延長不同實驗步驟溫育時間對HBsAg酶免結(jié)果的影響

嚴鳳好 鐘展華 曾少麗 陳媛

(惠州市中心血站 檢驗科 廣東 惠州 516003)

ELISA 測定中影響結(jié)果的因素較多，其中溫育時間是影響測定結(jié)果的最關(guān)鍵因素，本研究對加酶前、加酶后、顯色等步驟的溫育時間進行對比分析，旨在探討ELISA 法檢測不同強弱程度HBsAg 陽性標本的部分影響因素。

1 材料與方法

1.1 材料 陽性對照、陰性對照(試劑盒自帶)，0.5 IU/ml質(zhì)控血清(康徹思坦生物有限公司提供)，HBsAg 陽性標本36 份，其中HBsAg 弱陽性標本12 份、HBsAg 中陽性標本12 份、HBsAg 強陽性標本12份，HBsAg 陰性標本32 份(均來自本站自愿無償獻血者，并經(jīng)過新創(chuàng)公司和梅里埃公司試劑檢測)。

1.2 試劑與儀器 HBsAg 檢測試劑盒(上海梅里埃生物工程有限公司生產(chǎn))，STAR 全自動加樣儀(瑞士HAMILTON)，F(xiàn)AME 全自動酶免分析儀(瑞士HAMILTON)，340RT 酶標儀(瑞士ANTHON)。

1.3 實驗方法

1.3.1 對照實驗 嚴格按照試劑說明書操作，實驗步驟:①加稀釋液25 μl，加標本或陰陽對照及質(zhì)控品75 μl。②37 ℃溫育60 min。③加酶標記物50 μl。④37 ℃溫育30 min。⑤洗板5 次，加顯色劑100 μl，室溫(25 ℃)溫育30 min。⑥加終止液，酶標儀讀數(shù)。

1.3.2 實驗Ⅰ 加酶前溫育時間對實驗結(jié)果的影響:其他步驟不變，第②步溫育時間分別延長至75 min(實驗A)和90 min(實驗B)。

1.3.3 實驗Ⅱ 加酶后溫育時間對實驗結(jié)果的影響:其他步驟不變，第④步溫育時間分別延長至40 min(實驗C)和45 min(實驗D)。

1.3.4 實驗Ⅲ 顯色時間對實驗結(jié)果的影響:其他步驟不變，第⑤步溫育時間分別延長至40 min(實驗E)和45 min(實驗F)。

1.4 統(tǒng)計學方法 根據(jù)所得數(shù)據(jù)的S/CO 值，采用SPSS 17.0 軟件，按α =0.05 檢驗水準進行方差分析、F 檢驗和配對t 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 實驗Ⅰ結(jié)果 延長加酶前溫育時間對強陽性和弱陽性標本影響具有統(tǒng)計學意義，強陽性標本吸光度明顯下降，弱陽性明顯加強，并與延長的時間密切相關(guān)。

2.2 實驗Ⅱ結(jié)果 延長加酶后溫育時間對各標本吸光度(陰性除外)影響最明顯。

2.3 實驗Ⅲ結(jié)果 延長顯色時間對實驗結(jié)果的影響差異無統(tǒng)計學意義。

2.4 陰性標本結(jié)果 延長各反應(yīng)步驟溫育時間對HBsAg 陰性標本吸光度影響差異均無統(tǒng)計學意義。各實驗結(jié)果見表1、2。

表1 延長不同實驗步驟溫育時間對HBsAg 酶免實驗S/CO 值的影響(±s)

表1 延長不同實驗步驟溫育時間對HBsAg 酶免實驗S/CO 值的影響(±s)

標本 對照 實驗A 實驗B 實驗C 實驗D 實驗E 實驗F陰性 0.20 ±0.03 0.20 ±0.04 0.23 ±0.01 0.19 ±0.02 0.22 ±0.03 0.19 ±0.02 0.23 ±0.03強陽性 76.68 ±0.69 69.95 ±1.29 62.40 ±1.17 71.15 ±0.62 66.15 ±1.00 76.45 ±0.68 76.05 ±1.27中陽性 7.31 ±0.10 7.30 ±0.19 7.33 ±0.17 7.52 ±0.16 7.73 ±0.12 7.17 ±0.04 7.28 ±0.09弱陽性 1.61 ±0.04 1.71 ±0.12 1.76 ±0.10 1.83 ±0.05 1.9 1 ±0.07 1.61 ±0.06 1.60 ±0.06

表2 各實驗組與對照組結(jié)果比較

3 討論

酶聯(lián)免疫吸附實驗屬于固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相載體的表面發(fā)生，但標本中的抗體與固相抗原結(jié)合的機會并不均等，在最貼近孔壁的一層溶液中的才直接與抗原接觸。該反應(yīng)是一個逐漸平衡的過程，需要經(jīng)過擴散才能達到反應(yīng)的終點，要保證足夠的溫育時間，才能使產(chǎn)物生成達到頂峰。然而，是不是延長任何一個步驟的時間獲得的效果是一樣的，筆者通過實驗發(fā)現(xiàn)并非如此。

從本實驗可以看出，延長加酶前溫育時間對強陽性和弱陽性標本影響顯著，強陽性標本隨溫育時間延長吸光度明顯下降，弱陽性卻明顯加強，兩者均與延長的時間密切相關(guān)。因為ELISA 方法檢測HBsAg 是一種雙抗體夾心法，待測抗原既要與包被抗－HBs 結(jié)合，又要與酶標抗體(HRP－HBs)作用，反應(yīng)過程中酶標抗體與包被抗體共同競爭標本的HBsAg。當HBsAg濃度在一定低值范圍時，HBsAg 易受試劑中的酶標抗體(HRP－HBs)飽和而被洗脫掉，降低了靈敏度。而對于強陽性標本，標本中含有過量的HBsAg，由于“鉤狀”效應(yīng)未能完全消除［1］，因此吸光度會反而降低，所以延長加酶前和加酶后溫育時間其值都下降，并與時間成反比。通過實驗我們發(fā)現(xiàn)延長加酶后的溫育時間對各標本吸光度(陰性除外)影響最顯著，這點與相關(guān)報道［2］一致，因此對于弱陽性標本，我們可以適當延長該步驟的溫育時間以防止假陰性結(jié)果出現(xiàn)。但延長顯色時間對實驗結(jié)果影響并不明顯，應(yīng)該是試劑盒在設(shè)計時已充分考慮到包被的抗體全部被抗原結(jié)合后所需的反應(yīng)時間。此外，對于HBsAg 陰性標本，延長各反應(yīng)步驟溫育時間對其結(jié)果影響均無統(tǒng)計學意義，也與有關(guān)文獻報道［3－4］相吻合，表明適當延長溫育時間不會造成假陽性結(jié)果。

HBsAg 檢測作為判斷乙肝病毒感染的指標，ELISA 以其操作簡單、快速、便于大批量樣本檢測等優(yōu)勢成為首選方法。盡管市面上可供選擇的試劑盒很多，但目前沒有哪種可以做到100%準確，有的靈敏度高，有的特異性好，因此，在選擇最佳試劑的同時，根據(jù)自身的實驗條件，適當改良操作步驟，保障檢測結(jié)果的準確性。ELISA 是根據(jù)著色深淺(吸光度值)判定待測抗原抗體的有無及含量，反應(yīng)時間是影響實驗靈敏度和準確性的關(guān)鍵因素，尤其是對于弱陽性標本［5］，足夠的溫育時間是防止假陰性出現(xiàn)的重要保證，選擇正確的實驗步驟適當延長溫育時間可提高ELISA 實驗結(jié)果的準確性和弱陽性標本的檢出率。

［1］吳肖仙，馮淦清.影響ELISA 檢測HBsAg 結(jié)果的常見因素［J］.中國藥物經(jīng)濟學，2013，1(1):0331－0332.

［2］趙飛雪.Microlab FAME 全自動酶免分析儀檢測的影響因素及質(zhì)量控制［J］.檢驗醫(yī)學與臨床，2012，9(13):1677－1678.

［3］帥敏，張玲，鄧曉琴，等.延長實驗溫育時間對FAME 全自動酶免分析結(jié)果的影響［J］.臨床輸血與檢驗，2008，10(1):28－30.

［4］陳宇.孵育時間對ELISA 檢測HBsAg 和抗－HCV 結(jié)果的影響［J］.醫(yī)藥前沿，2012，12(35):395－396.

［5］李靜，劉亞軍，趙晶，等.室溫對ELISA 定性測定HBsAg 檢測能力的影響［J］.臨床輸血與檢驗，2011，13(4):338－340.