統(tǒng)進(jìn)行分液,測試整板的OD值,其CV為1.3%,加樣的誤差完全符合實驗的要求。

    表2 加樣系統(tǒng)精密度

    3.2孵育系統(tǒng)

    表3為一個獨(dú)立孵育模塊的測試結(jié)果。

    表3 孵育模塊溫度測試數(shù)據(jù)(單位℃)

    從實驗數(shù)據(jù)上看,孵育模塊的溫度偏差(平均值與標(biāo)示值之差)為37.172-37=0.172℃;波動性(最大值與最小值之差)為37.7-36.4=1.3℃。

    3.3洗板系統(tǒng)

    洗滌前酶標(biāo)板的質(zhì)量為24.534 g,洗滌后為24.378 g,洗滌前后質(zhì)量差為0.156 g,換算成體積為156 μL。因每酶標(biāo)板上有96孔,所以每孔的殘液量為156 μL/96=1.625 μL。

    3.4讀數(shù)系統(tǒng)

    3.4.1示值穩(wěn)定性

    表4為示值穩(wěn)定性的試驗結(jié)果。

    表4 示值穩(wěn)定性

    r=1.0045-1.002=0.0025,符合標(biāo)準(zhǔn)要求(≤±0.005)。

    3.4.2吸光度示值誤差

    表5為吸光度示值誤差的試驗結(jié)果。

    表5 吸光度示值誤差

    結(jié)果顯示,吸光度示值誤差符合標(biāo)準(zhǔn)要求(≤± 0.03)。

    3.4.3吸光度重復(fù)性

    表6為吸光度重復(fù)性的測量結(jié)果。

    表6 吸光度重復(fù)性

    結(jié)果顯示,吸光度重復(fù)性符合標(biāo)準(zhǔn)要求(RSD≤1%)。

    3.4.4通道差異的測定通道差異的測定結(jié)果見表7。

    表7 通道差異

    3.5整體性能

    此整體性能的測試,主要檢測全自動酶免分析儀各個模塊的運(yùn)行情況,在檢測過程中要達(dá)到各模塊之間配合協(xié)調(diào),運(yùn)行流暢。此項目的檢測并不產(chǎn)生具體的數(shù)據(jù)結(jié)果。

    4 討論

    4.1環(huán)境對加樣精度的影響

    全自動酶免分析儀在使用和校驗時,對環(huán)境的溫度有特殊的要求。實驗室環(huán)境溫度的變化對加樣系統(tǒng)的加樣精度有很大的影響,可能導(dǎo)致加樣精度的不準(zhǔn)確,產(chǎn)生系統(tǒng)誤差甚至造成弱陽性樣本的漏檢[6]。所以在對全自動酶免分析儀進(jìn)行使用和校驗時,要保證實驗室的溫度恒定并根據(jù)不同儀器的使用環(huán)境對實驗室的環(huán)境進(jìn)行設(shè)置。

    4.2洗板機(jī)的維護(hù)

    幾乎所有試劑盒中的洗液都是需要經(jīng)過稀釋才可以使用,雖然洗液的濃度比較低,但是這些洗液在洗板機(jī)和管路中存留的時間過久之后,還是會有結(jié)晶產(chǎn)生。結(jié)晶的時間過久會不容易清理。而當(dāng)洗板機(jī)和管路中有結(jié)晶存在時,測量出的每孔殘留量是不準(zhǔn)確的,所以全自動酶免分析儀在使用之后,需要用蒸餾水對洗板機(jī)和管路進(jìn)行沖洗,以防洗板機(jī)和管路中產(chǎn)生結(jié)晶,從而對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。

    4.3讀數(shù)儀的校驗

    在全自動酶免分析儀中,讀數(shù)儀是一個單獨(dú)的模塊,可以單獨(dú)進(jìn)行校驗。有些大的實驗室和醫(yī)院已經(jīng)形成了一套成熟的對讀數(shù)儀進(jìn)行校驗的方法,在此情況下,讀數(shù)儀的校驗方法和流程可以按照實驗室的校驗方法進(jìn)行。

    5 結(jié)論

    全自動酶免分析儀是集加樣系統(tǒng)、孵育系統(tǒng)、洗板系統(tǒng)和讀數(shù)系統(tǒng)為一體的綜合檢測系統(tǒng),其校驗是一個復(fù)雜的過程,必須針對機(jī)器的特性,采用模塊式和整體式相結(jié)合的方式對其進(jìn)行科學(xué)、全面校驗,這樣才能保證臨床實驗過程中所得數(shù)據(jù)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

    [1]欒燕,沈光,劉顯智.血站儀器設(shè)備管理淺析[J].中國輸血雜志,2009,22(1):17-18.

    [2]李明生.血站儀器設(shè)備檢定和校準(zhǔn)的思索與體會[J].臨床輸血與檢驗,2005,7(4):299-300.

    [3]楊青成,鄭康林,宋冬云.對全自動加樣系統(tǒng)校正的探討[J].中國輸血雜志,2004,17(3):164-165.

    [4]張岳,李竹青.自動洗板機(jī)校準(zhǔn)方法的研究[J].中國計量,2013,4:102-103.

    [5]JJG861-2007酶標(biāo)分析儀檢定規(guī)程[S].

    [6]費(fèi)榮,張立波,馬貴明.環(huán)境溫度變化對全自動加樣器影響分析[J].臨床血液學(xué)雜志,2013,26(6):410-411.

    Envisage of Calibration Methods of Fully Automated ELISA Analyzer

    Ma Zeqin1,Wang Jing1,Liu Jianli2,Zhang Meng1,Han Yutian1*
    (1.Yantai Addcare Bio-Tech Limited Company,Yantai,Shandong,264006;2.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau)

    To ensure the accuracy and reliability of experimental results,an overall calibration method of Fully Automated Elisa Analyzer is established.Modular and unitary verification of pipetting system,incubation system,washing system,reading system and the whole system ensures the accuracy and reliability of each modles and overall performance respectively.

    Fully Automated Elisa Analyzer;Test Method;Pipetting System;Incubation System;Washing System;Reading System

    R446.61

    E-mail:mazeqin@addcare.cn;*通訊作者E-mail:hanyutian@addcare.cn

    國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2013IK306)

    2015-06-09

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