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    金剛烷胺ELISA試劑盒的研制

    2015-10-31 02:27:28吳小平王文珺劉螢邢維維蘇麗芳
    關(guān)鍵詞:金剛烷胺雞肉檢出限

    吳小平王文珺劉螢邢維維蘇麗芳

    (1.北京維德維康生物技術(shù)有限公司 北京 100095;2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局)

    金剛烷胺ELISA試劑盒的研制

    吳小平1王文珺1劉螢2*邢維維1蘇麗芳1

    (1.北京維德維康生物技術(shù)有限公司 北京 100095;2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局)

    [目的]研制金剛烷胺ELISA快速檢測試劑盒,用以檢測雞肉中金剛烷胺殘留量。[方法]在金剛烷胺單克隆抗體基礎(chǔ)上,用直接競爭酶聯(lián)免疫吸附法研究試劑盒的各項(xiàng)指標(biāo)。[結(jié)果]研制的試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.5-40.5 μg/L,線性回歸方程為y=-2.0574x+0.4763(R2=0.9967),IC50濃度值為1.9 μg/L;對雞肉中金剛烷胺的檢出限為0.25 μg/kg,添加回收率范圍為76.0%-109.0%,批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于15%。[結(jié)論]該試劑盒具有快速、靈敏、穩(wěn)定的特點(diǎn),各項(xiàng)指標(biāo)性能良好,可用于雞肉中金剛烷胺殘留的定性或半定量檢測。

    金剛烷胺;試劑盒;檢測;雞肉

    1 前言

    金剛烷胺(amantadine,AMT)屬于三環(huán)胺類,多以鹽酸鹽形式存在,分子式:C10H18NCl[1]。常溫下為白色結(jié)晶性粉末,在乙醇和水中易溶,在三氯甲烷中溶解,呈堿性[2]。金剛烷胺可以抑制病毒穿入宿主細(xì)胞,并影響病毒的脫殼,抑制其繁殖,可用于各種A型流感病毒及帕金森綜合癥的治療[3,4]。但金剛烷胺對食用者可能產(chǎn)生嗜睡、失眠、眩暈、抑郁、惡心、食欲減退等多種不良反應(yīng),具有一定的毒副作用[1]。而且,長期使用金剛烷胺可以使病毒產(chǎn)生不同程度的耐藥性,誘導(dǎo)產(chǎn)生新型耐藥病毒[5]。因此,我國農(nóng)業(yè)部2005年第560號(hào)公告明確規(guī)定金剛烷胺和金剛乙胺等抗病毒藥物在獸醫(yī)上禁止使用,美國FDA于2005年也禁止將金剛烷胺和金剛乙胺等人類抗病毒藥物用于畜禽類[6,7]。

    目前,檢測金剛烷胺的方法有氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)、液相色譜法(HPLC)和液相色譜質(zhì)譜法(LC-MS),這些方法所需儀器昂貴,前處理過程復(fù)雜,操作時(shí)間過長,無法在基層檢測機(jī)構(gòu)推廣[8,9]。以免疫學(xué)檢測技術(shù)為基礎(chǔ)建立起來的酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)試劑盒可為建立監(jiān)控動(dòng)物性食品中金剛烷胺殘留提供技術(shù)支持。

    2 材料與方法

    2.1材料

    2.1.1試劑

    乙腈(分析純)等生化試劑:購自上海華美公司;阿莫西林、氯唑西林、苯唑西林、頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品:購自sigma公司。

    2.1.2儀器

    均質(zhì)器(JZ-II型):購自莆田市南榮貿(mào)易有限公司;電子天平(2000SBL):購自美國Setra;氮吹儀(KL512):購自美國Organomation;低速離心機(jī)(Anke TDL-40B):購自上海安亭科學(xué)儀器;漩渦混合器(QL-901):購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司;酶標(biāo)儀(MK3)、微量移液器:購自美國Thermo;生化培養(yǎng)箱(DHP-600):購自天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司。

    2.2方法

    2.2.1溶液系統(tǒng)

    各溶液參考宮慧芝所述方法配制[10]。

    2.2.2抗體制備

    分泌抗金剛烷胺單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株由本公司建立,利用BALB/c小鼠體內(nèi)誘生單克隆抗體的方法制備抗體,采用飽和硫酸銨法對腹水進(jìn)行純化??贵w的特異性和靈敏度采用間接競爭ELISA法進(jìn)行測定。

    2.2.3ELISA方法建立

    將上述制備的抗金剛烷胺單克隆抗體包被于酶標(biāo)板微孔,配制質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 μg/L的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)液,參照劉百紅所述方法建立直接競爭ELISA檢測體系。檢測步驟如下:加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品于設(shè)定酶標(biāo)板微孔中;然后加入金剛烷胺酶標(biāo)抗原工作液50 μL;輕敲微孔板邊緣混勻1 min,25℃恒溫箱中避光反應(yīng)30 min;洗板3次,每次加入洗滌液250 μL,最后一次甩干余液,并在吸水紙上拍干;加入底物液100 μL,在25℃恒溫箱中避光反應(yīng)15 min后加入終止液100 μL;用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測各孔吸光度值(Optical density,OD)[11]。

    2.2.4樣品前處理

    用均質(zhì)器將動(dòng)物組織樣品均質(zhì);稱取樣品3.0± 0.05g至50mL離心管中,加入乙腈6mL和金剛烷胺純化試劑(無水硫酸鈉)1.0 g,用渦旋儀渦動(dòng)3 min;25℃、4 000 r/min離心10 min;取2 mL上層乙腈至干凈玻璃試管中,置于60℃-70℃水浴鍋中用氮?dú)饬鞔蹈?;加?.5 mL金剛烷胺樣品提取液(1%三氯乙酸+甲醇,以體積比1∶1混勻),用渦旋儀渦動(dòng)2 min;取100 μL進(jìn)行樣品測試。

    3 結(jié)果

    3.1ELISA工作曲線

    圖l為金剛烷胺ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。曲線呈典型的S型,回歸方程為:y=-2.0574x+0.4763,相關(guān)系數(shù)R2為0.9967,IC50濃度值為1.9 μg/L,標(biāo)準(zhǔn)曲線中各標(biāo)準(zhǔn)品濃度對應(yīng)的吸光百分比值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(RSD)為1.7%-8.6%。結(jié)果表明金剛烷胺試劑盒在0.5-40.5 μg/L濃度范圍具有良好線性。

    圖1 金剛烷胺試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

    3.2基質(zhì)干擾測試

    分析PBS緩沖液、雞肉樣品處理液2種基質(zhì)對繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響,將金剛烷胺分別溶于2種基質(zhì)中,配制成濃度為0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 μg/L標(biāo)準(zhǔn)液,按照金剛烷胺試劑盒的操作方法測定,繪制曲線進(jìn)行分析,結(jié)果見圖2。

    圖2 不同基質(zhì)對金剛烷胺-Kit影響

    圖2顯示,不同基質(zhì)的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品OD450nm值不同。雞肉處理液測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:y=-2.2322x+0.7257,相關(guān)系數(shù)R2為0.9909,IC50濃度值為2.2 μg/L,表明盡管不同基質(zhì)對標(biāo)準(zhǔn)品的OD450nm值有一定影響,但其IC50變化差異不大,對金剛烷胺試劑盒的敏感性和檢測結(jié)果影響不大,上述樣品前處理方法可行。

    3.3樣品檢出限

    用本試劑盒檢測20份空白雞肉樣品,結(jié)果見表1。空白樣品的平均值()加3倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD),即為雞肉樣本的檢出限(LOD),LOD=+3SD。

    表1 檢出限結(jié)果

    由表1可得,檢測結(jié)果平均值為0.081 μg/kg,標(biāo)準(zhǔn)差為0.046,因此本試劑盒雞肉檢出限為0.22μg/kg??紤]到實(shí)際檢測工作中的需要和操作方面的誤差,最終確定本試劑盒對雞肉的檢出限為0.25 μg/kg。

    3.4準(zhǔn)確度和精密度測試

    準(zhǔn)確度和精密度分別以回收率和變異系數(shù)表示。分別在陰性雞肉中添加不同濃度的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品,每個(gè)濃度添加5份樣品,共用3個(gè)批次試劑盒進(jìn)行檢測,計(jì)算樣品回收率和變異系數(shù),以評價(jià)試劑盒的準(zhǔn)確度和精密度,結(jié)果見表2。

    表2 準(zhǔn)確度和精密度測定結(jié)果

    結(jié)果顯示,回收率范圍為76.0%-109.0%,批內(nèi)變異系數(shù)范圍為3.9%-11.8%,批間變異系數(shù)范圍為9.1%-11.2%,均未超過15%,表明金剛烷胺試劑盒具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

    3.5實(shí)際樣品檢測驗(yàn)證結(jié)果

    用ELISA試劑盒法和儀器法分別檢測10份雞肉盲樣,比較測定結(jié)果。LC-MS方法參照DB 21/ 2394-2014《雞肝和雞肉中金剛烷胺、金剛乙胺的檢測超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》進(jìn)行,方法對雞肉中金剛烷胺的檢測限為0.5 μg/kg。以試劑盒檢測限作為陰陽性判定值,小于試劑盒檢測限試劑盒檢測結(jié)果記為“-”,儀器結(jié)果記為“ND”,大于試劑盒檢測限以實(shí)際檢測值表示,結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,二者的符合率為100%。

    表3 ELISA法與儀器方法比較結(jié)果

    4 討論

    國家對食品安全問題越來越重視,因此ELISA檢測技術(shù)在農(nóng)藥、獸藥殘留、生物毒素、毒品及真菌毒素等檢測領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛,同時(shí),對ELISA試劑盒的靈敏度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性等技術(shù)指標(biāo)也提出了更高的要求。

    基質(zhì)效應(yīng)可能抑制免疫結(jié)合反應(yīng),使競爭效率下降,從而導(dǎo)致曲線異常,斜率減小,IC50增大,靈敏度下降。本試劑盒對PBS緩沖液、雞肉樣品處理液2種基質(zhì)所測標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50變化不大,說明本試劑盒所采用的樣品處理方法可行。

    5 結(jié)論

    本研究研制的雞肉中金剛烷胺殘留檢測ELISA試劑盒檢出限為0.25 μg/kg,且性能良好,可用于雞肉中金剛烷胺殘留的定性或半定量檢測。

    [1]胡巧茹,周長朋,張玉春,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定辣椒及辣椒制品中金剛烷胺殘留[J].分析測試學(xué)報(bào),2014,33(10):1184-1188.

    [2]蘇文清,蒙君麗.取代禁用漁藥的新藥介紹(三)[J].河北漁業(yè),2003,128(2):26-27.

    [3]張向榮.抗病毒藥物的應(yīng)用及其研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥,2001,5(4):254-255.

    [4]王新德.帕金森病治療進(jìn)展概況[J].現(xiàn)代康復(fù),2000,4(3):324-325.

    [5]姚亞妮,楊新玲.新型多巴胺受體激動(dòng)劑與帕金森?。跩].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2009,8(5):538-540.

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    [7]云環(huán),崔風(fēng)云,嚴(yán)華,等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中的利巴韋林和金剛烷胺[J].色譜,2013,31(8):724-728.

    [8]武潔,王大為,何志強(qiáng).LC-MS/MS法測定人血漿中的金剛烷胺濃度及其藥動(dòng)學(xué)[J].中國臨床藥學(xué)雜志,2008,17(2):109-111.

    [9]葛孝忠,應(yīng)黃慧,陳曉,等.金剛烷類藥物的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2004,34(11):583-586.

    [10]宮慧芝,計(jì)融,楊軍,等.伏馬菌素B1免疫學(xué)檢測方法的建立[J].中國公共衛(wèi)生,2006,22(7):840-842.

    [11]劉百紅,熊寧,王喜亮,等.直接競爭ELISA法快速檢測動(dòng)物源性食品中磺胺嘧啶殘留[J].中國獸藥雜志,2008,42(2):16-19.

    Development of an ELISA Kit for the Determination of Amantadine in Chicken Muscle

    Wu Xiaoping1,Wang Wenjun1,Liu Ying2*,Xing Weiwei1,Su Lifang1
    (1.Beijing WDWK Biotechnological Corporation Ltd,Beijing,100095;2.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau)

    [Objective]Development of direct ELISA kit for the determination of amantadine(AMT)in chicken muscle.[Method]Under the optimal condition,development of a direct ELISA based monoclonal antibody for the determination of AMT in chicken.[Result]Linear range of AMT ELISA kit was 0.5-40.5 ng/mL;regression equation:y=-2.0574x+0.4763(R2=0.9967),IC50=1.9 ng/mL.The limit of detection(LOD)of ELISA for DEX in chicken was 0.25 ng/g.The average recoveries of DEX from fortified samples by ELISA were in a range of 76.0%-109.0%and inter-and intra-coefficients of variation(CVs)was less than 15%.[Conclusion]AMT ELISA kit established in this study was rapid,sensitive and stable,which is good enough for the qualitative or half-quantitative determination of AMT in chicken muscle.

    Amantadine;ELISA Kit;Chicken Muscle

    R446.61

    E-mail:wuxiaoping@wdwkbio.com;*通訊作者E-mail:liuying@bjciq.gov.cn.

    國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013IK306)

    2015-06-09

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