固相萃取-LC-MS/MS同時(shí)測定牛奶中7種β2-受體激動(dòng)劑

馬立利，劉艷，賈麗，馮月超，張春梅，范筱京

（北京市理化分析測試中心，北京市食品安全分析測試工程技術(shù)研究中心，北京100089）

固相萃取-LC-MS/MS同時(shí)測定牛奶中7種β2-受體激動(dòng)劑

馬立利，劉艷*，賈麗，馮月超，張春梅，范筱京

（北京市理化分析測試中心，北京市食品安全分析測試工程技術(shù)研究中心，北京100089）

建立了牛奶中7種β2-受體激動(dòng)劑殘留量超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法。牛奶樣品經(jīng)40%甲醇溶液提取、乙酸鋅溶液蛋白沉淀、HLB固相萃取柱凈化后，以C18為分析色譜柱，甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫分離，采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式測定。結(jié)果表明，7種β2-受體激動(dòng)劑在0.04 μg/kg～4 μg/kg的濃度范圍內(nèi)呈線性，其相關(guān)系數(shù)r2大于0.998，定量限在0.01 μg/kg～0.04 μg/kg，加標(biāo)回收率為66.8%～99.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）范圍為2.0%～15.8%。本方法靈敏度高，準(zhǔn)確度好，對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了測試分析，均獲得了滿意的結(jié)果。

β2-受體激動(dòng)劑；牛奶；超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜

β2-受體激動(dòng)劑是一類化學(xué)合成的苯乙醇胺類衍生物，它們的結(jié)構(gòu)跟天然分泌的多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素的結(jié)構(gòu)相似。1988年，β2-受體激動(dòng)劑被批準(zhǔn)用于醫(yī)療和獸醫(yī)治療，主要用于防治哮喘、支氣管痙攣等疾?。?］。這類物質(zhì)能夠促進(jìn)蛋白沉淀［2］，具有營養(yǎng)重新分配和提高瘦肉率的作用，被廣泛用做食品動(dòng)物生產(chǎn)中的促生長添加劑［3-5］。然而，人體累計(jì)攝入此類藥物劑量超過一定值或食入高殘留量的內(nèi)臟組織后，易出現(xiàn)毒副作用，如肌肉震顫、劇烈腹痛、心跳和呼吸加快等，對(duì)人體危害巨大［6］。因此，中國和歐盟都規(guī)定所有的β2-受體激動(dòng)劑在動(dòng)物飼養(yǎng)過程中嚴(yán)禁使用［7］。

農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定在所有食用動(dòng)物的所有可食組織中不得檢出此類藥物。歐盟、美國、日本等發(fā)達(dá)國家對(duì)動(dòng)物性食品中克倫特羅和萊克多巴胺殘留制定了嚴(yán)格的限量要求，如歐盟規(guī)定牛奶中克倫特羅殘留量不得超過0.05 μg/kg。我們國家嚴(yán)格禁止將該類藥物給動(dòng)物使用，并要求動(dòng)物性食品中不得檢出［7-8］。

β2-受體激動(dòng)劑在動(dòng)物源食品中檢測方法較多。目前，國內(nèi)外報(bào)道的確證方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/ MS）等［9］。GC-MS法通常需要?；?、硼化，或三甲基硅烷化等復(fù)雜的衍生步驟，并且目前還未有一種衍生化試劑對(duì)所有的β2-受體激動(dòng)劑有效；在衍生化過程中，還會(huì)產(chǎn)生其他的副產(chǎn)物，對(duì)目標(biāo)物的定量分析有一定干擾［10］。而LC-MS/MS檢出限較低，靈敏度較高，可以準(zhǔn)確定性，現(xiàn)在已成為檢測此類物質(zhì)的首選［11］。本文通過簡化前處理步驟，結(jié)合UPLC-MS/MS，建立了牛奶中7種β2-受體激動(dòng)劑進(jìn)行的檢測方法，方法具有簡單、高通量的特點(diǎn)，滿足殘留分析的要求。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

UPLC-MS/MS，配備有ACQUITY超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀：Waters公司；HY-5回旋式振蕩器：江蘇金壇市宏華儀器廠；渦旋儀：江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；Elix 10 Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；固相萃取裝置：美國Agilent公司；高速冷凍離心機(jī)（Hitachi，CR22GⅢ）；恒溫水浴氮吹儀，包括N-EVAPTM112氮?dú)庹舭l(fā)儀、OA-SYSTM加熱裝置：Organomation Associates公司；ACQUITY UPLCBEHC18色譜柱（2.1×50mm，1.7μm，Waters公司）；HLB固相萃取?。╓aters Oasis，500mg/6 mL）；0.22 μm微孔濾膜：天津津騰科技有限公司。

溴布特羅（Brombuterol）、富馬酸福莫特羅（Formoterol fumarate dihydrate）、馬賁特羅（Mapenterol）、鹽酸馬布特羅（Mabuterol hydrochloride）、鹽酸萊克多巴胺（Ractopamine hydrochloride）、鹽酸克倫特羅（Clenbuterol hydrochloride）、鹽酸妥布特羅（Tulobuterol hydrochloride）標(biāo)準(zhǔn)品（非鹽形式結(jié)構(gòu)見圖1）購于Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸（色譜純，美國Fisher公司）；乙酸鋅、亞鐵氰化鉀（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2樣品處理

1.2.1樣品提取

圖1　β2-受體激動(dòng)劑的結(jié)構(gòu)式Fig.1Chemical structures of β2-agonists

準(zhǔn)確稱取5 g牛奶樣品于50 mL塑料離心管中，加入15 mL 40%甲醇溶液，渦旋1 min，振蕩提取30 min。加0.5 mL乙酸鋅溶液（21.6 g/100 mL），渦旋1 min，10 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移至另一離心管中，再加15 mL 40%甲醇溶液溶解殘?jiān)?，渦旋1 min，振蕩提取20 min，10 000 r/min離心10 min。合并提取液，待凈化。

1.2.2樣品凈化

將HLB固相萃取小柱放入固相萃取裝置的指定位置，依次用6mL甲醇、6mL水活化。取提取液全部過柱，用3 mL 5%甲醇溶液淋洗，6 mL甲醇洗脫至10 mL離心管中。在氮吹濃縮裝置上于50℃吹干，用甲醇-0.1%甲酸溶液（體積比為1∶9）定容至1mL，過0.22μm微孔濾膜后待測。

1.3儀器分析條件

1.3.1液相色譜條件

柱溫：30℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液；二元梯度分離，梯度順序：0 min～5min，95%～70%B；5 min～9 min，70%～10%B；9min～10min，10%～95%B；10min～12 min，95%B。

1.3.2質(zhì)譜條件

電噴霧電離（ESI+）離子源；源溫為150℃；毛細(xì)管電壓3.2 kV；脫溶劑溫度500℃；脫溶劑氣（氮?dú)猓┝髁繛?00 L/Hr。7種目標(biāo)物的采集參數(shù)列于表1。

表1　β2-受體激動(dòng)劑的質(zhì)譜采集條件Table 1Optimization conditions of β2-agonists in mass spectrometric analysis

續(xù)表1β2-受體激動(dòng)劑的質(zhì)譜采集條件Continue table 1Optimization conditions of β2-agonists in mass spectrometric analysis

2結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜與色譜條件的優(yōu)化

2.1.1液相分離條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了不同溶劑的分離效果，包括甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨、甲醇-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸7種流動(dòng)相對(duì)分析物的分離度和響應(yīng)值的影響。最終確認(rèn)甲醇-0.1%甲酸體系具有比較理想的分離度和響應(yīng)值。

考察了不同的定容溶劑：甲醇-0.1%甲酸（10∶90）、甲醇-水（10∶90）、甲醇。其中甲醇-水中目標(biāo)物的響應(yīng)值與甲醇-0.1%甲酸無明顯區(qū)別，但是后者的峰形比前者更對(duì)稱；選用甲醇為溶劑時(shí)，響應(yīng)值較低。因此，最終選擇甲醇-0.1%甲酸（10∶90）為定容溶劑，使目標(biāo)具有良好的響應(yīng)值和峰形，具體色譜圖如圖2所示。

圖2　7種β2-受體激動(dòng)劑的色譜圖Fig.2Chromatography of β2-agonists

2.1.2質(zhì)譜條件的確定

由于所購標(biāo)準(zhǔn)品為馬布特羅、萊克多巴胺、克倫特羅、妥布特羅幾種受體激動(dòng)劑的鹽酸鹽形式，調(diào)諧時(shí)，母離子應(yīng)為［M-HCl+H］+。富馬酸福莫特羅為富馬酸鹽，母離子為［1/2［M-fumaric-2H2O］+H］+。

2.2提取與凈化條件的優(yōu)化

2.2.1提取條件的優(yōu)化

提取溶劑對(duì)提取效果有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)中，準(zhǔn)確稱取5 g牛奶樣品，加標(biāo)水平為1 μg/kg，分別考察10%、20%、30%、40%甲醇溶液提取效率，見圖3。

采用40%甲醇溶液提取時(shí)6種分析物的回收率較其他3種溶劑高；妥布特羅回收率較低。加入0.5 mL乙酸鋅溶液沉淀，10%甲醇溶液提取離心后有少量蛋白漂浮，甲醇含量越小，沉淀效果越差。定容過膜后，40%甲醇溶液提取的顏色最淺，其他呈淡黃色。因此，綜合考慮，選用40%甲醇溶液作為提取溶劑。

2.2.2沉淀溶劑及體積的優(yōu)化

當(dāng)選用40%甲醇溶液提取，經(jīng)10 000 r/min離心10 min后，體系中仍有大量蛋白質(zhì)。考慮到乙酸鋅和亞鐵氰化鉀具有沉淀蛋白的作用［12］，本實(shí)驗(yàn)分別考察了不同體積的乙酸鋅溶液（21.6 g/100 mL）、亞鐵氰化鉀溶液（10.6 g/100 mL）的沉淀效果：0.5、1.0 mL和2.0 mL乙酸鋅溶液、0.5、1.0 mL和2.0 mL亞鐵氰化鉀溶液，以及1.0 mL乙酸鋅溶液和1.0 mL亞鐵氰化鉀溶液的混合溶液被考察。結(jié)果表明，3種只加亞鐵氰化鉀溶液方式，樣品處理液仍然十分渾濁，蛋白沉淀效果較差；而加入乙酸鋅溶液效果良好，加入0.5 mL就能達(dá)到要求。因此，本實(shí)驗(yàn)采用0.5 mL乙酸鋅溶液沉淀體系中的蛋白質(zhì)。

2.3分析方法的評(píng)價(jià)

2.3.1基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)是樣品中被分析物以外的組分，常對(duì)目標(biāo)物的分析有顯著干擾，并影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)。串聯(lián)質(zhì)譜以特異性強(qiáng)著稱，但越來越多的數(shù)據(jù)表明質(zhì)譜檢測同樣需要注意避免基質(zhì)效應(yīng)。

基質(zhì)效應(yīng)可影響檢出限（LOD）、定量下限（LOQ）、線性、準(zhǔn)確度和精密度。Matuszewski等［13］首次提出可以對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)度進(jìn)行定量的評(píng)價(jià)方法，分別測定提取后添加目標(biāo)物與流動(dòng)相中添加同樣濃度目標(biāo)物的離子響應(yīng)強(qiáng)度，計(jì)算二者相對(duì)比值來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。若比值小于1.0，說明基質(zhì)的存在對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)產(chǎn)生了抑制作用；若大于1.0，說明基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)產(chǎn)生增強(qiáng)作用；若等于1.0，說明不存在基質(zhì)效應(yīng)，但在實(shí)際中，很難得到這樣的結(jié)果，一般相對(duì)比值在0.85～1.15之間則認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)不明顯［14-15］。

參照Du等［3］對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)，利用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值，評(píng)價(jià)本方法的基質(zhì)效應(yīng)。7種分析物的斜率之比為0.836～1.112（見表2），除馬賁特羅（0.836）外，本方法對(duì)對(duì)其他6種β2-受體激動(dòng)劑基質(zhì)效應(yīng)不明顯；而牛奶基質(zhì)對(duì)馬賁特羅的響應(yīng)有一定的抑制作用，由于差別不是很大，綜合其他目標(biāo)物的結(jié)果，7種待測物利用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

表2　基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較Table 2Comparison of matrix-matched calibration and solvent calibration

2.3.2方法的定量限及回收率

方法的LOQ按照實(shí)際檢測的樣品峰高與噪音的峰高比S/N>10計(jì)算。并在最佳提取條件和色譜條件下，考察了3個(gè)不同加標(biāo)濃度（0.04、0.2、2 μg/kg）牛奶樣品的回收率。方法的LOQ、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表3。

2.4樣品分析

將市場上購買的10份牛奶樣品，在最優(yōu)提取條件下進(jìn)行處理，并通過超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，所有牛奶樣品均未檢出目標(biāo)物。

表3　β2-受體激動(dòng)劑的定量限、3個(gè)添加水平的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3LOQ，recoveries and RSD for target compounds from milk in three spiked levels

3結(jié)論

本研究建立了牛奶中7種β2-受體激動(dòng)劑殘留的固相萃取-超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。采用40%甲醇溶液提取，乙酸鋅溶液沉淀蛋白，HLB固相萃取柱凈化。分析過程中只用了甲醇和甲酸兩種有機(jī)溶劑，具有綠色環(huán)保、處理簡單、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足牛奶中β2-受體激動(dòng)劑殘留快速檢測的特點(diǎn)。

［1］Ramos F J D.β-Agonist extraction procedures for chromatographic analysis［J］.J Chromatogr A，2000，880：69-83

［2］Juan C，Igualada C，Moragues F，et al.Development and validation of a liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the analysis of β-agonists in animal feed and drinking water［J］.J Chromatogr A，2010，1217：6061-6068

［3］Du X D，Wu Y L，Yang H J，et al.Simultaneous determination of 10β2-agonists in swine urine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry and multi-walled carbon nanotubes as a reversed dispersive solid phase extraction sorbent［J］.J Chromatogr A，2012，1260：25-32

［4］劉敏，劉戎，王立琦，等.豬肝中β-受體激動(dòng)劑多殘留的樣品前處理方法比較及同時(shí)檢測［J］.分析測試學(xué)報(bào)，2012，31（3）：290-295

［5］金玉娥，郭德華，鄭燁，等.液質(zhì)聯(lián)用儀測定動(dòng)物源性食品中11種β2-受體激動(dòng)劑的研究［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2007，28（4）：193-201

［6］白凌，陳大舟，李蕾.液相色譜-質(zhì)譜法檢測肝臟中5種β-受體激動(dòng)劑［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2008，29（1）：10-12

［7］Li C，Wu Y L，Yang T，et al.Simultaneous determination of clenbuterol，salbutamol and ractopamine in milk by reversed-phase liquid chromatography tandem mass spectrometry with isotope dilution［J］.J Chromatogr A，2010，1217：7873-7877

［8］沈建忠，江海洋.畜產(chǎn)品中β-受體激動(dòng)劑殘留及其危害［J］.中國動(dòng)物檢疫，2011，28（6）：27-28

［9］孫雷，張?bào)P，朱永林，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測動(dòng)物源性食品中殘留的9種β-受體激動(dòng)劑［J］.色譜，2008，26（6）：709-713

［10］Lee H B，Sarafin K，Peart T E.Determination of β-blockers and β2-agonists in sewage by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2007，1148：158-167

［11］李瑩瑩，宋永青，郭文萍，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法同時(shí)測定豬肉中7種β-受體激動(dòng)劑殘留量［J］.肉類研究，2012，26（5）：25-29

［12］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 21703-2010乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的測定［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010：1-4

［13］Matuszew S K，Constanzer M L，Chavez-eng C M.Strategies for the assessment of matrix effect inquantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS［J］.Anal Chem，2003（75）：3019-3030

［14］王立琦，曾振靈，束建花，等.液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測定豬組織中β-興奮劑殘留的基質(zhì)效應(yīng)［J］.分析化學(xué)研究簡報(bào)，2012，40（9）：1445-1449

［15］王立琦，賀利民，曾振靈，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測獸藥殘留中的基質(zhì)效應(yīng)研究進(jìn)展［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2011，32（6）：321-332

Solid Phase Extraction Coupled with Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry for the Determination of 7 β2-agonists in Milk

MA Li-li，LIU Yan*，JIA Li，F(xiàn)ENG Yue-chao，ZHANG Chun-mei，F(xiàn)AN Xiao-jing
（Beijing Center for Physical and Chemical Analysis，Beijing Engineering Research Center of Food Safety Analysis，Beijing 100089，China）

A simple and inexpensive pretreatment procedure was developed for 7 β2-agonists（brombuterol，formoterol，mapenterol，mabuterol，ractopamine，clenbuterol，tulobuterol）in milk.The samples were extracted with 40%methanol in water，and then Oasis HLB solid phase extraction（SPE）cartridges were used for cleanup.The analytes were quantified by ultra performance liquid chromatography coupled with electrospray ionisation tandem mass spectrometry（UPLC-ESI-MS/MS）operating in positive multiple-reaction mode（MRM）.Competent linearity was found for all target compounds with linear regression coefficients（R2）higher than 0.998.The limit of quantification ranged from 0.01 μg/kg to 0.04 μg/kg.Average recoveries spiked into raw milk were in the range from 66.8%to 99.2%with associated RSD values from 2.0%to 15.8%under the selected conditions.The method is rapid，cost-effective and can meet the requirements for identification and quantification of the β2-agonists in milk．

β2-agonists；milk；UPLC-MS/MS

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.022

2014-02-20

北京市優(yōu)秀人才計(jì)劃（No.2011D002022000005）；北京市科學(xué)技術(shù)研究院市級(jí)財(cái)政項(xiàng)目（PXM2014_178305_000008）

馬立利（1981—），女（漢），助理研究員，碩士，研究方向：食品分析與檢測技術(shù)。